專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)載脂蛋白e基因型的方法和試劑盒的制作方法
所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及檢測(cè)臨床血液樣品中載脂蛋白(ApoE)基因分型的方法及試劑盒，特別是涉及以反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)快速檢測(cè)ApoE基因型的方法及所使用的試劑盒。
背景技術(shù)：
人ApoE基因有三個(gè)等位基因，即ε2，ε3和ε4，共構(gòu)成6種不同的基因型3種純合子型(ε4/ε4、ε3/ε3和ε2/ε2)和3種雜合子型(ε3/ε4、ε2/ε3和ε2/ε4)。其等位基因頻率因不同的種族和地區(qū)存在差異，在一般人群中，ε2，ε3和ε4等位基因的頻率分別為8％，78％和4％。
目前已知，ApoEε4是早發(fā)性冠狀動(dòng)脈心臟病(coronary heart disease，CHD)發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，Meta分析表明，ApoEε4攜帶者比其他等位基因攜帶者患冠心病的危險(xiǎn)性顯著增加(Song Y，Stampfer MJ，Liu S，et al.Meta-analysisapolipoprotein E genotypes and risk for coronary heart disease.Ann Intern Med.2004，141(2)137-147.)。近年來(lái)大量的研究發(fā)現(xiàn)，ApoEε4與晚發(fā)性家族性Alzheimer病(LOAD)和散發(fā)性Alzheimer病(SAD)有關(guān)，而ApoEε2則有延遲癡呆發(fā)生的作用。目前科學(xué)家已公認(rèn)ApoEε4等位基因是Alzheimer病(AD)的易感因子，并且與散發(fā)性AD的發(fā)生密切相關(guān)(Yamagata K，et al.Highexpression of apolipoprotein E mRNA in the brains with sporadic Alzheimerpsdisease.Dement Geriatr Cogn Disord，2001，1257-62.)。因此，ApoE基因分型檢測(cè)對(duì)早期輔助診斷Alzheimer病具有重要的意義。結(jié)合臨床診斷，ApoEε4的檢測(cè)將使對(duì)Alzheimer病的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性高達(dá)94-98％(The Ronald and Nancy ReagenResearch Institute of the Alzheimer’s Association and the National Institute onAging Working Group.Neurobiol Aging.1998；19109-116)。此外，ApoE基因分型檢測(cè)還有助于臨床治療方案的選擇。臨床研究表明，攜帶或不攜帶ε4等位基因的AD患者使用乙酰膽堿酯酶抑制劑藥物的治療效果有很大不同(Lendon C L，etal.Exploring the etiology of Alzheimer′s disease using molecular biology，JAMA，1997，27825-831；Farlow M，et al.Differential qualitative responses torivastigmine in APOE epsilon4 carriers and noncarriers.Pharmacogenomics J.2004；4(5)332-5.)?？梢?jiàn)，ApoE等位基因多態(tài)性的檢測(cè)對(duì)深入研究高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化和AD的發(fā)病機(jī)理及治療策略，以及從人群中篩選這些疾病的易感個(gè)體均具有積極意義。
目前常用的基因分型方法包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、序列特異性寡核苷酸探針(PCR-SSOP)、序列特異性引物(PCR-SSP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)以及DNA序列測(cè)定等技術(shù)。這些方法都存在技術(shù)復(fù)雜、成本昂貴，效率低和分辨率不足等缺點(diǎn)。因此，本發(fā)明人試圖結(jié)合已知的點(diǎn)印跡雜交技術(shù)和過(guò)濾雜交方法，建立一種能夠在較短的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)和分析ApoE基因型的方法。
發(fā)明目的本發(fā)明涉及檢測(cè)個(gè)體血液樣品中載脂蛋白E(ApoE)基因型的方法及試劑盒，特別是涉及以反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)快速檢測(cè)ApoE基因型的方法及所使用的試劑盒。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)血液樣品中個(gè)體載脂蛋白E基因型的方法，該方法包括(1)提供待檢靶核酸樣品；(2)利用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增體系擴(kuò)增靶DNA片斷；(3)使被標(biāo)記的靶核酸與特異性寡核甘酸探針雜交；(4)檢測(cè)雜交結(jié)合物并借以判斷靶DNA的載脂蛋白E基因型，特征在于聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增體系中使用的正向和反向引物分別是5’-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3’(SEQ ID NO1)和5′-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ ID NO2)，并且雜交反應(yīng)中使用的寡核甘酸探針?lè)謩e是
(1)NH2-5’-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO3)；(2)NH2-5’-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO4)；(3)NH2-5’-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3’(SEQ ID NO5)；(4)NH2-5’-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3’(SEQ ID NO6)；(5)生物素-5’-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’-NH2(SEQ ID NO7)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的靶核酸樣品是得自被檢者血液白細(xì)胞的人基因組DNA樣品。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所說(shuō)的檢測(cè)是使用帶有多孔濾板和減壓抽吸部件的反向點(diǎn)印跡雜交裝置完成的。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的標(biāo)記分子是生物素。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的靶DNA的基因型包括3種純合子型(ε4/ε4、ε3/ε3和ε2/ε2)和3種雜合子型(ε3/ε4、ε2/ε3和ε2/ε4)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于檢測(cè)人個(gè)體載脂蛋白E基因型的的試劑盒，該試劑盒包括(1)核酸提取試劑；(2)聚合酶鏈反應(yīng)試劑；(3)雜交反應(yīng)試劑，特征在于聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增體系中的所使用的正向和反向引物分別是5’-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3’(SEQ ID NO1)和5′-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ ID NO2)，并且雜交反應(yīng)中使用的寡核甘酸探針?lè)謩e是(1)NH2-5’-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO3)；(2)NH2-5’-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO4)；(3)NH2-5’-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3’(SEQ ID NO5)；(4)NH2-5’-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3’(SEQ ID NO6)；(5)生物素-5’-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’-NH2(SEQ ID NO7)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的核酸提取試劑包括由DNA提取液和滅菌生理鹽水組成的提取待檢樣品DNA的抽提液。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的聚合酶鏈反應(yīng)試劑包括由含有脫氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、耐熱Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG酶)等組成的PCR反應(yīng)混合液。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的雜交反應(yīng)試劑包括雜交液I和II、溶液I、II、III和IV、膜條以及標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及檢測(cè)個(gè)體血液樣品中載脂蛋白(ApoE)基因型的方法及試劑盒，特別是涉及以反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)快速檢測(cè)ApoE基因型的方法及所使用的試劑盒。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)血液樣品中個(gè)體ApoE基因型的方法，該方法包括(1)提供待檢靶核酸樣品；(2)利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增體系擴(kuò)增靶DNA片斷；(3)使被標(biāo)記的靶核酸與特異性寡核甘酸探針雜交；(4)檢測(cè)雜交結(jié)合物并借以判斷靶DNA的基因型，特征在于所說(shuō)的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增體系中的所使用的正向和反向引物分別是5’-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3’(SEQ ID NO1)和5′-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ ID NO2)，并且雜交反應(yīng)中使用的寡核甘酸探針?lè)謩e是(1)NH2-5’-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO3)；(2)NH2-5’-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO4)；(3)NH2-5’-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3’(SEQ ID NO5)；(4)NH2-5’-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3’(SEQ ID NO6)；(5)生物素-5’-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’-NH2(SEQ IDNO7)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的DNA樣品是得自被檢者血液白細(xì)胞的人基因組DNA樣品。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所說(shuō)的檢測(cè)是使用帶有多孔濾板和減壓抽吸部件的反向點(diǎn)印跡雜交裝置完成的。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的標(biāo)記分子是生物素。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的靶DNA的基因型包括3種純合子型(ε4/ε4、ε3/ε3和ε2/ε2)和3種雜合子型(ε3/ε4、ε2/ε3和ε2/ε4)。
眾所周知，通常使用的點(diǎn)印跡雜交方法是將靶DNA固定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，使標(biāo)記的探針與待檢靶DNA接觸并雜交，顯色后判斷結(jié)果。這種方法每次雜交反應(yīng)只能檢測(cè)待檢DNA是否含有某一種探針的同源序列，即用于判斷一種基因型。如果某些基因座位有多個(gè)等位基因(如HLA-DRB位點(diǎn)或地中海貧血突變基因等)，用這種點(diǎn)雜交方法檢測(cè)就很繁雜，甚至很難完成。而反向斑點(diǎn)雜交方法則是先將針對(duì)各等位基因特異性的探針點(diǎn)到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，然后再將待測(cè)DNA樣品(一般是使用5’-端標(biāo)記有生物素等分子的引物PCR擴(kuò)增目的片斷后的產(chǎn)物)與之雜交，這樣待測(cè)樣本就會(huì)與具有同源序列的探針結(jié)合。經(jīng)洗滌去除未結(jié)合的DNA后，即可直接或間接地顯示出并檢測(cè)到代表雜交信號(hào)的生物素等標(biāo)記物。因此，使用該方法可一次同時(shí)檢測(cè)某一基因座位的大部分或全部等位基因。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，為了完成本發(fā)明的方法，首先常規(guī)制備待檢者的白細(xì)胞基因組DNA。該DNA樣品經(jīng)DNA提取液處理后離心收集上清液，并將該上清液用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。以如上得到的人基因組DNA為模板，并使用合成的正向和反向寡核苷酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。變性處理所得到的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物后，使之分別與足以揭示不同的載脂蛋白E等位基因的寡核苷酸探針雜交。最后，根據(jù)雜交產(chǎn)物染色后的顏色變化判斷載脂蛋白E的基因型。以下針對(duì)本發(fā)明方法的幾個(gè)主要步驟，分別詳細(xì)描述如下。
1、引物的設(shè)計(jì)和合成為了特異、高效地?cái)U(kuò)增待檢核酸樣品中的載脂蛋白E基因，我們從Gene Bank中調(diào)出ApoE基因DNA序列，針對(duì)包含編碼ApoE第112位和158位氨基酸的多態(tài)性位點(diǎn)序列，按照引物設(shè)計(jì)的一般性原則，采用美國(guó)Amplied Biosystem，Inc.的PrimerExpress2.0軟件分別設(shè)計(jì)并合成正向和反向引物5’-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3’(SEQ ID NO1)和生物素5′-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ ID NO2)。通過(guò)美國(guó)NIH網(wǎng)站上Blast程序進(jìn)行同源性比較(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)，保證引物設(shè)計(jì)的特異性。
2、探針的合成和標(biāo)記針對(duì)編碼ApoE蛋白第112和158位氨基酸相對(duì)應(yīng)的多態(tài)性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成分別命名為探針1，探針2，探針3和探針4的四條探針。此外，另設(shè)計(jì)一條用于控制顯色反應(yīng)的顯色反應(yīng)控制探針為探針5，借以控制顯色反應(yīng)作為對(duì)照。為了保證各探針均能在同一溫度下與特定的靶DNA成功地雜交，須將探針的Tm值和GC含量嚴(yán)格控制在特定范圍內(nèi)。合成的探針經(jīng)20％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并純化后，分別進(jìn)行NH2基團(tuán)標(biāo)記以用于繼后的雜交反應(yīng)(1)NH2-5’-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO3)；(2)NH2-5’-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO4)；(3)NH2-5’-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3’(SEQ ID NO5)；(4)NH2-5’-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3’(SEQ ID NO6)；(5)生物素-5’-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’-NH2(SEQ IDNO7)。
3、雜交載體的制備用作雜交載體的膜可以是由硝酸纖維素、尼龍或醋酸纖維素等材料制成的，大小約為3.2cm×2.5cm的多孔條。膜條使用前需用10％的EDC(N-乙基-N’-[二甲基氨丙基]-碳二亞胺，Sigama公司)溶液充分浸泡活化處理。新合成的探針(100pm/μl)經(jīng)稀釋后，按用每孔0.7μl在膜條的適當(dāng)位置上以固定格式點(diǎn)加。點(diǎn)樣后用NaOH溶液處理膜條并充分洗滌，然后保存于-20℃?zhèn)溆谩?br>
4、核酸的提取采用常規(guī)DNA提取液提取人個(gè)體血液樣品(白細(xì)胞)中的DNA。例如可以利用滲透作用裂解抗凝血液中的紅細(xì)胞，然后離心收集富含白細(xì)胞的沉淀。然后向其中加入常規(guī)DNA提取液，抽提血液白細(xì)胞的基因組DNA。所得到的DNA經(jīng)離心后收集上清液，將其作為核酸擴(kuò)增的模板。
5、核酸擴(kuò)增體系的優(yōu)化我們采取熱啟動(dòng)結(jié)合逐漸降低退火溫度的PCR方法，摸索出最佳的退火溫度，借以提高核酸擴(kuò)增的特異性和高效性。同時(shí)，使用dUTP-UNG酶處理待檢核酸，以有效地消除PCR產(chǎn)物的污染。特別是，我們對(duì)PCR擴(kuò)增中使用的引物和其濃度、以及Mg2+、模板、PCR佐劑(二甲基亞砜)等其他反應(yīng)物的濃度均作了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和最佳化。
6、反向斑點(diǎn)雜交體系的優(yōu)化反向斑點(diǎn)雜交的操作過(guò)程包括首先將如前制備的ApoE基因分型膜條固定在雜交儀上，然后在膜條的適當(dāng)加樣點(diǎn)加載經(jīng)變性處理的擴(kuò)增的樣品DNA。雜交反應(yīng)完成后，經(jīng)洗膜和顯色步驟以顯示雜交斑點(diǎn)的存在，并根據(jù)所使用的探針的不同來(lái)判斷各個(gè)體的ApoE基因型。
由圖3所示的檢測(cè)實(shí)例可以看出，如果探針2(SEQ ID NO4)、探針4(SEQ IDNO6)和顯色反應(yīng)控制探針5(SEQ ID NO7)顯色，可判定ApoE基因型為ε2/ε2；如果探針2(SEQ ID NO4)、探針3(SEQ ID NO5)和顯色反應(yīng)控制探針5(SEQ IDNO7)顯色，可判定ApoE基因型為ε3/ε3；如果探針1(SEQ ID NO3)、探針3(SEQ ID NO5)和顯色反應(yīng)控制探針5(SEQ ID NO7)顯色判定ApoE基因型為ε4/ε4；如果探針1(SEQ ID NO3)、探針2(SEQ ID NO4)、探針3(SEQ IDNO5)和顯色反應(yīng)控制探針5(SEQ ID NO7)顯色，可判定ApoE基因型為ε3/ε4；如果探針2(SEQ ID NO4)、探針3(SEQ ID NO5)、探針4(SEQ ID NO6)和顯色反應(yīng)控制探針5(SEQ ID NO7)顯色，可判定ApoE基因型為ε2/ε3；如果探針1(SEQ ID NO3)、探針2(SEQ ID NO4)、探針3(SEQ ID NO5)、探針4(SEQ ID NO6)和顯色反應(yīng)控制探針5(SEQ ID NO7)顯色，可判定ApoE基因型為ε2/ε4；如果只有顯色反應(yīng)控制探針5(SEQ ID NO7)顯色，其它探針不顯色則說(shuō)明PCR擴(kuò)增失敗(參見(jiàn)圖3)。
另外，本發(fā)明通過(guò)摸索不同的雜交溫度和探針濃度(例如，將雜交溫度設(shè)定在59℃，探針1-4和顯色反應(yīng)控制探針5的濃度分別定為12.5μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L和2.5μmol/L)，可使檢測(cè)的結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠，并具有更好的檢測(cè)穩(wěn)定性(可重復(fù)性)。
本發(fā)明中，由于發(fā)明人對(duì)靶DNA片斷的擴(kuò)增體系和雜交體系進(jìn)行了優(yōu)化，設(shè)計(jì)并合成了特異性強(qiáng)的探針和引物，同時(shí)檢測(cè)中使用了配備有多孔濾板和減壓抽吸部件的反向點(diǎn)印跡雜交裝置，所以保證了方法的快捷和檢測(cè)結(jié)果的可靠性。
如前所述，由于反向斑點(diǎn)雜交方法能夠同時(shí)檢測(cè)目的基因內(nèi)多個(gè)堿基的突變或多態(tài)性，所以在病原體及復(fù)雜遺傳性疾病的檢測(cè)中有著更為簡(jiǎn)便的優(yōu)越性。另一方面，由于ApoE在常見(jiàn)的心血管疾病(如CHD)以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如AD)中的重要作用，所以ApoE基因成為臨床檢驗(yàn)研究的熱點(diǎn)。本發(fā)明的ApoE等位基因檢測(cè)方法顯然可以為CHD、AD等疾病的診斷提供一種快速、簡(jiǎn)便、特異性和準(zhǔn)確性均較高的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手段。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于檢測(cè)人個(gè)體載脂蛋白E基因型的的試劑盒，該試劑盒包括(1)核酸提取試劑；(2)聚合酶鏈反應(yīng)試劑；和(3)雜交反應(yīng)試劑，特征在于所說(shuō)的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增體系中的所使用的正向和反向引物分別是5’-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3’(SEQ ID NO1)和5′-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ ID NO2)；并且雜交反應(yīng)中使用的寡核甘酸探針?lè)謩e是(1)NH2-5’-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO3)；(2)NH2-5’-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO4)；(3)NH2-5’-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3’(SEQ ID NO5)；(4)NH2-5’-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3’(SEQ ID NO6)；(5)生物素-5’-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’-NH2(SEQ IDNO7)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的核酸提取試劑包括由DNA提取液和滅菌生理鹽水組成的提取待檢樣品DNA的抽提液。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的聚合酶鏈反應(yīng)試劑由dNTPs(含dUTP)、耐熱Taq酶、UDG酶等組成的PCR反應(yīng)混合液。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的雜交反應(yīng)試劑包括雜交液I(和II、溶液I、II、III和IV、膜條以及標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品。
如前所說(shuō)，為簡(jiǎn)單快速地檢測(cè)個(gè)體血液樣品中載脂蛋白(ApoE)基因型，本發(fā)明提供了相應(yīng)的載脂蛋白(ApoE)基因反向斑點(diǎn)雜交分型檢測(cè)試劑盒。具體地說(shuō)，本發(fā)明的試劑盒提供(1)血液樣品ApoE核酸提取試劑，包括DNA提取液(500μl/管)、滅菌純水(20ml/管)、生理鹽水(10ml/管)；(2)聚合酶鏈反應(yīng)試劑，包括PCR反應(yīng)混合液10管(每管含PCR反應(yīng)緩沖液，終濃度為2.5mmol/L的Mgcl2、0.2mmol/L的dNTPs、0.2umol/L的正反向引物，二甲基亞砜5μl)、Taq酶(3u/μl，15μl)1管、UDG酶(1U/μl)1管；(3)雜交檢測(cè)試劑，主要為常規(guī)的20×SSC(主要含NaCL，檸檬酸鈉等)、SDS(十二烷基磺酸鈉)、POD(鏈霉抗生物素蛋白-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物)、TMB(四甲基聯(lián)苯胺)等。包括雜交液I(2×SSC-0.1％SDS，50ml/瓶)1瓶、雜交液II(0.5×SSC-0.1％SDS，35ml/瓶)1瓶、溶液I(250u/mlPOD，20μl/管)1管、溶液II(0.1mol/L檸檬酸鈉，30ml/瓶)1瓶、溶液III(2mg/mlTMB，1ml/管)1管、溶液IV(3％H2O2，10μl/管)1管，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，另外包括用作雜交反應(yīng)載體的膜條10張。
本發(fā)明的試劑盒除提供了各位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的特異性探針外，還配有顯色反應(yīng)控制探針和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品。由于本發(fā)明結(jié)合使用了配備有多孔濾板和減壓抽吸部件的反向點(diǎn)印跡雜交裝置，其導(dǎo)流雜交的特性大大提高了核酸分子的擴(kuò)散率、局部反應(yīng)的濃度和核酸雜交效率。一般說(shuō)來(lái)，使用本發(fā)明的方法和試劑盒，從樣本的處理到判讀基因型檢測(cè)結(jié)果僅需要6小時(shí)左右的時(shí)間。因此，本發(fā)明的方法和試劑盒特別適用于臨床標(biāo)本的快速檢測(cè)和大樣本的普查。
圖1顯示所使用的探針在膜條上的排列圖。 號(hào)探針具有SEQ ID NO3所示的序列， 號(hào)探針具有SEQ ID NO4所示的序列， 號(hào)探針具有SEQ ID NO5所示的序列， 號(hào)探針具有SEQ ID NO6所示的序列， 號(hào)顯色控制探針具有SEQID NO7所示的序列。
圖2顯示靶DNA擴(kuò)增片斷經(jīng)2％的瓊脂糖凝膠電泳圖，第1和2泳道為特異性靶DNA片斷(265bp)，M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)志。
圖3顯示六種不同基因型樣品的反向斑點(diǎn)雜交檢測(cè)結(jié)果。 號(hào)探針、 號(hào)探針和 號(hào)探針顯色判定ApoE基因型為ε4/ε4； 號(hào)探針、 號(hào)探針和 號(hào)探針顯色判定ApoE基因型為ε3/ε3； 號(hào)探針、 號(hào)探針和 號(hào)探針顯色判定ApoE基因型為ε2/ε2； 號(hào)探針、 號(hào)探針、 號(hào)探針和 號(hào)探針顯色，可判定ApoE基因型為ε2/ε3； 號(hào)探針、 號(hào)探針、 號(hào)探針和 號(hào)探針顯色，可判定ApoE基因型為ε3/ε4； 號(hào)探針、 號(hào)探針、 號(hào)探針、 號(hào)探針和 號(hào)探針顯色判定ApoE基因型為ε2/ε4(參見(jiàn)下列表1和圖3)。
表1
發(fā)明的具體實(shí)施方式
實(shí)施例1樣品靶核酸的制備用無(wú)菌注射器抽取受檢者的靜脈血1ml，加入含EDTA抗凝管中，室溫或低溫保存。取抗凝全血300μl加到1.5ml離心管中，向離心管中加入1ml的滅菌純水，充分混勻，室溫靜置2-4分鐘。然后離心(5000rpm)6分鐘，收集沉淀物。重復(fù)上述步驟一次后向離心管內(nèi)加入1ml生理鹽水并混勻，10000rpm離心10分鐘后，收集管底的白色沉淀。向沉淀中加入50μl的DNA提取液，充分混勻，沸水浴10分鐘并以12000rpm離心10分鐘。取2μl上清液作為PCR反應(yīng)模板。
實(shí)施例2靶核酸的PCR擴(kuò)增取單管單人份PCR反應(yīng)液若干管，每管加入1μl UDG酶，再直接加入2μl模板(或陰陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品)，充分混勻，瞬時(shí)(3秒)離心，將各反應(yīng)管放入PCR儀，50℃預(yù)處理3分鐘后采用熱啟動(dòng)結(jié)合“降落PCR”，按下列條件擴(kuò)增94℃4分鐘，80℃3分鐘，在此過(guò)程中加入Taq酶1μl。94℃2分鐘變性，然后按94℃1分鐘，70℃1分鐘，72℃1分鐘，共5個(gè)循環(huán)，再按94℃1分鐘，64℃1分鐘，72℃1分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(見(jiàn)附圖2)。
實(shí)施例3六種已知基因型的樣品反向斑點(diǎn)雜交檢測(cè)雜交前，取雜交液I(2×SSC-0.1％SDS)與雜交液II混合并預(yù)熱至59℃?zhèn)溆?。根?jù)待檢樣品的數(shù)目取6個(gè)1.5ml離心管，各管分別加入0.5ml雜交液I并預(yù)加熱至59℃。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物97℃變性處理5分鐘后，置于冰水混合物中放置2-5分鐘。然后取1000μl雜交液I+2μl溶液I(1000∶2)混合溶液作為結(jié)合液4℃保存?zhèn)溆?，并取溶液II∶溶液III∶溶液IV(1900∶200∶1)的混合物(19ml溶液II+2ml溶液III+10μl溶液IV)作為顯色液避光備用。
雜交前用蒸餾水充滿(mǎn)反應(yīng)室，放置好金屬多孔板，打開(kāi)水泵以排出多孔板上的水份。設(shè)定雜交儀溫度為59℃，首先將塑料墊片置于金屬多孔板上并將ApoE基因分型膜條置于塑料墊片上，蓋好硅膠分隔室和壓扣蓋。再在變性后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)加入59℃預(yù)熱的0.5ml雜交液I，混勻后加入雜交槽中溫育5分鐘并打開(kāi)泵進(jìn)行雜交導(dǎo)流。然后加入預(yù)熱的雜交液II清洗膜條(每孔1ml，重復(fù)洗3次)。設(shè)定雜交儀溫度為25℃(或室溫)并加入結(jié)合液(每孔1ml)。靜置2分鐘后泵出結(jié)合液，再加入室溫雜交液I清洗膜條(每孔1ml，各重復(fù)洗3次)。隨后加入溶液II靜置2分鐘后泵干，最后加入新鮮配制的顯色液(每孔1ml)，顯色6～8分鐘并開(kāi)泵抽干顯色液觀察結(jié)果(參見(jiàn)附圖3)。
由圖3所示的結(jié)果可以看出，各探針顯色清晰可見(jiàn)，無(wú)非特異性雜交；根據(jù)附圖一所示的排列格式可判讀出這六種不同的基因型。
實(shí)施例4不同基因型樣品的反向斑點(diǎn)雜交基因分型檢測(cè)結(jié)果判定使用本發(fā)明的方法和試劑盒，對(duì)40份采自Alzheimer氏病患者的白細(xì)胞DNA樣品進(jìn)行ApoE基因型檢測(cè)。結(jié)果檢出ε3/ε3(22例)、ε4/ε4(2例)、ε3/ε4(11例)、ε2/ε3(3例)、ε2/ε4(2例)，未檢出ε2/ε2純合型。
為了進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明方法的準(zhǔn)確性，對(duì)所有樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果表明，使用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)的結(jié)果和測(cè)序結(jié)果完全吻合，特異性達(dá)100％。
序列表<110>中山大學(xué)安達(dá)基因股份有限公司<120>檢測(cè)載脂蛋白E基因型的方法和試劑盒<140>
<141>
<160>7<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>1GGCACGGCTG TCCAAGGAGC<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>2GCGCTCGCGG ATGGCGCTG<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交探針。
<400>3TGGAGGACGT GCGCGGCCGC<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交探針。
<400>4
GGAGGACGTG TGCGGCCGC<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交探針。
<400>5CTGCAGAAGC GCCTGGCAGTG<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交探針。
<400>6CTGCAGAAGT GCCTGGCAGT<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交探針。
<400>7TCTTCCAATA TCCGGTCCTG TTGAT
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)個(gè)體載脂蛋白E基因型的方法，該方法包括(1)提供待檢靶DNA樣品；(2)利用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增體系擴(kuò)增靶DNA片斷；(3)使被標(biāo)記的靶DNA與特異性寡核甘酸探針雜交；(4)檢測(cè)雜交結(jié)合物并借以判斷靶DNA的載脂蛋白E基因型，特征在于聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增體系中使用的正向和反向引物分別是5’-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3’(SEQ ID NO1)和5′-生物素-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ IDNO2)，并且雜交反應(yīng)中使用的寡核甘酸探針?lè)謩e是(1)NH2-5’-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO3)；(2)NH2-5’-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO4)；(3)NH2-5’-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3’(SEQ ID NO5)；(4)NH2-5’-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3’(SEQ ID NO6)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的DNA樣品是得自被檢者血液白細(xì)胞的人基因組DNA樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法所說(shuō)的檢測(cè)是使用帶有多孔濾板和減壓抽吸部件的反向點(diǎn)印跡雜交裝置完成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的標(biāo)記分子是生物素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的靶DNA的基因型包括3種純合子型(ε4/ε4、ε3/ε3和ε2/ε2)和3種雜合子型(ε3/ε4、ε2/ε3和ε2/ε4)。
6.用于檢測(cè)人個(gè)體載脂蛋白E基因型的的試劑盒，該試劑盒包括(1)核酸提取試劑；(2)聚合酶鏈反應(yīng)試劑；(3)雜交反應(yīng)試劑，特征在于聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增體系中所使用的正向和反向引物分別是5’-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3’(SEQ ID NO1)和5′-生物素-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ ID NO2)，并且雜交反應(yīng)中使用的寡核甘酸探針?lè)謩e是(1)NH2-5’-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO3)；(2)NH2-5’-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO4)；(3)NH2-5’-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3’(SEQ ID NO5)；(4)NH2-5’-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3’(SEQ ID NO6)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的試劑盒，其中所說(shuō)的核酸提取試劑包括由DNA提取液和滅菌生理鹽水組成的提取待檢樣品DNA的抽提液。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的試劑盒，其中所說(shuō)的聚合酶鏈反應(yīng)試劑包括由含有脫氧尿嘧啶核苷三磷酸的脫氧核糖核苷三磷酸、耐熱Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基化酶組成的PCR反應(yīng)混合液。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的試劑盒，其中所說(shuō)的雜交反應(yīng)試劑包括雜交液I和II、溶液I、II、III和IV、膜條以及標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)臨床血液樣品中載脂蛋白(ApoE)基因分型的方法及試劑盒，特別是涉及以反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)快速檢測(cè)ApoE基因型的方法及所使用的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1786188SQ200410052530
公開(kāi)日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2004年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月7日
發(fā)明者王偉毅, 張?zhí)? 何蘊(yùn)韶, 程鋼, 汪華僑 申請(qǐng)人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司