專利名稱：羽衣甘藍(lán)抗旱耐鹽耐冷的蛋白BoRSl編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種蛋白編碼序列，特別是一種抗旱耐鹽耐冷羽衣甘藍(lán)蛋白BoRS1編碼序列，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
外界環(huán)境脅迫如高鹽、干旱及寒冷等極大地影響植物的生長。特別是近代地球氣候環(huán)境的變化和人類的活動引起的地表沙漠和半沙漠化，以及大面積干旱半干旱地區(qū)和鹽堿灘涂地的存在，更加要求有適宜于這些地區(qū)種植的農(nóng)作物品種能夠不斷地得到推廣。當(dāng)前一個重要的育種手段是將表現(xiàn)出抗逆基因?qū)r(nóng)作物進(jìn)行基因工程改造，以獲得抗鹽、耐旱或耐寒冷的農(nóng)作物新品種。相關(guān)的脅迫誘導(dǎo)或抗逆基因及其蛋白的研究越來越多。RD(脫水響應(yīng))基因是從最初是從植物干旱cDNA文庫中克隆出的與干旱相關(guān)的一類基因，在植物的生長、發(fā)育和抗逆反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
在對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的分析中，雖然Yamaguchi-Shinozaki在“Characterization of the expression of a desiccation-responsive rd29gene of Arabidopsis thaliana and analysis of its promoter in transgenicplants(擬南芥脫水響應(yīng)基因RD29表達(dá)特征及其啟動子在轉(zhuǎn)基因植物中的分析)”(Molecular and General Genetics分子和普通遺傳學(xué)，1993.236(2-3)331-40)一文中對擬南芥基因RD29在脫水和鹽脅迫處理下的表達(dá)已經(jīng)做了充分肯定，但尚不清楚該基因的耐鹽、抗旱和耐冷方面的實(shí)際效果，此外至今尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題有密切聯(lián)系文獻(xiàn)的報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種抗旱耐鹽耐冷羽衣甘藍(lán)蛋白編碼序列。本發(fā)明公開了與羽衣甘藍(lán)BoRS1密切相關(guān)的蛋白基因和羽衣甘藍(lán)BoRS1蛋白序列及其核酸序列，及其在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物抗旱耐鹽耐冷中的應(yīng)用。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，在本發(fā)明提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有羽衣甘藍(lán)BoRS1蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第65-1915位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能與SEQ ID NO.3中從核苷酸第65-1915位的核苷酸序列雜交。
所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第65-1915位的核苷酸序列。
在本發(fā)明分離出的與抗旱耐鹽耐冷相關(guān)蛋白質(zhì)多肽BoRS1，它包括具有SEQID NO.3氨基酸序列的多肽。該多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽，該多肽能夠在鹽、旱、冷、高滲透壓以及水楊酸處理下均能發(fā)揮作用，而水楊酸是植物抗病蟲的信號分子。
在本發(fā)明的載體包含上述的DNA分子。一種核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
在本發(fā)明用上述DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。在實(shí)例中該宿主細(xì)胞是擬南芥。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“羽衣甘藍(lán)抗旱耐鹽耐冷蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有羽衣甘藍(lán)BoRS1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第65-1915位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框第65-1915位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中第65-1915位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.3所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件(70％-85％一致性)下，在高度嚴(yán)緊條件(85％以上一致性)下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第1162-1703位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸第65-1915位的核苷酸序列的同源性至少70％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的羽衣甘藍(lán)BoRS1相同功能的蛋白的SEQ IDNO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)通常為1-90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加為60個以內(nèi)核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“羽衣甘藍(lán)抗旱耐鹽耐冷蛋白或多肽”指具有羽衣甘藍(lán)BoRS1蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然羽衣甘藍(lán)BoRS1相關(guān)相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)通常為1-50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或?yàn)?0個以內(nèi)氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括羽衣甘藍(lán)BoRS1蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的羽衣甘藍(lán)BoRS1多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與羽衣甘藍(lán)BoRS1相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用羽衣甘藍(lán)BoRS1多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“羽衣甘藍(lán)BoRS1保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1
表2在415nt重疊中有85％的一致性Query129 cagaggaagaagagcatcacgagagtcgagcatctaaaatgttggggaaagtaaaggcaa 188|||| |||||||||||||| |||| ||||||| ||| ||||| ||||||||| | ||Sbjct1934 cagaagaagaagagcatcatgagaagggagcatccaaagtgttgaagaaagtaaaagaaa 1993Query189 aagctaagaagctcaagaacaggcttactaatcatgg 225| |||||||| |||||||||| || ||||| |||||Sbjct1994 aggctaagaaaatcaagaacagtctcactaaacatgg 2030Query376 tcatcccggagaaaataatgttccggcgccggaggagat 414|||| ||||||||| |||||||||||| ||||||||||Sbjct2255 tcatgccggagaaactaatgttccggcatcggaggagat 2293Query541 agagagcagagagactcatcacgcgccactgaacactcccgtctctctgctctctggaac 600||||||||||||| ||||||| | |||| |||||||||| || |||||||| || | |||Sbjct2495 agagagcagagaggctcatcaagagccattgaacactcctgtgtctctgctttcagcaac 2554Query601 agaggacgtgacta 614||||||||||||||Sbjct2555 agaggacgtgacta 2568Query1126 ttttccgacaagagatgatgatatgaaagtcgagattgggtcgggaagaggcttgccgac 1185
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表3在531aa重疊中有37％的一致性和46％的相似性Query3LTRPSSGHDQTEDPTQIXXXXXXXXXXSRASXXXXXXXXXXXXXXNRLTNHGIDGNXXXX 40LTRP GH+Q E+P +IAS N LT HG +G+Sbjct5LTRPY-GHEQAEEPIRIHHPEEEEHHEKGASKVLKKVKEKAKKIKNSLTKHG-NGHDHDV 62Query41 XXXXXXXXXXXXXXXXXXKHVAPVNEVSNVRGYRTSQPESLTHPGENNVPAPEEIIPSET 82H APV E S VRG T +P+SL+H GE NVPA EEI+P TSbjct63 EDDDDEYDEQDPEV-----HGAPVYESSAVRGGVTGKPKSLSHAGETNVPASEEIVPPGT 117Query83 KD----STDYTGTV-PEPSRDAAYEHEAPLYPVRT--------------------SDVSE 117K S+D+T + P +D +Y HEA PVRT S+ S+Sbjct118 KVFPVVSSDHTKPIEPVSLQDTSYGHEALADPVRTTETSDWEAKREAPTHYPLGVSEFSD 177Query118 REESRETHHAPLNTPVSLLSGTEDVT---TPGG-DGLLGGQREVNTDMPKRFEDDLSGES 173R ESRE H PLNTPVSLLS TEDVTPGG D LGGQR+VN + PKR E+D +Sbjct178 RGESREAHQEPLNTPVSLLSATEDVTRTFAPGGEDDYLGGQRKVNVETPKRLEEDPAAPG 237Query174 TYQSKIPYHTQQGSGEAGEDDHKKSGLGTELASESVTVFGGKEETGPRDDFGEKSHDFDE 233
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發(fā)明還包括羽衣甘藍(lán)BoRS1蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然羽衣甘藍(lán)BoRS1相關(guān)多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述列舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的羽衣甘藍(lán)BoRS1多肽時，可以將羽衣甘藍(lán)BoRS1編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成羽衣甘藍(lán)BoRS1蛋白表達(dá)載體。
如本發(fā)明所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”為真核細(xì)胞。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、煙草細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。
還可用Northern印跡法技術(shù)分析羽衣甘藍(lán)BoRS1基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析羽衣甘藍(lán)BoRS1的mRNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
此外，本發(fā)明可用作探針的核酸分子通常具有羽衣甘藍(lán)BoRS1核苷酸編碼序列的8-100個連續(xù)核苷酸，該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼羽衣甘藍(lán)BoRS1相關(guān)的核酸分子。
本發(fā)明檢測樣品中是否存在羽衣甘藍(lán)BoRS1相關(guān)核苷酸序列的檢測方法，包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于羽衣甘藍(lán)BoRS1相關(guān)核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的羽衣甘藍(lán)BoRS1核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選羽衣甘藍(lán)BoRS1相關(guān)同源基因或同源蛋白。
為了得到與羽衣甘藍(lán)BoRS1相關(guān)基因相關(guān)的羽衣甘藍(lán)cDNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選羽衣甘藍(lán)cDNA文庫，這些探針是在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，用32P對羽衣甘藍(lán)BoRS1相關(guān)的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。適合于篩選的cDNA文庫是來自羽衣甘藍(lán)的文庫。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識別與羽衣甘藍(lán)BoRS1相關(guān)相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。
本發(fā)明的羽衣甘藍(lán)BoRS1相關(guān)核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)固相多肽合成，WH Freeman Co.，SanFrancisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進(jìn)行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
利用本發(fā)明的羽衣甘藍(lán)BoRS1蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與羽衣甘藍(lán)BoRS1相關(guān)發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，本發(fā)明在抗旱耐鹽耐冷具有明顯的作用，能夠明顯降低在干旱和鹽堿半鹽堿土地上及在寒冷地區(qū)種植的各種農(nóng)作物在生物產(chǎn)量上的損失。干旱、高鹽和耐冷能夠造成大部分農(nóng)作物如水稻、棉花、羽衣甘藍(lán)和小麥等生長緩慢甚至死亡，從而使其明顯減產(chǎn)甚至顆粒無收。我國存在大面積的干旱半干旱、鹽堿半鹽堿和寒冷地區(qū)，及世界范圍內(nèi)也存在干旱半干旱、鹽堿半鹽堿和寒冷地區(qū)，因此，本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價值。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以具體實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1羽衣甘藍(lán)BoRS1基因的克隆1.組織分離羽衣甘藍(lán)從市場上購得，將羽衣甘藍(lán)置于25℃發(fā)芽24小時，然后轉(zhuǎn)移至1/10MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待羽衣甘藍(lán)葉片為3-5片時，準(zhǔn)備抽取DNA或RNA。
2.RNA的分離取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至1.5mL EP管中，用植物葉總RNA少量提取試劑盒抽提總RNA(Watson Biotechnologies.INC)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測定RNA含量。
3.基因的全長克隆根據(jù)油菜RD29-like基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL試劑盒)進(jìn)行cDNA全長克隆，分三個階段進(jìn)行(1)RT-PCRPCR[RS01(SEQ ID NO.1)+RS02(SEQ ID NO.2)]得到537bp片段，回收并連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥RD29基因的同源性較高，故初步認(rèn)為它是一個抗逆基因。
(2)3’-RACEPCR[AP+RS301(5’-TCCGAAAGAGAGAGATGATT-3’)和RS302(5’-CCTGAAGAAGAAGACAAAGC-3’]得到BoRS 3’(533bp)，回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥RD29基因的同源性較高，故初步認(rèn)為它是一個與RD29相關(guān)基因。
(3).5’-RACE第-輪PCR[AAP+RS501(5’-GTCACAGGTGATGCAGTTTC-3’)]第二輪PCR[(AUAP+RS502(5’-C(G/T)C(T/C)GGAGTAACCTGTACTTG-3’))第二輪PCR[(AUAP+RS503(5’-CTCTTTCGGACCAGAGAATT-3’))得到RS5’(約1231bp)將測序結(jié)果的重疊區(qū)拼接，發(fā)現(xiàn)得到的片段即是該基因的完整編碼區(qū)。
BLAST的結(jié)果證明從羽衣甘藍(lán)中新得到的基因確為一個與擬南芥RD29相關(guān)的基因。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的羽衣甘藍(lán)BoRS1蛋白的全長編碼序列(SEQ ID NO.3)。
實(shí)施例2羽衣甘藍(lán)BoRS1基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的羽衣甘藍(lán)BoRS1全長cDNA的長度為2076bp，詳細(xì)序列見SEQ IDNO.3，其中開放讀框位于65-1916位核苷酸(1851個核苷酸)。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出羽衣甘藍(lán)BoRS1的氨基酸序列，共617個氨基酸殘基，分子量為66946.71道爾頓，等電點(diǎn)(pI)為4.46。詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3。
將羽衣甘藍(lán)BoRS1的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與擬南芥基因RD29在核苷酸部分片段上具有85％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它與擬南芥基因RD29B(AAB25482)也有38％的相同性(附表3)。由此可見，羽衣甘藍(lán)基因BoRS1與擬南芥基因RD29無論從核酸還是蛋白水平上都存在一定的同源性，但同源性不高。擬南芥基因RD29A(AAB25481)和RD29B(AAB25482)已經(jīng)被證明在干旱和冷條件下明顯增強(qiáng)表達(dá)，并發(fā)揮著重要的作用，可以推測羽衣甘藍(lán)基因BoRS1在抗旱耐鹽方面也可能具有相似的作用。
實(shí)施例3羽衣甘藍(lán)基因BoRS1蛋白或多肽在擬南芥中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的抗旱耐鹽性鑒定含目的基因(羽衣甘藍(lán)基因BoRS1基因)的表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)羽衣甘藍(lán)基因BoRS1的全長序列(SEQ ID NO.3)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將羽衣甘藍(lán)基因BoRS1基因cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體(如pBI121和改進(jìn)的pCAMBIA2300)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，利用葉盤法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物煙草。
1.發(fā)苗種子用無菌水漂洗15-20分鐘，再用70％的乙醇消毒1分鐘，然后用0.1％升汞消毒10-12分鐘。最后再用無菌水沖洗5遍。將洗好的種子用吸水紙吸干，放入MS培養(yǎng)基光照培養(yǎng)。
2.剪葉片取生長兩周左右的無菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1厘米2見方的小葉片。
3.轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)將剪好的葉片放入事先培養(yǎng)好的菌液中(OD600值0.6-0.8)侵染3-5分鐘。接著取出放入MS培養(yǎng)基暗培養(yǎng)2天。
4.篩選培養(yǎng)共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體放入篩選培養(yǎng)基。2周繼代一次。2周左右有愈傷組織形成，約20天可見芽的分化。待綠芽長到2厘米后，切下生根。
篩選培養(yǎng)基MS+6BA(1.0mg/l)+NAA(0.1mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(50mg/l)
生根培養(yǎng)基MS+NAA(0.5mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(5mg/l)5.抗性植株培養(yǎng)；待根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用塑料袋罩幾天，待植株健壯后再取下至溫室中培養(yǎng)。
含羽衣甘藍(lán)基因BoRS1的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗旱耐鹽性鑒定鑒于編碼BoRS1，如擬南芥的RD29基因已被證明在抗旱耐鹽條件下發(fā)揮作用，而羽衣甘藍(lán)基因BoRS1轉(zhuǎn)錄水平與擬南芥的RD29具有一定的同源性，可進(jìn)一步對含羽衣甘藍(lán)基因BoRS1的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行抗旱耐鹽鑒定。用300Mm氯化鈉和300mM甘露醇處理處理轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因植株的種子(2天、7天、14天、21天、28天)后研究BoRS1基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況以及各種處理對植株的生長情況。Northern blot分析結(jié)果證明，轉(zhuǎn)基因植株BoRS1轉(zhuǎn)錄水平在冷和甘露醇處理后其表達(dá)量顯著增強(qiáng)，而對照非轉(zhuǎn)基因植株雖表達(dá)量提高，但明顯低于轉(zhuǎn)基因植株。此外非轉(zhuǎn)基因植株生長緩慢，最后在冷和甘露醇處理下枯萎而死，轉(zhuǎn)基因植物依然能正常生長，只是生長沒有未經(jīng)處理的植株快。在耐鹽和抗病蟲試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因植株也明顯表現(xiàn)出比對照未轉(zhuǎn)基因植株生長正常。這證明羽衣甘藍(lán)基因BoRS1基因比擬南芥基因RD29具有更有效的和更廣泛的抗逆境的功能，將可用于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物抗旱耐鹽耐冷的研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中。
實(shí)施例4羽衣甘藍(lán)基因BoRS1在羽衣甘藍(lán)中的拷貝數(shù)分析采用常規(guī)方法從羽衣甘藍(lán)葉片中提取DNA(參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分別用HindIII，Bg1II和BamHI酶切DNA[30μg.(微克)/樣品]后，將DNA轉(zhuǎn)至雜交膜(尼龍膜)上后。使用Amersham Pharmacia公司Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module(PRN3540)，我們將BoRS1基因編碼區(qū)標(biāo)記為探針，然后進(jìn)行雜交(于60℃雜交16小時)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同樣15分鐘。用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIG labeled試劑盒說明書)。結(jié)果(Southern雜交)發(fā)現(xiàn)在雜交膜上出現(xiàn)多條雜交條帶，說明羽衣甘藍(lán)基因BoRS1在羽衣甘藍(lán)中拷貝數(shù)不低于2。
實(shí)施例5羽衣甘藍(lán)基因BoRS1在羽衣甘藍(lán)中的表達(dá)譜分析1.RNA的提取將2周苗齡的羽衣甘藍(lán)幼苗先后經(jīng)200mM甘露醇，100mMNaCl，冷處理(4℃)，100μM脫落酸(ABA)和200μM水楊酸(SA)分別處理0.5小時、1小時、3小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時，然后用植物葉總RNA少量提取試劑盒抽提總RNA(Watson Biotechnologies.INC)。提取葉總RNA及4℃處理24小時根、莖、葉RNA，并參考《分子克隆》有關(guān)RNA的制備章節(jié)(Sambrook等，1989)。
2.RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計(jì)測OD260；RNA含量計(jì)算1 OD260＝40μg/ml。
3總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離1)取6ml 25*(倍)電泳緩沖液，加入117ml無菌水，混勻。2)稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉(zhuǎn)入55℃水浴中。3)于通風(fēng)櫥中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝膠溶液中，混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5)將提取的RNA(20μg)溶解于RNA變性溶液中，在65℃下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。6)在樣品中加入2ul 10*上樣緩沖液，混勻。7)在電泳液未蓋過膠的條件下點(diǎn)樣，5V/cm電壓電泳5小時左右。
4.RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移1)轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用10*SSC浸泡。2)將濕潤的膜準(zhǔn)確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2*SSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡。3)濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時。4)轉(zhuǎn)移后，將膜于80℃焙烤2小時。
5.膜上雜交信號的檢出1)將膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚精DNA]，65℃下預(yù)雜交2小時。2)將用Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module標(biāo)記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入1)的雜交液中，于65℃雜交16-24小時。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分鐘。4)用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIGlabeled試劑盒說明書)。Northern雜交表明；不同的化學(xué)物質(zhì)和激素處理，都不同程度的提高了羽衣甘藍(lán)BoRS1轉(zhuǎn)錄水平，尤其是冷處理(4℃)和甘露醇(相當(dāng)于干旱處理)下，表達(dá)明顯比其它處理增強(qiáng)。說明羽衣甘藍(lán)BoRS1轉(zhuǎn)錄水平在干旱、鹽和冷脅迫下，均能發(fā)揮作用。外源應(yīng)用ABA也能誘導(dǎo)該基因的表達(dá)水平，并且表現(xiàn)為兩步誘導(dǎo)過程，暗示該基因有可能也會在病蟲害脅迫下發(fā)揮作用。
羽衣甘藍(lán)BoRS1基因在冷處理(4℃)的不同時間處理的表達(dá)譜分析1.RNA的提取將2周苗齡的羽衣甘藍(lán)幼苗置于4℃冷處理0.5小時、1小時、3小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時；，然后按照上述方法抽提RNA并定量。
2.Northern表達(dá)結(jié)果顯示，羽衣甘藍(lán)BoRS1在冷處理30分鐘后即開始啟動表達(dá)，在24小時后達(dá)到最高峰，隨后慢慢下降，說明羽衣甘藍(lán)BoRS1在冷處理能夠表達(dá)并表現(xiàn)出一定規(guī)律。
本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1TGG(A/G)TCGGGAAGAG(G/A)CTTGC(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2CTTCCTCTT(G/C)(A/C)ACCGCCTCA
(2)SEQ ID NO.3的信息<110>上海交通大學(xué)<120>羽衣甘藍(lán)抗旱耐鹽耐冷的蛋白BoRS1編碼序列<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2076<212>DNA<213>羽衣甘藍(lán)(Brassica oleracea var.acephala)<400>1acgcggggaa tacacagaac acagaaaaga gttttggtta gttcactaag aaaagctttg 60gaaaatggat ttgacacgtc cttcttctgg tcatgatcaa acggaggatc cgacccagat 120tcaccatcca gaggaagaag agcatcacga gagtcgagca tctaaaatgt tggggaaagt 180aaaggcaaaa gctaagaagc tcaagaacag gcttactaat catggcattg atggcaacga 240gcaagaccac gatgtggtgg atgaagaaga agaagatgat gaatctgacg aggcagagtc 300agagaagcat gtcgcaccag taaatgaagt ttccaatgtg agaggctata gaacgagcca 360acctgagtca ttgactcatc ccggagaaaa taatgttccg gcgccggagg agatcattcc 420ttcagagacg aaggattcaa ctgattacac cggaaccgtc cccgaaccat cacgagatgc 480tgcttacgag cacgaggcac cgctttatcc tgtgagaacg tcagatgtgt cggagaggga 540agagagcaga gagactcatc acgcgccact gaacactccc gtctctctgc tctctggaac 600agaggacgtg actactcccg gtggagatgg gttgctcggt ggtcaacggg aagtcaacac 660cgatatgccc aaaagattcg aggacgatct gagtggtgaa tctacttatc agtcaaagat 720tccgtatcac acccaacaag ggagtgggga agctggagaa gatgatcata agaagtcagg 780actaggaact gagctggcgt ccgaatctgt aaccgttttt ggcgggaaag aagaaactgg 840gccgagggat gattttgggg agaaaagcca tgactttgat gagaagatcg aaacaagaat 900cgggaacgat tgtggaaagc caggaactga gctgagtgaa gattttccgg ggaagggcca 960tgaatttgaa caggcgatcg gatctggaat cggggaggat aacggcgccg gaaaacaagg 1020aactgagcgg agggaagatt ttttggggaa aagctatgag tttgatcatg agattgaatc 1080tgcattcggc aaagattcac ccaccagact tcccggagac gaaatttttc cgacaagaga 1140tgatgatatg aaagtcgaga ttgggtcggg aagaggcttg ccgacagaaa ctgatgatca 1200cttctcacca gaattctctg gtccgaaaga gagagatgat ttcgattcgc aggctgagca 1260
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1.一種抗旱耐鹽耐冷羽衣甘藍(lán)BoRS1蛋白編碼序列，其特征在于，包括編碼具有羽衣甘藍(lán)BoRS1蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第65-1915位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能與SEQ ID NO.3中從核苷酸第65-1915位的核苷酸序列雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗旱耐鹽耐冷羽衣甘藍(lán)BoRS1蛋白編碼序列，其特征是，所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗旱耐鹽耐冷羽衣甘藍(lán)BoRS1蛋白編碼序列，其特征是，所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第65-1915位的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗旱耐鹽耐冷羽衣甘藍(lán)BoRS1蛋白編碼序列，其特征是，包含DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗旱耐鹽耐冷羽衣甘藍(lán)BoRS1蛋白編碼序列，其特征是，DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。
全文摘要
一種抗旱耐鹽耐冷羽衣甘藍(lán)蛋白編碼序列，屬于基因工程領(lǐng)域。包括編碼具有羽衣甘藍(lán)BoRS1蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第65－1915位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能與SEQ ID NO.3中從核苷酸第65－1915位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明在植物抗旱耐鹽耐冷方面具有明顯的作用，能夠明顯減少農(nóng)作物在干旱半干旱、鹽堿半鹽堿或冷害發(fā)生條件下生物產(chǎn)量的損失。本發(fā)明在植物抗旱耐鹽耐冷方面具有很大的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/82GK1557953SQ200410016230
公開日2004年12月29日 申請日期2004年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月12日
發(fā)明者唐東芹, 余舜武, 錢虹妹, 黃丹楓, 唐克軒 申請人:上海交通大學(xué)