專利名稱：基因重組畢赤酵母生產(chǎn)普魯蘭酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因重組畢赤酵母生產(chǎn)普魯蘭酶的方法。
背景技術(shù)：
普魯蘭酶(Pullululanase，E.C3.2.1.41)是一種能夠?qū)Ｒ恍郧虚_支鏈淀粉分支點中的α-1，6-糖苷鍵，從而剪下整個側(cè)枝，形成直鏈淀粉的脫枝酶。它在淀粉加工工業(yè)中有著非常重要的用途。普魯蘭酶與糖化酶并用時，在降低糖化酶用量一半以上的同時，可使DE值高達(dá)98％，從而大大提高葡萄糖的收率；應(yīng)用于酒精工業(yè)中，大大提高淀粉的轉(zhuǎn)化率，降低生產(chǎn)成本。當(dāng)它與β-淀粉酶混合使用時，幾乎可以全部將淀粉轉(zhuǎn)化為麥芽糖，從而可以生產(chǎn)出80％以上的超高麥芽糖漿，在α-糖苷酶的作用下，超高麥芽糖漿轉(zhuǎn)化為功能性異麥芽低聚糖，可用于糖尿病人、肥胖病人以及兒童糖果中使用，防止齲齒。在啤酒生產(chǎn)中添加普魯蘭酶可有效地提高麥汁中可發(fā)酵性糖含量，提高糖的利用率和縮短糖化時間，釀造出優(yōu)級干啤酒。另外還可以采用普魯蘭酶生產(chǎn)直鏈淀粉，利用直鏈淀粉生產(chǎn)可生物降解的薄膜。由于我國將成為汽車消費大國，汽車尾氣污染和石油短缺將成為嚴(yán)重問題，因此推廣和使用汽油醇將成為發(fā)展趨勢。也因此帶動酒精產(chǎn)業(yè)及與酒精產(chǎn)業(yè)相關(guān)的淀粉制糖業(yè)的較大發(fā)展。由于普魯蘭酶在酒精、食品、環(huán)保產(chǎn)業(yè)上極其重要的用途，它將和淀粉酶、糖化酶一樣成為一個與國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展相關(guān)的重大產(chǎn)業(yè)。
70年代全酶法水解淀粉成葡萄糖的生產(chǎn)發(fā)展很快，全世界葡萄糖漿的年產(chǎn)量約為300萬噸。在當(dāng)時的生產(chǎn)中，葡萄糖的最高轉(zhuǎn)化率約為96％，是全酶法生產(chǎn)工藝的一個極限數(shù)值。這是因為糖化酶對淀粉中的α-1，6-糖苷鍵作用力較弱，從而影響淀粉的最終水解度。降低淀粉漿濃度或者增加糖化酶的用量，在理論上可以突破這個極限，但前者大大增加生產(chǎn)負(fù)荷，提高了成本，后者能誘發(fā)葡萄糖的聚合反應(yīng)，生產(chǎn)異麥芽糖等，影響最終收率。一種有效的改進(jìn)方法是在糖化時加入淀粉脫枝酶，提高α-1，6-糖苷鍵的水解速度，降低糖化酶的用量，在得到最高轉(zhuǎn)化的同時又最大限度地避免發(fā)生聚合反應(yīng)。在降低糖化酶用量的同時，可使DE值高達(dá)98％。大大提高葡萄糖的收率。因此掀起了開發(fā)普魯蘭酶的高潮。自1961年到1979年，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾十種微生物能夠產(chǎn)生脫枝酶，但都未應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，主要原因有下列幾個方面一是耐熱性差，一般最適溫度在50℃左右，60℃很快失活；二是耐酸性差，pH低于5極不穩(wěn)定；三是酶活力低，成本過高。直到1983年丹麥Novo公司成功分離出一株產(chǎn)普魯蘭酶的桿菌(B.acidopullulyticus)。經(jīng)誘變育種后，能產(chǎn)生每毫升10個單位的普魯蘭酶。其所產(chǎn)生的普魯蘭酶最適pH5.0左右，pH4.0和pH6.0時酶活降至50％以下，pH3.3時酶活接近0；最適作用溫度為60℃，45℃和68℃時活力為60℃的二分之一，耐熱性能不是太好，但能配合糖化酶使用。該公司將這一酶制劑產(chǎn)業(yè)化，商品名為Promozyme，是目前國際上唯一商品化的普魯蘭酶，目前這一產(chǎn)品占領(lǐng)了中國乃至世界95％以上的市場份額。其價格相當(dāng)昂貴，每升每毫升400單位的普魯蘭酶為165元。
目前發(fā)現(xiàn)產(chǎn)普魯蘭酶微生物中主要一類為桿菌類，如產(chǎn)氣氣桿菌Aerobacter aerogenes Z，蠟狀芽孢桿菌覃狀變種(Bacillus cereus varmycoides)，枯草桿菌(Bacillus subtilis TU)。它們所產(chǎn)普魯蘭酶耐熱性都不是太高，其最適溫度最高為70℃，因此不適用于淀粉的液化過程。為了配合淀粉的液化過程，希望開發(fā)出耐高溫普魯蘭酶，自上世紀(jì)九十年代起，國外科學(xué)家把注意力轉(zhuǎn)移至在高溫下生存的極端高溫微生物，并分離出許多產(chǎn)耐熱性的普魯蘭酶的極端微生物。主要有高溫厭氧菌(Thermoanaerobacter brockii，Thermoanaerobium Tok6-B1、Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus、Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EM1、Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum B6A-R1、Thermoanaerobacter finnii DSM3389、Thermobacteroid acetoethylicus DSM2359、Thermoanaerobacter ethanolicusDSM2246)，嗜熱古細(xì)菌(Pyrococcus woesei、Pyrococcus furiosus)，Desulfurococcus mucosus，F(xiàn)ervidobacterium pennavorans Ven5等。這些微生物所產(chǎn)普魯蘭酶能耐70～100℃高溫，最適pH為5～6，可用于淀粉的液化。其中Pyrococcus furiosusce能同時產(chǎn)生極高產(chǎn)量的耐高溫的淀粉酶和普魯蘭酶，但由于其最適生長溫度為100℃，其發(fā)酵工藝非常困難，另外這些耐高溫微生物所產(chǎn)酶大多為胞內(nèi)酶，不分泌到細(xì)胞外。因此如果直接采用這些菌株生產(chǎn)普魯蘭酶，很難工業(yè)化。如果想這些耐熱普魯蘭酶真正得到應(yīng)用，必須采用基因工程手段構(gòu)建新的菌株進(jìn)行生產(chǎn)。
從上世紀(jì)八十年代起，基因工程技術(shù)逐漸應(yīng)用于普魯蘭酶的研究與開發(fā)中。1984年，日本科學(xué)家從Klehsiella aenogenes中克隆出普魯蘭酶基因轉(zhuǎn)移入大腸桿菌中，得以有效表達(dá)，但此大腸肝菌的酶活水平不高且在非選擇性培養(yǎng)基中表現(xiàn)型極不穩(wěn)定。1985年，Takizawa通過把普魯蘭酶基因(包括結(jié)構(gòu)基因和操縱基因)克隆入多拷貝載體pBR322，得到比野生菌株酶活水平高20～40倍的工程菌，可達(dá)350單位/每毫升發(fā)酵液，是目前報道最高的，此工程菌能保持高酶水平二周。但大部分的酶都是胞內(nèi)的，不分泌到胞外，并聚集在細(xì)胞表面，這種現(xiàn)象是工業(yè)生產(chǎn)中所不需要的。自此以后許多普魯蘭酶基因得到了克隆并在大腸桿菌和枯草桿菌中得到了表達(dá)。特別是進(jìn)入九十年代后，這些工作進(jìn)展速度大大加快，相繼有許多耐熱普魯蘭酶基因，特別是上述高溫菌的普魯蘭酶基因被克隆、測序、在大腸和枯草桿菌中表達(dá)。但目前真正形成產(chǎn)業(yè)化的還并不多見。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基因重組畢赤酵母生產(chǎn)普魯蘭酶的方法。它是從Bacillus naganoensis(ATCC53909)中分離出普魯蘭酶基因，成功實現(xiàn)原核生物基因在真核表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母中高效表達(dá)，并且重組的普魯蘭酶有好的耐熱特性。
1999年，Teague W.Martin等人從Bacillus naganoensis(ATCC53909)(USPT06，300，115)中分離出了普魯蘭酶基因，并在原核生物表達(dá)系統(tǒng)枯草桿菌中高效表達(dá)，所產(chǎn)生的重組普魯蘭酶具有很好的應(yīng)用特性。本發(fā)明也是從Bacillusnaganoensis(ATCC53909)中分離出普魯蘭酶基因，在真核表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母中高效表達(dá)。具體方法是1、工程菌的構(gòu)建采用PCR的方法從Bacillus naganoensis(ATCC53909)中克隆出編碼普魯蘭酶的基因，分別克隆入畢赤酵母表達(dá)載體(PPIC9，PPIC9K，PGAP)，得到不同類型的重組子，重組子分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母表達(dá)宿主GS115，SMD1168。然后分別篩選出高效表達(dá)轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子分兩種類型，一種為甲醇誘導(dǎo)型的轉(zhuǎn)化子，需要甲醇誘導(dǎo)才產(chǎn)生重組酶，另外一種為組成型表達(dá)，在普通葡萄糖培養(yǎng)基中就能產(chǎn)酶。
2、采用基因工程菌通過搖瓶生產(chǎn)普魯蘭酶1)對于組成型轉(zhuǎn)化子來說，從平板上取少量菌接種于YEPD培養(yǎng)基中[1％yeast extract(酵母抽提物)、2％peptone(蛋白胨)、2％甘油(或glucose(葡萄糖))30℃]200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)四天后，經(jīng)5000轉(zhuǎn)/分離心后，去除細(xì)胞得到含普魯蘭酶的上清液。然后進(jìn)行發(fā)酵液酶活和酶學(xué)性質(zhì)檢測。
2)對于甲醇誘導(dǎo)型的轉(zhuǎn)化子來說，從平板上取少量菌接種于BMGY培養(yǎng)基[1％yeast extract、2％peptone，10ml 10×(13.4g/100ml)，10ml 1Mol磷酸鹽緩沖液，2ml 500×生物素(20mg/100ml)，2％甘油]中培養(yǎng)2天，再轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基[1％yeast extract、2％peptone，10ml 10×(13.4g/100ml)，10ml 1Mol磷酸鹽緩沖液，2ml 500×生物素(20mg/100ml)，2％甲醇]誘導(dǎo)培養(yǎng)兩天，離心去除細(xì)胞得到含普魯蘭酶的上清液。然后進(jìn)行發(fā)酵液酶活和酶學(xué)性質(zhì)檢測。
3、酶活測定方法和粗酶酶學(xué)性質(zhì)(1)酶活測定方法①原理普魯蘭酶在一定條件下，催化水解普魯蘭糖生成葡萄糖等還原糖，3，5-二硝基水楊酸與還原糖溶液共熱后被還原為顯棕紅色的氨基絡(luò)合物，在一定范圍內(nèi)其顏色的深淺與還原糖的量成正比，故可以在550nm的波長下進(jìn)行比色，計算酶活力。
②酶反應(yīng)體系1ml適當(dāng)稀釋后發(fā)酵液，1ml溶于pH4.5 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中的0.5％普魯蘭糖溶液，60℃反應(yīng)30min，生成還原糖采用3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)測定。
③酶活定義在上述條件下，每min產(chǎn)生相當(dāng)于1μmol葡萄糖還原力的酶活力為一個酶活單位。
(2)粗酶酶學(xué)性質(zhì)①溫度穩(wěn)定性
表1.溫度穩(wěn)定性溫度(℃)相對酶活(％)4095459650995599601006590702801②pH穩(wěn)定性表2.pH穩(wěn)定性pH相對酶活(％)3 03.5 814.0 934.5 975.0 1005.5 926.0 896.5 417.0 0③保溫時間和酶活關(guān)系
表3.保溫時間和酶活關(guān)系保溫時間相對酶活(hr) (％)0 10016782472405748536445④最適溫度與pH值表4.最適溫度與pH值相對酶活(％)pH 55℃60℃65℃3.25.7 2.2 2.23.880.883.711.54.487.990.684.15 82.4100 74.15.650.680.113.56.27.5 4.9 06.80 0 0本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下特點巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)本身不能合成普魯蘭酶，本發(fā)明通過基因工程的手段，在巴斯德畢赤氏酵母中導(dǎo)入普魯蘭酶基因，使巴斯德畢赤氏酵母大量產(chǎn)生普魯蘭酶，由于巴斯德畢赤氏酵母非常容易實現(xiàn)高密度發(fā)酵，具有高分泌的特點，因此很容易實現(xiàn)工業(yè)化大量廉價生產(chǎn)普魯蘭酶。
圖1為本發(fā)明的粗酶酶學(xué)性質(zhì)檢測中的溫度穩(wěn)定性。
圖2為本發(fā)明的粗酶酶學(xué)性質(zhì)檢測中的pH穩(wěn)定性。
圖3為本發(fā)明的粗酶酶學(xué)性質(zhì)檢測中的保溫時間和酶活關(guān)系。
圖4為本發(fā)明的粗酶酶學(xué)性質(zhì)檢測中的最適溫度與pH值關(guān)系。
具體實施例方式
1、工程菌的構(gòu)建采用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))的方法從Bacillus naganoensis(ATCC53909)中克隆出或合成編碼下列氨基酸的普魯蘭酶基因，編碼的氨基酸序列為AspGlyAsnThrThrAsnIleValValHisTyrPheArgProSerGlyAspTyrThrAspTrpAsnLeuTrpMetTrpProGluAsnGlyAspGlyAlaGluTyrAspPheAsnGlnProThrAspSerTyrGlyGluValAlaSerValAsplleProGlyAsnProSerGlnValGlyllelleValArgLysGlyAsnTrpAspAlaLysAspIleAspSerAspArgTyrIleAspLeuSerLysGlyHisGluIleTrpLeuValGlnGlyAsnSerGlnIlePheTyrSerGluLysAspAlaGluAlaAlaAlaGlnProAlaValSerAsnAlaTyrLeuAspAlaSerAsnGlnValLeuValLysLeuSerGlnProPheThrLeuGlyGluGlySerSerGlyPheThrValHisAspAspThrAlaAsnLysAspIleProValThrSerValSerAspAlaAsnGlnValThrAlaValLeuAlaGlyThrPheGlnHisIlePheGlyGlySerAspTrpAlaProAspAsnHisAsnThrLeuLeuLysLysValAsnSerAsnLeuTyrGlnPheSerGlyAsnLeuProGluGlyAsnTyrGlnTyrLysValAlaLeuAsnAspSerTrpAsnAsnProSerTyrProSerAspAsnIleAsnLeuThrValProAlaGlyGlyAlaHisValThrPheSerTyrIleProSerThrHisAlaValTyrAspThrIleAsnAsnProAsnAlaAspLeuGlnValAspSerSerGlyValLysThrAspLeuValAlaValThrLeuGlyGluAs
nProAspValSerHisThrLeuSerIleGlnThrGluAspTyrGlnAlaGlyGlnValIleProArgLysValLeuAspSerSerGlnTyrTyrTyrSerGlyAspAspLeuGlyAsnThrTyrThrLysAsnAlaThrThrPheLysValTrpAlaProThrSerThrGlnValAsnValLeuLeuTyrAsnSerAlaThrGlyAlaValThrLysThrValProMetThrAlaSerGlyHisGlyValTrpGluAlaThrValAsnGlnAspLeuGluAsnTrpTyrTyrMetTyrGluValThrGlyGlnGlySerThrArgThrAlaValAspProTyrAlaThrAlaIleAlaproAsnGlyThrArgGlyMetIleValAspLeuAlaLysThrAspProAlaGlyTrpGluSerAspLysHisIleThrProLysAsnIleGluAspGluValIleTyrGluMetAspValArgAspPheSerIleAspSerAsnSerGlyMetLysAsnLysGlyLysTyrLeuAlaLeuThrGluLysGlyThrLysGlyProAspAsnValLysThrGlyValAspSerLeuLysGlnLeuGlyIleThrHisValGlnLeuGlnProyalPheAlaPheAsnSerValAsnGluAsnAspProThrGlnTyrAsnTrpGlyTyrAspProArgAsnTyrAsnValProGluGlyGlnTyrAlaThrAsnAlaAsnGlyThrThrArgIleLysGluPheLysGluMetValLeuSerLeuHisGlnAspHisIleGlyValAsnMetAspValValTyrAsnHisThrPheAlaThrGlnIleSerAspPheAspLysIleValProGluTyrTyrTyrArgThrAspAspAlaGlyAsnTyrThrAsnGlySerGlyThrGlyAsnGluIleAlaAlaGluArgProMetValGlnLysPheIleIleAspSerLeuLysPheTrpValAsnGluTyrHisValAspGlyPheArgPheAspLeuMetAlaLeuLeuGlyLysAspThrMetSerLysAlaAlaThrGlnLeuHisAlaIleAspProGlyIleAlaLeuTyrGlyGluProTrpThrGlyGlyThrSerAlaLeuProAlaAspGlnLeuLeuThrLysGlyAlaGlnLysGlyMetGlyValAlaValPheAsnAspAsnLeuArgAsnGlyLeuAspGlySerValPheAspSerSerAlaGlnGlyPheAlaThrGlyAlaThrGlyLeuThrAspAlaIleLysAsnGlyValGluGlySerIleAsnAspPheThrAlaSerProGlyGluThrIleAsnTyrValThrSerHisAspAsnTyr
ThrLeuTrpAspLysIleAlaGlnSerAsnProAsnAspSerGluAlaAspArgIleLysMetAspGluLeuAlaGlnAlaIleValMetThrSerGlnGlyIleProPheMetGlnGlyGlyGluGluMetLeuArgThrLysGlyGlyAsnAspAsnSerTyrAsnAlaGlyAspValValAsnGluPheAspTrpSerArgLysAlaGlnTyrProAspValPheAsnTyrTyrSerGlyLeuIleHisLeuArgLeuAspHisProAlaPheArgMetThrThrAlaAsnGluIleAsnSerHisLeuGlnPheLeuAsnSerProGluAsnThrValAlaTyrGluLeuSerAspHisAlaAsnLysAspThrTrpGlyAsnIleValValIleTyrAsnProAsnLysThrAlaGluThrIleAsnLeuProSerGlyLysTrpGluIleAsnAlaThrSerGlyLysValGlyGluSerThrLeuGlyGlnAlaGluGlySerValGlnValProGlyIleSerMetMetIleLeuHisGlnGluValSerProSerAspGlyLys然后分別克隆入畢赤酵母表達(dá)載體(PPIC9，PPIC9K，PGAP)，得到不同類型的重組子，重組子分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母表達(dá)宿主GS115，SMD1168。然后分別篩選出高效表達(dá)轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子分兩種類型，一種為甲醇誘導(dǎo)型的轉(zhuǎn)化子，需要甲醇誘導(dǎo)才產(chǎn)生重組酶，另外一種為組成型表達(dá)，在普通葡萄糖培養(yǎng)基中就能產(chǎn)酶。
2、采用基因工程菌通過搖瓶生產(chǎn)普魯蘭酶1)對于組成型轉(zhuǎn)化子來說，從平板上取少量菌接種于YEPD培養(yǎng)基中[1％yeast extract(酵母抽提物)、2％peptone(蛋白胨)、2％甘油(或glucose(葡萄糖))30℃]200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)四天后，經(jīng)5000轉(zhuǎn)/分離心后，去除細(xì)胞得到含普魯蘭酶的上清液。然后進(jìn)行發(fā)酵液酶活和酶學(xué)性質(zhì)檢測。
2)對于甲醇誘導(dǎo)型的轉(zhuǎn)化子來說，從平板上取少量菌接種于BMGY培養(yǎng)基[1％yeast extract、2％peptone，10ml 10×(13.4g/100ml)，10ml 1Mol磷酸鹽緩沖液，2ml 500×生物素(20mg/100ml)，2％甘油]中培養(yǎng)2天，再轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基[1％yeast extract、2％peptone，10ml 10×(13.4g/100ml)，10ml1Mol磷酸鹽緩沖液，2ml 500×生物素(20mg/100ml)，2％甲醇]誘導(dǎo)培養(yǎng)兩天，離心去除細(xì)胞得到含普魯蘭酶的上清液。然后進(jìn)行發(fā)酵液酶活和酶學(xué)性質(zhì)檢測。
權(quán)利要求
1.一種基因重組畢赤酵母生產(chǎn)普魯蘭酶的方法，其特征在于采用巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)生產(chǎn)普魯蘭酶，本方法包括使用不同來源的普魯蘭酶的基因，使用不同的培養(yǎng)方法、不同的提取方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組畢赤酵母生產(chǎn)普魯蘭酶的方法，其特征在于基因重組的畢赤酵母中包含任何基因片斷具備編碼下列氨基酸序列AspGlyAsnThrThrAsnIleValValHisTyrPheArgProSerGlyAspTyrThrAspTrpAsnLeuTrpMetTrpProGluAsnGlyAspGlyAlaGluTyrAspPheAsnGlnProThrAspSerTyrGlyGluValAlaSerValAspIleProGlyAsnProSerGlnValGlyIleIleValArgLysGlyAsnTrpAspAlaLysAspIleAspSerAspArgTyrIleAspLeuSerLysGlyHisGluIleTrpLeuValGlnGlyAsnSerGlnIlePheTyrSerGluLysAspAlaGluAlaAlaAlaGlnProAlaValSerAsnAlaTyrLeuAspAlaSerAsnGlnValLeuValLysLeuSerGlnProPheThrLeuGlyGluGlySerSerGlyPheThrValHisAspAspThrAlaAsnLysAspIleProValThrSerValSerAspAlaAsnGlnValThrAlaValLeuAlaGlyThrPheGlnHisIlePheGlyGlySerAspTrpAlaProAspAsnHisAsnThrLeuLeuLysLysValAsnSerAsnLeuTyrGlnPheSerGlyAsnLeuProGluGlyAsnTyrGlnTyrLysValAlaLeuAsnAspSerTrpAsnAsnProSerTyrProSerAspAsnIleAsnLeuThrValProAlaGlyGlyAlaHisValThrPheSerTyrIleProSerThrHisAlaValTyrAspThrIleAsnAsnProAsnAlaAspLeuGlnValAspSerSerGlyValLysThrAspLeuValAlaValThrLeuGlyGluAsnProAspValSerHisThrLeuSerIleGlnThrGluAspTyrGlnAlaGlyGlnValIleProArgLysValLeuAspSerSerGlnTyrTyrTyrSerGlyAspAspLeuGlyAsnThrTyrThrLysAsnAlaThrThrPheLysValTrpAlaProThrSerThrGlnValAsnValLeuLeuTyrAsnSerAlaThrGlyAlaValThrLysThrValProMetThrAlaSerGlyHisGlyValTrpGluAlaThrValAsnGlnAspLeuGluAsnTrpTyrTyrMetTyrGluValThrGlyGlnGlySerThrArgThrAlaValAspProTyrAlaThrAlaIleAlaProAsnGlyThrArgGlyMetIleValAspLeuAlaLysThrAspProAlaGlyTrpGluSerAspLysHisIleThrProLysAsnIleGluAspGluValIleTyrGluMetAspValArgAspPheSerIleAspSerAsnSerGlyMetLysAsnLysGlyLysTyrLeuAlaLeuThrGluLysGlyThrLysGlyProAspAsnValLysThrGlyValAspSerLeuLysGlnLeuGlyIleThrHisValGlnLeuGlnProValPheAlaPheAsnSerValAsnGluAsnAspProThrGlnTyrAsnTrpGlyTyrAspProArgAsnTyrAsnValProGluGlyGlnTyrAlaThrAsnAlaAsnGlyThrThrArgIleLysGluPheLysGluMetValLeuSerLeuHisGlnAspHisIleGlyValAsnMetAspValValTyrAsnHisThrPheAlaThrGlnIleSerAspPheAspLysIleValProGluTyrTyrTyrArgThrAspAspAlaGlyAsnTyrThrAsnGlySerGlyThrGlyAsnGluIleAlaAlaGluArgProMetValGlnLysPheIleIleAspSerLeuLysPheTrpValAsnGluTyrHisValAspGlyPheArgPheAspLeuMetAlaLeuLeuGlyLysAspThrMetSerLysAlaAlaThrGlnLeuHisAlaIleAspProGlyIleAlaLeuTyrGlyGluProTrpThrGlyGlyThrSerAlaLeuProAlaAspGlnLeuLeuThrLysGlyAlaGlnLysGlyMetGlyValAlaValPheAsnAspAsnLeuArgAsnGlyLeuAspGlySerValPheAspSerSerAlaGlnGlyPheAlaThrGlyAlaThrGlyLeuThrAspAlaIleLysAsnGlyValGluGlySerIleAsnAspPheThrAlaSerProGlyGluThrIleAsnTyrValThrSerHisAspAsnTyrThrLeuTrpAspLysIleAlaGlnSerAsnProAsnAspSerGluAlaAspArgIleLysMetAspGluLeuAlaGlnAlaIleValMetThrSerGlnGlyIleProPheMetGlnGlyGlyGluGluMetLeuArgThrLysGlyGlyAsnAspAsnSerTyrAsnAlaGlyAspValValAsnGluPheAspTrpSerArgLysAlaGlnTyrProAspValPheAsnTyrTyrSerGlyLeuIleHisLeuArgLeuAspHisProAlaPheArgMetThrThrAlaAsnGluIleAsnSerHisLeuGlnPheLeuAsnSerProGluAsnThrValAlaTyrGluLeuSerAspHisAlaAsnLysAspThrTrpGlyAsnIleValValIleTyrAsnProAsnLysThrAlaGluThrIleAsnLeuProSerGlyLysTrpGluIleAsnAlaThrSerGlyLysValGlyGluSerThrLeuGlyGlnAlaGluGlySerValGlnValProGlyIleSerMetMetIleLeuHisGlnGluValSerProSerAspGlyLys
全文摘要
本發(fā)明是一種基因重組畢赤酵母生產(chǎn)普魯蘭酶的方法。其特征在于采用巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)生產(chǎn)普魯蘭酶，本方法包括使用不同來源的普魯蘭酶的基因，使用不同的培養(yǎng)方法、不同的提取方法。巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)本身不能合成普魯蘭酶，本發(fā)明通過基因工程的手段，在巴斯德畢赤氏酵母中導(dǎo)入普魯蘭酶基因，使巴斯德畢赤氏酵母大量產(chǎn)生普魯蘭酶，由于巴斯德畢赤氏酵母非常容易實現(xiàn)高密度發(fā)酵，具有高分泌的特點，因此很容易實現(xiàn)工業(yè)化大量廉價生產(chǎn)普魯蘭酶。
文檔編號C12N9/44GK1635116SQ20041004065
公開日2005年7月6日 申請日期2004年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月7日
發(fā)明者黃遵錫, 許波, 陳金全, 楊云娟, 唐湘華 申請人:云南師范大學(xué)