專利名稱：一種生產(chǎn)普魯蘭的菌株與利用該菌株生產(chǎn)普魯蘭的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種生產(chǎn)普魯蘭的菌株與利用該菌株生產(chǎn)普魯蘭的方法，涉及利用糖代謝生產(chǎn)細(xì)胞外水溶性多糖，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
普魯蘭正式命名為短梗霉多糖(pullulan)又稱為茁霉多糖或普魯蘭，是出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)在培養(yǎng)過程中利用糖代謝產(chǎn)生的細(xì)胞外水溶性多糖。其分子是由麥芽三糖以α-1，6-糖苷鍵連接而成的直鏈多糖，分子中1，4鍵與1，6鍵比例為2∶1，聚合度為100～5000，分子量為(4～200)×104。由于這一獨特連接方式，短梗霉多糖具有極佳的粘彈性、乳化性、可塑性，無毒無害，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)。
短梗霉多糖膜具有玻璃紙樣光澤及透明度和強度，耐油、耐熱封，可食；它最特殊的性質(zhì)是比其他高分子膜的透氣性低，氧、氮、二氧化碳和香氣等氣體幾乎不能透過。短梗霉多糖膜作為食品保鮮膜廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜、雞蛋，特別是含油食品，如火腿、方便面、肉等。短梗霉多糖溶液中性，粘度受溫度、pH值影響小，有很好的耐鹽和耐酸性能，因此可用于高鹽食品和調(diào)味料的增稠，如醬油、蝦醬，增稠效果明顯優(yōu)于刺槐豆膠、卡拉膠等其他多糖。短梗霉多糖在動物消化器官內(nèi)酶作用下消化得很慢，利用它的低消化性，可制低熱量食品和飲料。最近又發(fā)現(xiàn)短梗霉多糖具有使雙歧桿菌增殖、治療便秘和抑制腫瘤的作用。
目前只有日本林原公司有少量生產(chǎn)，價格昂貴。制約短梗霉多糖大量生產(chǎn)的首要原因是在發(fā)酵過程中，出芽短梗霉會分泌出與黑色素(melanin pigmentation)類似的黑色或墨綠色物質(zhì)，這種物質(zhì)牢固地粘附在短梗霉多糖上，很難用一般方法除去，可以用Sevag分餾法除去，但要完全除去黑色素，必須重復(fù)多次，而每次分餾會損失大約15％的多糖，最終得率很低，所以必須篩選低色素菌株，以克服黑色素對多糖產(chǎn)品的影響。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株出芽短梗霉變異株CGMCC No.1234，和利用該菌株生產(chǎn)普魯蘭的方法，其中包括發(fā)酵工藝和發(fā)酵液后處理工藝。普魯蘭是具有良好成膜性和香味包裹性能的多糖類膠體，是爽口片生產(chǎn)的最好材料。
本發(fā)明的技術(shù)方案是所述出芽短梗霉變異株，其分類命名為出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)G-58，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.1234。利用該菌株生產(chǎn)普魯蘭的方法為A)發(fā)酵工藝菌種為CGMCC No.1234；種子培養(yǎng)基以g/L計蔗糖50，(NH4)2SO40.8，K2HPO44，MgSO40.2，NaCl0.2，酵母膏1.5，pH6；121℃，30min滅菌。
發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計蔗糖50-100，(NH4)2SO40.4-0.8，K2HPO44-8，MgSO40.4，NaCl 0.2，MnCl20.005，酵母膏0.3-0.5，pH6.0-7.0；121℃，30min滅菌。
種子培養(yǎng)條件取28℃培養(yǎng)4天的斜面菌種一環(huán)，接種于種子培養(yǎng)基，裝液量為在500mL三角瓶中裝100mL-120mL，28℃、200r/min搖瓶培養(yǎng)36小時即為種子液。
10升發(fā)酵罐培養(yǎng)條件10升發(fā)酵罐，裝液量6升，接種量2％；溫度28℃，罐壓0.5kg/cm2，攪拌速度200～600r/min，通氣量1.5～6L/min，發(fā)酵時間96小時。
1.5m3發(fā)酵罐培養(yǎng)條件1.5m3發(fā)酵罐，裝液量900升，接種量2％；溫度28℃，罐壓0.5kg/cm2，攪拌速度200～600r/min，通氣量1.5～6L/min，發(fā)酵時間96小時。
最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計為蔗糖50，(NH4)2SO40.6，K2HPO46，MgSO40.4，NaCl 0.2，MnCl20.005，酵母膏0.4，pH6.5；121℃，30min滅菌；最佳的10升或1.5m3發(fā)酵罐培養(yǎng)條件攪拌速度400r/min，通氣量3L/min，發(fā)酵時間96小時。
B)發(fā)酵液后處理工藝發(fā)酵液經(jīng)過濾I、離心I、熱處理、離心II、脫色、離心III、工業(yè)酒精沉淀、離心IV、脫鹽、過濾II制得液體普魯蘭產(chǎn)品；或繼續(xù)干燥制得固體普魯蘭產(chǎn)品。
具體的操作為過濾I8層紗布抽濾，離心I3000r/min、30min，熱處理離心I之后的上清液用于熱處理，用NaHCO3和HCl調(diào)pH值，70℃、10min、pH7.0，離心II4000r/min、30min，
脫色活性炭脫色、活性炭用量為0.5％、15℃、pH7.0，離心III4000r/min、30min，工業(yè)酒精沉淀離心III的上清液加入2倍體積工業(yè)酒精、攪拌、4℃放置12h，離心IV2000r/min、15min，脫鹽離心IV的沉淀用65％的酒精洗滌3次，過濾II8層紗布抽濾，過濾II得到的沉淀溶于水，配制成固形物含量為20％的水溶液，蒸發(fā)將上述溶液蒸發(fā)至固形物含量60％-70％，即為液體普魯蘭產(chǎn)品；或噴霧干燥，制得固體普魯蘭產(chǎn)品。
分析方法發(fā)酵液顏色和吸光度測定采用721型分光光度計測定提取多糖后的溶液中的色素。蒸餾水為空白，波長掃描，波長調(diào)至最大透光率(654nm)，再用此波長測各發(fā)酵液4000r/min、30min離心去菌體后上清液吸光度。
生物量測定定量量取發(fā)酵液，4000r/min下離心30min，傾出上清液用于糖測定。沉淀的菌體用蒸餾水洗滌離心2次，于100℃下干燥至恒重，用稱重法測定生物量。
粗多糖測定離心上清液加入2倍無水乙醇，攪拌，4℃放置過液，使短梗霉多糖充分沉淀。沉淀液以4500r/min離心30min得短梗霉多糖沉淀，沉淀用95％酒精洗滌3次再依次用無水丙酮、無水乙醚洗滌，70℃干燥至恒重，即得短梗霉多糖粗品，稱重，計算產(chǎn)量。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明方法提供了一種自行誘變選育的生產(chǎn)普魯蘭的出芽短梗霉變異株CGMCC No.1 234，用該變異株進行發(fā)酵和發(fā)酵液后處理所得產(chǎn)品普魯蘭色澤淺，為淺黃或乳白色，多糖得率高，產(chǎn)品具有極佳的粘彈性、乳化性、可塑性、無毒無害，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)。所述發(fā)酵工藝發(fā)酵液色素含量低，可大大簡化后處理工藝，發(fā)酵液后處理工藝設(shè)計合理、操作簡單、成本低、得率高、脫色脫鹽效果好，水溶性好，產(chǎn)品質(zhì)量達到要求，為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)價格較低的普魯蘭提供了可能。
生物材料樣品保藏一種生產(chǎn)普魯蘭的菌株，該菌株為出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)G-58，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.1234，保藏日期為2004年10月19日。
具體實施例方式
實施例110升發(fā)酵罐培養(yǎng)菌種為CGMCC No.1234；種子培養(yǎng)基以g/L計蔗糖50，(NH4)2SO40.8，K2HPO44，MgSO40.2，NaCl0.2，酵母膏1.5；pH6；121℃，30min滅菌；發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計為蔗糖50，(NH4)2SO40.6，K2HPO46，MgSO40.4，NaCl 0.2，MnCl20.005，酵母膏0.4，pH6.5；121℃，30min滅菌；種子培養(yǎng)條件取28℃培養(yǎng)4天的斜面菌種一環(huán)，接種于種子培養(yǎng)基，裝液量為在500mL三角瓶中裝100mL-120mL，28℃、200r/min搖瓶培養(yǎng)36小時得到120mL種子液；10升發(fā)酵罐培養(yǎng)條件10升發(fā)酵罐，裝液量6升，接種量按2％計，正好是120mL種子液；溫度28℃，罐壓0.5kg/cm2，攪拌速度400r/min，通氣量3L/min，發(fā)酵時間96小時。多糖產(chǎn)量達到24.1g/L，糖轉(zhuǎn)化率達到48.2％。
實施例21.5m3發(fā)酵罐培養(yǎng)種子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)條件、發(fā)酵培養(yǎng)基同實施例1。
1.5m3發(fā)酵罐培養(yǎng)條件1.5m3發(fā)酵罐，裝液量900升，接種量按2％計，為18升種子液，溫度28℃，罐壓0.5kg/cm2，攪拌速度400r/min，通氣量3L/min，發(fā)酵時間96小時，多糖產(chǎn)量達到25.6g/L，糖轉(zhuǎn)化率達到51.2％。
實施例3以實施例1或?qū)嵤├?所得發(fā)酵液進行后處理，后處理條件為發(fā)酵液經(jīng)過濾I、離心I、熱處理、離心II、脫色、離心III、工業(yè)酒精沉淀、離心IV、脫鹽、過濾II制得液體普魯蘭產(chǎn)品；或繼續(xù)干燥制得固體普魯蘭產(chǎn)品。
具體的操作為過濾I8層紗布抽濾，離心I3000r/min、30min，熱處理離心I之后的上清液用于熱處理，用NaHCO3和HCl調(diào)pH值，70℃、10min、pH7.0，熱處理前，吸光度為0.295，熱處理后，吸光度為0.300；熱處理前，多糖含量為3 1.5g/L，熱處理后，多糖含量為29.8g/L，多糖得率為94.5％。
離心II4000r/min、30min，脫色活性炭脫色、活性炭用量為0.5％、15℃、pH7.0，脫色前，吸光度為0.300，脫色后，吸光度為0.265；脫色前，多糖含量為29.3g/L，脫色后，多糖含量為28.7g/L，多糖得率為98％。
離心III4000r/min、30min，工業(yè)酒精沉淀離心III的上清液加入2倍體積工業(yè)酒精、攪拌、4℃放置12h，離心IV2000r/min、15min，脫鹽離心IV的沉淀用65％的酒精洗滌3次，過濾II8層紗布抽濾，過濾II得到的沉淀溶于水，配制成固形物含量為20％的水溶液，蒸發(fā)將上述溶液蒸發(fā)至固形物含量60％-70％，即為液體普魯蘭產(chǎn)品；或噴霧干燥，制得固體普魯蘭產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)普魯蘭的菌株，其分類命名為出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)G-58，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.1234。
2.一種利用權(quán)利要求1所述的菌株生產(chǎn)普魯蘭的方法，其特征是A)發(fā)酵工藝菌種為CGMCC No.1234；種子培養(yǎng)基以g/L計蔗糖50，(NH4)2SO40.8，K2HPO44，MgSO40.2，NaCl0.2，酵母膏1.5，pH6；121℃，30min滅菌；發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計蔗糖50-100，(NH4)2SO40.4-0.8，K2HPO44-8，MgSO40.4，NaCl 0.2，MnCl20.005，酵母膏0.3-0.5，pH6.0-7.0；121℃，30min滅菌；種子培養(yǎng)條件取28℃培養(yǎng)4天的斜面菌種一環(huán)，接種于種子培養(yǎng)基，裝液量為在500mL三角瓶中裝100mL-120mL，28℃、200r/min搖瓶培養(yǎng)36小時即為種子液；10升發(fā)酵罐培養(yǎng)條件10升發(fā)酵罐，裝液量6升，接種量2％；溫度28℃，罐壓0.5kg/cm2，攪拌速度200～600r/min，通氣量1.5～6L/min，發(fā)酵時間96小時；1.5m3發(fā)酵罐培養(yǎng)條件1.5m3發(fā)酵罐，裝液量900升，接種量2％；溫度28℃，罐壓0.5kg/cm2，攪拌速度200～600r/min，通氣量1.5～6L/min，發(fā)酵時間96小時；B)發(fā)酵液后處理工藝發(fā)酵液經(jīng)過濾I、離心I、熱處理、離心II、脫色、離心III、工業(yè)酒精沉淀、離心IV、脫鹽、過濾II制得液體普魯蘭產(chǎn)品；或繼續(xù)干燥制得固體普魯蘭產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中的發(fā)酵工藝為發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計蔗糖50，(NH4)2SO40.6，K2HPO46，MgSO40.4，NaCl0.2，MnCl20.005，酵母膏0.4，pH6.5；121℃，30min滅菌；10升或1.5m3發(fā)酵罐培養(yǎng)條件攪拌速度400r/min，通氣量3L/min，發(fā)酵時間96小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中的發(fā)酵液后處理工藝為過濾I8層紗布抽濾，離心I3000r/min、30min，熱處理離心I之后的上清液用于熱處理，用NaHCO3和HCl調(diào)pH值，70℃、10min、pH7.0，離心II4000r/min、30min，脫色活性炭脫色、活性炭用量為0.5％、15℃、pH7.0，離心III4000r/min、30min，工業(yè)酒精沉淀離心III的上清液加入2倍體積工業(yè)酒精、攪拌、4℃放置12h，離心IV2000r/min、15min，脫鹽離心IV的沉淀用65％的酒精洗滌3次，過濾II8層紗布抽濾，過濾II得到的沉淀溶于水，配制成固形物含量為20％的水溶液，蒸發(fā)將上述溶液蒸發(fā)至固形物含量60％-70％，即為液體普魯蘭產(chǎn)品；或噴霧干燥，制得固體普魯蘭產(chǎn)品。
全文摘要
一種生產(chǎn)普魯蘭的菌株與利用該菌株生產(chǎn)普魯蘭的方法，涉及利用糖代謝生產(chǎn)細(xì)胞外水溶性多糖，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的菌株，其分類命名為出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)G－58，保藏編號為CGMCC No.1234；用該菌株經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)和發(fā)酵液后處理熱處理、脫色、沉淀、脫鹽、干燥等工藝生產(chǎn)普魯蘭。所得產(chǎn)品普魯蘭色澤淺，多糖得率高，具有極佳的粘彈性、乳化性、可塑性、無毒無害，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)。所述發(fā)酵工藝發(fā)酵液色素含量低，可大大簡化后處理工藝，發(fā)酵液后處理工藝設(shè)計合理、操作簡單、成本低、得率高、脫色脫鹽效果好，水溶性好，產(chǎn)品質(zhì)量達到要求，為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)價格較低的普魯蘭提供了可能。
文檔編號C12N1/14GK1609188SQ20041006576
公開日2005年4月27日 申請日期2004年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月16日
發(fā)明者童群義, 付湘晉, 于航 申請人:江南大學(xué)