專利名稱：一種大腸桿菌質(zhì)粒載體及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及可在基因重組技術(shù)中使用的質(zhì)粒載體及其應(yīng)用方法，更具體地說，涉及由大腸桿菌熱休克系統(tǒng)調(diào)控的質(zhì)粒載體，以及用該質(zhì)粒載體表達外源基因產(chǎn)生目標蛋白的方法。
背景技術(shù)：
大腸桿菌表達系統(tǒng)由表達載體和相應(yīng)的宿主細胞兩部分構(gòu)成，是發(fā)展最早、應(yīng)用最廣、最容易操作的基因高效表達系統(tǒng)。在大腸桿菌表達系統(tǒng)中，表達載體通常運用可調(diào)控型啟動子控制外源基因的表達；這些啟動子的類型對控制被表達的目標蛋白對細胞生長的抑制、減少細胞蛋白酶對目標蛋白的降解作用，以及目標蛋白的產(chǎn)量和可溶性等起著至關(guān)重要的作用。因此，所用啟動子的性質(zhì)決定了相應(yīng)表達載體的生產(chǎn)效率和應(yīng)用潛力。經(jīng)過二十多年的發(fā)展，一些具有不同啟動子類型的表達載體已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于科學研究和商品蛋白的生產(chǎn)過程。其中研究和應(yīng)用最為成功的代表類型是帶有l(wèi)ac/tac啟動子、PL/PR啟動子、T7啟動子的系列載體(Sambrook，J，and DW Russell.2001.Molecular Cloninga laboratory manual，3rded.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。
lac/tac啟動子帶有這類啟動子的表達載體是通過大腸桿菌的lac操縱基因來實現(xiàn)表達調(diào)控的。無誘導劑存在時，lacI編碼的阻遏蛋白與啟動子下游的操縱基因緊密結(jié)合阻止轉(zhuǎn)錄的起始；誘導劑的加入使阻遏蛋白從操縱基因上解離出來，從而使基因得到轉(zhuǎn)錄或表達。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)是最有效、應(yīng)用最廣泛的誘導劑，但是由于其價格昂貴并且具有一定的毒性，使lac/tac系列的表達載體在工業(yè)酶或藥用蛋白生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制。也有用乳糖代替IPTG作誘導劑，但是因為乳糖是可代謝底物，其誘導效果不夠理想。
PL/PR啟動子PL/PR是λ噬菌體的早期轉(zhuǎn)錄啟動子，受基因cI所編碼的阻遏蛋白抑制。cI基因的溫度敏感型突變體cI857ts所產(chǎn)生的阻遏蛋白在較低溫度時(30℃)對PL/PR具有阻遏功能，在較高溫度(如40℃)時失去活性并且解阻遏(Elvin，CM et al.1990.Modifiedbacteriophage lambda promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichiacoli.Gene，87123-126)。通過熱激進行外源基因的誘導表達的PL/PR表達載體已經(jīng)發(fā)展得比較成熟。但是一般認為在進行大體積培養(yǎng)時難以實現(xiàn)快速升溫(Glazer，AN，and H Nikaido.1995.Microbial Biotechnology.WH Freeman and Company，New York)，而升溫緩慢又會影響表達水平；同時可能存在的另一個問題是在熱激誘導過程中，大腸桿菌熱休克系統(tǒng)被激活，從而合成蛋白酶對目標蛋白進行降解。
T7啟動子T7啟動子來源于大腸桿菌T7噬菌體，由T7 RNA聚合酶選擇性識別和啟動轉(zhuǎn)錄。這種表達載體是通過控制T7 RNA聚合酶的合成而進行調(diào)控的將編碼T7 RNA聚合酶的基因插入λ噬菌體，使它處于lac啟動子或PL啟動子的控制下；用這些λ噬菌體的衍生株感染大腸桿菌獲得溶源菌DE3或CE6；以這些溶源菌為宿主細胞就可以通過IPTG誘導或熱激誘導T7 RNA聚合酶的合成，從而啟動T7啟動子轉(zhuǎn)錄和表達。目前所有表達系統(tǒng)中，表達目的基因水平最高的是具有T7啟動子的系列表達載體。但是T7表達載體也有不足之處，如有賴于輔助基因、需要采取其它措施控制本底表達水平、易產(chǎn)生不溶性表達產(chǎn)物等等(Russell D.1999.Gene expression systems based on bacteriophage T7 RNA polymerase.In GeneExpression Systems(Fernandez，JM，and JP Hoeffler，eds.)，pp 9-44.Academic Press，London)。同時，因為人們在對T7啟動子進行誘導表達時間接地使用了lac或PL啟動子，所以同樣會遇到誘導劑或誘導方法方面的問題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一種通過熱激誘導，且表達水平高于其它大腸桿菌表達載體的新型質(zhì)粒。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)(1)構(gòu)建一種質(zhì)粒載體，其特征在于具有由大腸桿菌σ因子σ32識別和調(diào)控的啟動子。
(2)上述(1)中所述的質(zhì)粒載體，其特征在于所述的由大腸桿菌σ因子σ32識別和調(diào)控的啟動子，其序列為5’-CCCCCTTGAA TGTGGGGGAA ACATCCCCAT GATCCAAGGA G-3’。
(3)上述(1)中所述的質(zhì)粒載體，其特征在于所述的由大腸桿菌σ因子σ32識別和調(diào)控的啟動子，其序列為5’-CGGCGTTGAA TGTGGGGGAA ACATCCCCAT ATACTGACGT A-3’或5’-CCCCCTTGAT GACGTGGTTT ACGACCCCAT TTAGTAGTCA-3’。
(4)一種質(zhì)粒載體，其中待表達的目的基因被整合進上述(1)至(3)任一項的質(zhì)粒載體中。
(5)一種應(yīng)用上述質(zhì)粒載體表達目的基因的方法，其特征在于在大腸桿菌宿主細胞中導入一種質(zhì)粒載體，在所述質(zhì)粒載體中待表達的目的基因被整合進上述(1)至(3)任一項的質(zhì)粒載體中；并用熱激誘導方法誘導目的基因的表達。
本發(fā)明的質(zhì)粒作為表達載體應(yīng)用于構(gòu)建大腸桿菌基因工程菌，并通過熱激誘導外源基因的表達，但誘導表達機理不同于其它表達載體，受熱激誘導的宿主蛋白酶活性很低，表達水平遠遠高于PL載體，而且目標蛋白的群體表達量(mg/L)一般高于T7載體。
本發(fā)明的質(zhì)粒載體可以通過以下方法構(gòu)建1.新型啟動子和終止子的設(shè)計和合成根據(jù)大腸桿菌σ32識別的啟動子的堿基共同序列設(shè)計新型啟動子，其序列為5’-CCCCCTTGAA TGTGGGGGAA ACATCCCCAT GATCCAAGGA G-3’(劃線部分為共同序列)，命名為熱激啟動子(Hsh promoter，圖1)；同時，大腸桿菌熱激蛋白基因lon和dnaK P1的啟動子也被用于本系列表達載體的啟動子，其序列為5’-CGGCGTTGAA TGTGGGGGAA ACATCCCCATATACTGACGT A-3’(lon)，或5’-CCCCCTTGAT GACGTGGTTT ACGACCCCAT TTAGTAGTCA-3’(dnaKP1)。
根據(jù)GeneBank文件ECORPSRPO，設(shè)計一個不依賴于大腸桿菌Rho的GAAA終止子，其序列為5’-GA AGGCCGCTTCCGAAAGGAAGCGGCT TTTTT-3’，命名為熱激終止子(Hsh terminator，圖1)。大腸桿菌的其它依賴于或不依賴于Rho的終止子也可以用于本質(zhì)粒，終止由上述啟動子所啟動的基因轉(zhuǎn)錄，如ECOPROC的終止子5’-CGGACGTCAGGCCGCCACTTCGGTGCGGTTACGTCCGGCTTTCTTT-3’，或ECOXYLE的終止子5’-CTTCCTGTCCAGCACGCCGCGCCATTTCGGCGTGCTGACTTTTT-3’等等(下劃線標明終止子中配對形成莖環(huán)的序列)。
2.新型表達載體各元件的擴增和組裝方法(1)設(shè)計并合成一對帶有新型啟動子或終止子的引物，它們的序列是5’-CCGGAATTCCTCCTTGGATC ATGGGGATGT TTCCCCCACA TTCAAGGGGGCTCTTCCGCT TCCTCTC-3’和5’-TGAAGCTTGAAGGCCGCTTC CGAAAGGAAG CGGCTTTTTTGCCTGATGCG GTATTTTC-3’(劃線部分為添加的限制性內(nèi)切酶識別位點以及與模板配對的序列)。以pUC19為模板，用DNA聚合酶Pyrobest(TaKaRaBiotech，Co.，Ltd.，Dalian，China)進行聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增出其復制起點(Ori)、氨芐青霉素抗性基因(Ampr)。
(2)通過PCR從海棲熱袍菌Thermotoga maritima(ATCC43589)基因組DNA中擴增木聚糖酶基因B(xynB)，在其上游加入限制性內(nèi)切酶BamH I識別位點，在其下游融合一個Xho I識別位點和六個組氨酸密碼子，并在末端加入限制性內(nèi)切酶Hind III識別位點。將所擴增的DNA片段插入載體pAlter-ex2(Promega Corp.，Madison，WI，USA)相應(yīng)的位點構(gòu)成pAlter-ex2-xynB。
(3)用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III從pAlter-ex2-xynB上切下帶有SD序列、多克隆位點、xynB和組氨酸標簽的DNA片段；用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III處理PCR擴增的帶有新型啟動子及終止子的pUC19的復制子和抗性基因的DNA片段；用T4 DNA連接酶將兩個DNA片段連接起來獲得帶有xynB的載體pHsh-xynB。
(4)用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I從pHsh-xynB中切除xynB，用T4 DNA聚合酶將粘性末端補平，并用T4 DNA連接酶進行環(huán)化連接獲得新載體pHsh(圖1)。
以其它熱激蛋白啟動子及其類似序列替換本質(zhì)粒中的啟動子得到一系列由大腸桿菌σ32調(diào)控的基因表達載體，如pHsh-lon、pHsh-dK等?？梢杂靡韵路椒ㄟM行替換設(shè)計帶有l(wèi)on或dnaK P1等熱激蛋白啟動子的引物，以pHsh為模板，用DNA聚合酶Pyrobest擴增，并用DNA激酶磷酸化和DNA連接酶環(huán)化連接，產(chǎn)生帶有不同熱激蛋白啟動子的系列載體pHsh-lon或pHsh-dK等。
本發(fā)明的質(zhì)粒載體的應(yīng)用效果為了檢驗本發(fā)明所構(gòu)建的表達載體pHsh在外源基因表達中的有益效果，乙醇嗜熱厭氧桿菌Thermoanaerobacter ethanolicus(ATCC31936)中的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙活性酶基因xarB和T.maritima基因xynB的突變體xynIII(本實驗室誘變產(chǎn)生)等外源基因被分別克隆到商品化載體pTrc99A(tac啟動子，Pharmacia，Piscataway，NJ，USA)、pET28(T7啟動子)(Novagen，Inc.，Madison，WI，USA)和已得到廣泛使用的熱激誘導質(zhì)粒pJLA503(PL啟動子，Schauder，B et al.1987.Inducible expression vectors incorporating theEscherichia coli atpE translational initiation region.Gene，52279-283)，構(gòu)建成基因重組菌株進行了表達水平的比較試驗。該試驗中所用到的基因克隆的技術(shù)均參照冷泉港實驗室出版的實驗手冊《分子克隆》第三版(Sambrook，et al.，2001)。表達水平試驗中各載體的表達誘導采用了相應(yīng)的供應(yīng)商所建議的最佳條件將以pTrc99A、pET28為表達載體的重組菌置于37℃通氣培養(yǎng)，細胞密度(OD600)達到0.8左右時向培養(yǎng)液中分別加入5mM和1mM IPTG進行誘導；或?qū)⒁詐JLA503、pHsh為表達載體的重組菌置于30℃搖床振蕩培養(yǎng)，細胞密度(OD600)達到0.8左右時將培養(yǎng)管或三角瓶從30℃搖床移入42℃水浴搖床振蕩培養(yǎng)。
阿拉伯糖苷酶基因表達試驗以T.ethanolicus基因組DNA為模板擴增出基因xarB，將它分別克隆到表達載體pTrc99A、pET-28a和pHsh中得到的重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109或JM109(DE3)得到相應(yīng)的重組菌株pTrc-xar、pET-xar、pHsh-xar，經(jīng)培養(yǎng)和表達誘導后，根據(jù)阿拉伯糖苷酶(arabinosidase)活性的增加進行表達水平的比較。試驗結(jié)果(圖2)表明在以pHsh為載體的重組菌pHsh-xar中阿拉伯糖苷酶的表達水平比以pTrc99A為載體的重組菌pTrc-xar高2.6倍左右，比以pET28為載體的重組菌pET-xar高0.5倍以上，而且pHsh-xar的本底表達明顯低于pET-xar。
木聚糖酶基因表達試驗將T.maritimas基因xynB的突變體xynIII克隆到表達載體pJLA503、pET-28a和pHsh中得到的重組質(zhì)粒；并將它們分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109或JM109(DE3)得到相應(yīng)的重組菌株pJLA-xynIII、pET-xynIII和pHsh-xynIII，經(jīng)培養(yǎng)和表達誘導后，測定木聚糖酶活性的增加。試驗結(jié)果表明在以pHsh為載體的重組菌pHsh-xynIII中木聚糖酶的表達水平比以pJLA503為載體的重組菌pJLA-xynIII高2倍以上，比以pET28為載體的重組菌pET-xynIII高10倍左右(圖3)。
運用pHsh系列載體進行生物活性蛋白的基因表達可以取得以下有益效果(1)本底表達低，重組蛋白產(chǎn)量高，表達量(mg/L)一般高于T7系統(tǒng)；(2)通過熱激誘導外源基因的表達，避免使用IPTG等化學誘導劑；(3)熱激誘導機制不同于PL，克服了PL的弱點；(4)載體分子量小，易于進行分子操作，如原位進行定點突變等；(5)對宿主菌株沒有特殊要求，不需要對宿主菌株進行特殊的基因改造。
圖1是質(zhì)粒pHsh結(jié)構(gòu)圖。其中Hsh promoter是啟動子，Hsh terminater是終止子；所標出的限制性內(nèi)切酶在該質(zhì)粒上具有單一識別位點。
圖2是Thermoanaerobacter ethanolicus阿拉伯糖苷酶基因xarB在不同表達載體中的表達曲線。大腸桿菌培養(yǎng)基為Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基，另加卡那霉素至30μg/ml(pET-xar)或氨芐青霉素至100μg/ml(pTrc-xar和pHsh-xar)；酶活性定義以1mM對硝基苯酚α-阿拉伯糖苷(pNPA，Sigma)為底物，在80℃，pH 5.7的條件下，每分鐘產(chǎn)生1μmol對硝基苯酚所需要的酶量定義為1個活性單位。
圖3是Thermotoga maritimas基因xynB的突變體xynIII在不同表達載體中的表達曲線。大腸桿菌培養(yǎng)基為Terrific培養(yǎng)基，另加卡那霉素至30μg/ml(pET-xynIII)或氨芐青霉素至100μg/ml(pJAL-xynIII和pHsh-xynIII)；木聚糖酶活性定義以0.5％Oat xylan(Sigma)為底物，在90℃，pH 5.8的條件下，每分鐘產(chǎn)生1μmol還原糖所需要的酶量定義為1個活性單位。
具體實施例方式
以下通過實施例進一步說明本發(fā)明具體實施方式
。
實施例1(1)啟動子和終止子的設(shè)計和合成根據(jù)大腸桿菌σ32識別的啟動子的堿基共同序列設(shè)計新型啟動子，其序列為5’-CCCCCTTGAATGTGGGGGAA ACATCCCCAT GATCCAAGGA G-3’(劃線部分為共同序列)，命名為熱激啟動子(Hshpromoter，圖1)；根據(jù)GeneBank文件ECORPSRPO，設(shè)計一個不依賴于大腸桿菌Rho的GAAA終止子，其序列為5’-GA AGGCCGCTTCCGAAAGGAAGCGGCT TTTTT-3’(下劃線標明終止子中配對形成莖環(huán)的序列)，命名為熱激終止子(Hsh terminator，圖1)。
(2)質(zhì)粒載體各元件的擴增和組裝方法設(shè)計并合成一對帶有新型啟動子或終止子的引物，它們的序列是5’-CCGGAATTCCTCCTTGGATC ATGGGGATGT TTCCCCCACA TTCAAGGGGGCTCTTCCGCT TCCTCTC-3’和5’-TGAAGCTTGAAGGCCGCTTC CGAAAGGAAG CGGCTTTTTTGCCTGATGCG GTATTTTC-3’(劃線部分為添加的限制性內(nèi)切酶識別位點以及與模板配對的序列)。以pUC19為模板，用DNA聚合酶Pyrobest(TaKaRaBiotech，Co.，Ltd.，Dalian，China)進行聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增出其復制起點(Ori)、氨芐青霉素抗性基因(Ampr)。
通過PCR從海棲熱袍菌Thermotoga maritima(ATCC4 3589)基因組DNA中擴增木聚糖酶基因(xynB)，在其上游加入限制性內(nèi)切酶BamH I識別位點，在其下游融合一個Xho I識別位點和六個組氨酸密碼子，并在末端加入限制性內(nèi)切酶Hind III識別位點。將所擴增的DNA片段插入載體pAlter-ex2(Promega Corp.，Madison，WI，USA)相應(yīng)的位點構(gòu)成pAlter-ex2-xynB。
用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hingd III從pAlter-ex2-xynB上切下帶有SD序列、多克隆位點、xynB和組氨酸標簽的DNA片段；用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III處理PCR擴增的帶有新型啟動子及終止子的pUC19的復制子和抗性基因的DNA片段；用T4 DNA連接酶將兩個DNA片段連接起來獲得帶有xynB的載體pHsh-xynB。
用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I從pHsh-xynB中切除xynB，用T4 DNA聚合酶將粘性末端補平，并用T4 DNA連接酶進行環(huán)化連接獲得新載體pHsh(圖1)。
(3)基因克隆將Thermotoga maritimas基因xynB的突變體xynIII通過NcoI和XhoI雙位點克隆到表達載體pHsh中構(gòu)建成重組質(zhì)粒pHsh-xynIII；用電穿孔法(electroporation)將這個質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株JM109。
(4)表達誘導將菌種(OD600約為2.0)以2％接入裝在100ml三角瓶中的30ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，置于30℃搖床中進行振蕩培養(yǎng)；當OD600約為0.8時，將三角瓶移入42℃的水浴搖床繼續(xù)進行振蕩培養(yǎng)；約8個小時后停止培養(yǎng)并離心收集細胞。
實施例2與實施例1基本相同，不同之處在于啟動子為大腸桿菌熱激蛋白基因lon的啟動子，其序列為5’-CGGCGTTGAA TGTGGGGGAA ACATCCCCAT ATACTGACGT A-3’(lon)，設(shè)計帶有l(wèi)on熱激蛋白啟動子的引物，用DNA聚合酶Pyrobest擴增，并用T4 DNA激酶磷酸化和T4DNA連接酶環(huán)化連接，獲得新載體pHsh-lon。
實施例3與實施例1基本相同，不同之處在于啟動子為大腸桿菌熱激蛋白基因dnaK P1的啟動子，其序列為5’-CCCCCTTGAT GACGTGGTTT ACGACCCCAT TTAGTAGTCA-3’(dnaK P1)，設(shè)計帶有dnaK P1熱激蛋白啟動子的引物，用DNA聚合酶Pyrobest擴增，并用T4 DNA激酶磷酸化和T4 DNA連接酶環(huán)化連接，獲得新載體pHsh-dK。
實施例4與實施例1基本相同，不同之處在于，外源基因為T.maritima中的葡萄糖醛酸酶基因aguA，將它克隆到表達載體pHsh中得到重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109得到相應(yīng)得重組菌株pHsh-agu。
實施例5與實施例1基本相同，不同之處在于，外源基因為T.ethanolicus中的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶雙活性酶基因xarB，將它克隆到表達載體pHsh中得到重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109得到相應(yīng)得重組菌株pHsh-xar。
實施例6與實施例1基本相同，不同之處在于，宿主菌是大腸桿菌JM109(DE3)。
實施例7與實施例1基本相同，不同之處在于，宿主菌是大腸桿菌DH5α。
實施例8與實施例1基本相同，不同之處在于，采用試管進行培養(yǎng)和誘導在直徑為18毫米的試管中裝液2.5毫升，并置于30℃搖床振蕩培養(yǎng)，細胞密度(OD600)達到0.8左右時將試管從30℃搖床移入42℃水浴搖床振蕩培養(yǎng)8小時。
實施例9與實施例1基本相同，不同之處在于，采用換液法進行熱激誘導將重組菌pHsh-xar置于30℃搖床振蕩培養(yǎng)，細胞密度(OD600)達到0.8左右時，離心棄去上清液，收集細胞，再加入預熱至40℃的培養(yǎng)基培養(yǎng)8小時。
權(quán)利要求
1.一種質(zhì)粒載體，其特征在于具有由大腸桿菌σ因子σ32識別和調(diào)控的啟動子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體，其特征在于所述的由大腸桿菌σ因子σ32識別和調(diào)控的啟動子，其序列為5’-CCCCCTTGAA TGTGGGGGAA ACATCCCCAT GATCCAAGGA G-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體，其特征在于所述的由大腸桿菌σ因子σ32識別和調(diào)控的啟動子，其序列為5’-CGGCGTTGAA TGTGGGGGAA ACATCCCCAT ATACTGACGT A-3’或5’-CCCCCTTGAT GACGTGGTTT ACGACCCCAT TTAGTAGTCA-3’。
4.一種質(zhì)粒載體，其中待表達的目的基因被整合進權(quán)利要求1的質(zhì)粒載體中。
5.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述質(zhì)粒載體表達目的基因的方法，其特征在于在大腸桿菌宿主細胞中導入一種質(zhì)粒載體，在所述質(zhì)粒載體中待表達的目的基因被整合進權(quán)利要求1的質(zhì)粒載體中；并用熱激誘導方法誘導目的基因的表達。
全文摘要
一種大腸桿菌質(zhì)粒載體及其應(yīng)用方法，涉及可在基因重組技術(shù)中使用的質(zhì)粒載體，以及用該質(zhì)粒載體表達目的基因的方法。本發(fā)明的質(zhì)粒載體，其特征在于，具有由大腸桿菌σ因子σ
文檔編號C12N15/11GK1609223SQ20041004163
公開日2005年4月27日 申請日期2004年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月9日
發(fā)明者邵蔚藍, 吳華偉 申請人:南京師范大學