專利名稱：一種發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針的脫氧核糖核酸芯片及其應用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種核酸檢測的芯片，尤其是一種用于所有提取的DNA、RNA或它們的核酸序列擴增產(chǎn)物檢測的芯片，屬于檢測芯片制造的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
分子信標(molecular beacon MB)是在同一探針的兩末端分別標記熒光分子和淬滅分子。該探針5’和3’末端自身可以形成一5-8個堿基左右的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，此時熒光分子和淬滅分子鄰近，因此不會產(chǎn)生熒光。當溶液中有特異模板的時，該探針與模板雜交，從而破壞了探針的莖結(jié)構(gòu)，由于熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)的作用，溶液中便產(chǎn)生熒光，熒光強度與溶液中探針的量成正比。因此可以用來溶液中核酸的檢測。后來隨著生物芯片技術(shù)的不斷發(fā)展，分子信標技術(shù)又被固定到固相載體上制備分子信標芯片用于SNP的高通量篩選。作為一種核酸的檢測和實時定量分析試劑，分子信標探針正在被越來越多的研究者和實驗室所接受，并且近年來也已針對MB和相關(guān)技術(shù)進行了許多有益的改進和商業(yè)開發(fā)。盡管如此，在MB的設(shè)計、合成和純化等技術(shù)領(lǐng)域仍存在許多有待解決的問題。例如，目前的標記合成和純化手段有限，因而導致MB的生產(chǎn)成本很高，特別是在使用有較長序列的MB的情況下。更為不幸的是，對于一個設(shè)計并合成好的特定MB，甚至有高達70％的終產(chǎn)品經(jīng)試驗證實是無效或不能使用的。而且MB的特點是采用非熒光染料作為淬滅分子，熒光合成時標記較復雜，成本非常昂貴，探針自身復性不完全或熒光淬滅效率等原因而導致探針熒光背景的干擾。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是建立一種發(fā)卡結(jié)構(gòu)的DNA(deoxyribonucleic acid脫氧核糖核酸)探針芯片及其應用方法，以實現(xiàn)高特異性、低成本的核酸檢測。
技術(shù)方案本發(fā)明涉及的是一種核酸檢測的芯片，這里的核酸是指所有提取的DNA、RNA(RibonucleicAcid核糖核酸)或它們的核酸序列PCR(polymerasechain reaction聚合酶鏈反應)擴增產(chǎn)物。本發(fā)明的發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針的DNA芯片是采取以下方案實現(xiàn)的該探針近5’端和近3’端之間有3～20個堿基互補而形成一個發(fā)卡結(jié)構(gòu)，該探針無需任何熒光標記物，該探針的5’端設(shè)計一段10～20個堿基的間隔序列，并在該末端標記手臂分子以固定在固體基質(zhì)表面。
該探針3，端至中間的環(huán)狀序列與被檢測的靶標核酸完全或部分互補。
該探針的固定基質(zhì)采用微球、尼龍膜、醋酸纖維素膜、塑料、橡膠、陶瓷、瓊脂糖膜、聚丙烯酰氨膜或玻璃片中的一種。
該芯片與非標記的靶標核酸雜交后在片延伸反應，在反應過程中引入標記分子，然后進行雜交信號檢測；與標記過的核酸雜交后直接進行信號檢測。
與該芯片雜交的核酸靶標為低拷貝的PCR產(chǎn)物、反轉(zhuǎn)錄的cDNA(complementary DNA互補DNA)、基因組DNA或RNA。
該芯片探針的雜交區(qū)域的中間堿基上引入一個突變位點，用于SNP(Singlenucleotide polymorphisms單堿基多態(tài)性)、點突變的高通量檢測。
有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點1、本發(fā)明的最大優(yōu)點是探針制備成本低(與分子信標比)。MB的特點是采用非熒光染料作為淬滅分子，熒光合成時標記較復雜，成本非常昂貴，而本發(fā)明的探針無需任何熒光標記。
2、本發(fā)明的芯片具有很高的特異性，同時由于探針沒有任何熒光標記物，避免了探針自身熒光背景的干擾。
3、本發(fā)明的芯片可以對大量的核酸位點進行檢測，反映的生物學意義更全面，同時可以節(jié)省大量的檢測成本。
4、本發(fā)明可以不需要對靶標核酸進行標記，雜交后在片延伸摻入標記物。
5、由于本發(fā)明的芯片在檢測時可以在片延伸，所以靶標核酸可以是低拷貝的PCR產(chǎn)物或直接為基因組DNA或cDNA，避免了由于高拷貝的PCR產(chǎn)物污染。
該芯片可以同時進行對多種基因、RNA以及SNP的檢測。該芯片的特點為檢測特異性高、檢測成本低等特點。
以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明。
圖1是本發(fā)明芯片的探針制備示意圖。
圖2是本發(fā)明芯片熒光標記的核酸檢測應用方法示意圖。
圖3是本發(fā)明芯片非標記的核酸檢測應用方法示意圖。
圖4是本發(fā)明芯片點突變或單堿基多態(tài)性(SNP)檢測應用方法示意圖。
圖5本發(fā)明芯片點突變或單堿基多態(tài)性(SNP)非標記檢測應用方法示意圖。
圖6是本發(fā)明芯片點突變或單堿基多態(tài)性(SNP)定量檢測應用方法示意圖。
圖7是小片斷核酸(如microRNA)的檢測應用方法示意圖。
其中有環(huán)狀區(qū)1，莖干區(qū)2，間隔序列3，手臂分子4，基底5，突變位點6，熒光分子7。
具體實施例方式
該探針3’端至中間的環(huán)狀序列與被檢測的靶標核酸部分或完全互補。
實例1 熒光標記的核酸檢測1、探針的制備根據(jù)待檢測的核酸序列，設(shè)計一段寡核苷酸其5’端有10個重復堿基(如T、G)的間隔序列并在末段標記一個氨基；近5’端(不含間隔序列)與近3’端有8個堿基互補而形成一個發(fā)卡結(jié)構(gòu)；環(huán)狀區(qū)與待檢測的核酸序列檢測區(qū)互補，即該探針3’端至中間的環(huán)狀序列與被檢測的靶標核酸部分互補；該探針無任何熒光標記物。(如圖1)。
2、DNA芯片的制備根據(jù)步驟1制備的探針，將標有氨基的探針固定在尼龍膜、醋酸纖維素膜或玻璃片等表面。其中每一個探針對應一種待檢測的核酸靶標。
3、芯片的雜交與信號檢測制備好的芯片先在37℃自身復性，使探針形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，然后將標記的PCR擴增產(chǎn)物與芯片雜交1～2小時。用洗脫液清洗游離的靶標DNA，在CCD顯微鏡、共聚焦顯微鏡或芯片掃描儀上對雜交后芯片進行熒光信號檢測。(如圖2)。
實例2 非標記的核酸檢測1、探針的制備同實例1。不同的是該探針3’末端至中間的環(huán)狀序列與被檢測的靶標核酸完全互補。
2、DNA芯片的制備和雜交。
同實例1。不同的是雜交靶標為非標記的PCR產(chǎn)物或提取的基因組DNA(RNA)。
3、熒光分子的摻入雜交后芯片在DNA聚合酶(DNA靶標)或RNA反轉(zhuǎn)錄酶(RNA靶標)延伸體系下作用1小時，引入Cy3-dNTP(一種熒光標記的脫氧核苷三磷酸)。用雜交清洗液清洗游離的Cy3-dNTP(如圖3)。
4、熒光信號的檢測及結(jié)果分析在CCD顯微鏡、共聚焦顯微鏡或芯片掃描儀上對雜交后芯片進行熒光信號檢測。
實例3 點突變或單堿基多態(tài)性(SNP)檢測1、探針的制備同實例1。不同的是對應每一個可能的突變位點，設(shè)計兩條探針，一條雜交區(qū)(環(huán)狀區(qū))與靶標序列檢測區(qū)完全互補，另一條在雜交區(qū)的中間堿基引入待檢測的突變位點。
2、DNA芯片的制備同實例1。
3、芯片的雜交與信號檢測同實例1(如圖4)。
實例4 點突變或單堿基多態(tài)性(SNP)非標記檢測1、探針的制備同實例3。不同的是該探針3’末端端至中間的環(huán)狀序列與被檢測的靶標核酸完全互補。
2、DNA芯片的制備和雜交。
同實例3。不同的是雜交靶標為非標記的PCR產(chǎn)物或提取的基因組DNA(RNA)。
3、熒光分子的摻入雜交后芯片在DNA聚合酶(DNA靶標)或RNA反轉(zhuǎn)錄酶(RNA靶標)延伸體系下作用1小時，引入Cy3-dNTP。用雜交清洗液清洗游離的Cy3-dNTP(如圖5)。
4、熒光信號的檢測及結(jié)果分析在CCD顯微鏡、共聚焦顯微鏡或商業(yè)芯片掃描儀上對雜交后芯片進行熒光信號檢測。
實例5 點突變或單堿基多態(tài)性(SNP)定量檢測1、探針的制備同實例3。
2、DNA芯片的制備和雜交。
同實例43、熒光分子的摻入雜交后芯片在DNA聚合酶(DNA靶標)或RNA反轉(zhuǎn)錄酶(RNA靶標)延伸體系下作用1小時，引入Cy3-ddNTP(一種熒光標記的雙脫氧核苷三磷酸)。用雜交清洗液清洗游離的Cy3-ddNTP(如圖6)。
4、熒光信號的檢測在CCD(Charge Coupled Device，電荷耦合裝置)顯微鏡、共聚焦顯微鏡或商業(yè)芯片掃描儀上對雜交后芯片進行熒光信號檢測。
5.結(jié)果分析由于在片延伸摻入的為熒光標記的ddNTP，所以每個雜交有靶標序列的探針在聚合酶的作用下只能摻入一個熒光分子。根據(jù)熒光分子個數(shù)與熒光強度作一個標準曲線。然后將掃描結(jié)果與標準曲線對比，定量得出突變的相關(guān)信息。
實例6 小片斷核酸(如microRNA)的檢測一種新的發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針的DNA芯片1、探針的制備同實例1。不同的是探針只有環(huán)狀區(qū)域與小片段核酸完全互補，其3’端除了與5’端互補序列外，另有20個堿基左右的重復序列(如ATCG)，以便于在片延伸引入標記物(如圖7)。
2、DNA芯片的制備和雜交。
同實例4。其中如果是用于小RNA檢測，先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA。但也可以直接將小RNA與芯片雜交，但后步在片延伸必須為特殊的可以以RNA為引物的酶。
3、熒光分子的摻入雜交后芯片在DNA聚合酶(DNA靶標)或特殊的RNA引發(fā)酶延伸體系下作用1小時，引入Cy3-dNTP。用雜交清洗液清洗游離的Cy3-dNTP(如圖7)。
4、熒光信號的檢測在CCD顯微鏡、共聚焦顯微鏡或商業(yè)芯片掃描儀上對雜交后芯片進行熒光信號檢測。
該方法的優(yōu)勢之一是檢測成本低于分子信標，但同樣具有很高的檢測特異性。非常適用于大規(guī)模的核酸檢測和SNP分析等研究領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針的脫氧核糖核酸芯片，由固定基質(zhì)和探針所組成，其特征在于其探針近5’端和近3’端之間的核酸堿基形成一個由環(huán)狀區(qū)(1)和有3～20個互補堿基構(gòu)成的莖干區(qū)(2)組成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)；該探針無任何熒光標記物；該探針的5’端有一段間隔核酸序列(3)，并在該端通過手臂分子(4)固定在基底(5)表面。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針的脫氧核糖核酸芯片，其特征在于該探針3’端至中間環(huán)狀的部分序列與被檢測的靶標核酸完全或部分互補。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的一種發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針的脫氧核糖核酸芯片，其特征在于該探針的固定基質(zhì)采用微球、尼龍膜、醋酸纖維素膜、塑料、橡膠、陶瓷、瓊脂糖膜、聚丙烯酰氨膜或玻璃片中的一種。
4.按照權(quán)利要求1所述的一種發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針的脫氧核糖核酸芯片的應用方法，其特征在于該芯片與標記的的核酸靶標雜交，與標記過的核酸雜交后直接進行信號檢測。
5.按照權(quán)利要求1所述的一種發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針的脫氧核糖核酸芯片的應用方法，其特征在于該芯片與非標記的核酸靶標雜交，與非標記的核酸靶標雜交后在片延伸反應，在反應過程中引入標記分子，然后進行雜交信號檢測。
6.按照權(quán)利要求4或5所述的一種發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針的脫氧核糖核酸芯片的應用方法，其特征在于與該芯片雜交的核酸靶標為PCR產(chǎn)物、反轉(zhuǎn)錄的cDNA、基因組DNA或RNA片段。
7.按照權(quán)利要求4和5所述的一種發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針的脫氧核糖核酸芯片的應用方法，其特征在于該芯片探針的雜交區(qū)域的中間堿基上引入一個突變位點(7)，用于SNP、點突變的高通量檢測。
全文摘要
一種發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針的DNA芯片及其應用方法是一種用于所有提取的DNA、RNA或它們的核酸序列擴增產(chǎn)物檢測的芯片及其應用方法，芯片由固定基質(zhì)和探針所組成，該探針近5’端和近3’端之間有3～20個堿基互補而形成一個發(fā)卡結(jié)構(gòu)，該探針無需任何熒光標記物，其5’端固定在固體基質(zhì)表面，3’端至中間的環(huán)狀序列與被檢測的靶標核酸完全或部分互補。該芯片與標記的或非標記的靶標核酸雜交，與非標記的靶標核酸雜交后在片延伸反應，在反應過程中引入標記分子，與標記的核酸雜交后便可之間進行信號檢測。該芯片探針的雜交區(qū)域的中間堿基上引入一個突變位點，可用于SNP、點突變的高通量檢測。
文檔編號C12Q1/68GK1597986SQ20041004145
公開日2005年3月23日 申請日期2004年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月22日
發(fā)明者白云飛, 劉全俊, 葛芹玉, 陸祖宏 申請人:東南大學