一種重組高分子型mbl及其制備方法與應(yīng)用的制作方法

專利名稱：一種重組高分子型mbl及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組MBL及其制備方法與應(yīng)用，特別涉及一種重組高分子型MBL及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
MBL(mannose binding lectin，甘露糖結(jié)合凝集素)是涉及先天免疫的血清蛋白。其分子量為32KD，包括羧基末端糖結(jié)合域(CRD)，膠原蛋白域和氨基末端富半胱氨酸區(qū)。三個(gè)MBL分子的膠原蛋白域形成三股螺旋，導(dǎo)致形成三聚體，三聚體的六個(gè)單元通過氨基末端半胱氨酸的分子內(nèi)二硫鍵形成大分子。MBL可與其它蛋白締合，如MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶(MASP 1，MASP 2，或MASP 3)或MBL相關(guān)蛋白(Map19)。MBL的整個(gè)分子形狀與補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(C1q)相似?；钚訫BL的功能也與C1q相似，但是，與C1q不同的是，它通過裂解C4和C2激活補(bǔ)體系統(tǒng)。MBL的活化需要在它們的表面蛋白上結(jié)合具有獨(dú)特糖基化模式的微生物。在該過程中，MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶被激活，且C4和C2以相同方式被裂解，使得C1q相關(guān)絲氨酸蛋白酶(C1r和C1s)通過裂解C3觸發(fā)補(bǔ)體系統(tǒng)而激活。與微生物結(jié)合的MBL也有助于微生物的有效吞噬作用，就好像MBL是調(diào)理素。
目前，MBL基因已經(jīng)被表達(dá)在各種細(xì)胞系中，包括CHO細(xì)胞(Katsuki Ohtani，etal.J.of Immunol.Methods 222，135-144，1999)或HLF肝癌細(xì)胞系或HEK 293 EBNA細(xì)胞系(T.Vorup-Jensen，etal.International Immunopharmacology 1，677-687，2001)。在CHO細(xì)胞系中，高產(chǎn)率表達(dá)是可能的，但回收的MBL主要是單體和二聚體，沒有顯著量的寡聚體。MBL基因在轉(zhuǎn)化的人細(xì)胞系中的表達(dá)產(chǎn)生了明顯更多的寡聚體，但總產(chǎn)率低于1μg/mL培養(yǎng)基。只有高分子量形式的MBL復(fù)合物能激活補(bǔ)體系統(tǒng)。
補(bǔ)體系統(tǒng)的激活對于抵御微生物感染是非常重要的。它不僅為侵入微生物的有效吞噬和直接裂解做準(zhǔn)備，而且有助于有效誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫。到目前為止，還沒有人為處理微生物感染的病人而調(diào)動補(bǔ)體系統(tǒng)的嘗試。
血清中MBL的水平在不同個(gè)體上變化很大，范圍在50ng/mL或更低到超過3μg/mL血清之間變化，這主要是由于遺傳性變異。遺傳性變異包括外顯子上的點(diǎn)突變和啟動子區(qū)突變。通常低水平MBL的個(gè)體易受微生物感染。尤其是，那些具有低水平MBL的新生嬰兒會非常危險(xiǎn)地受微生物感染。根據(jù)一項(xiàng)調(diào)查(Y.Hakozaki，etal.Liver，22，29-34，2002)，由于乙型肝炎病毒感染而經(jīng)受肝功能衰竭的病人的死亡率依賴于MBL的血清水平。高水平MBL(3μg/mL)的病人不會死亡，而80％的低MBL水平的病人會死亡。因此，那些低MBL水平的個(gè)體可能因MBL補(bǔ)充而受益。
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)構(gòu)建了一個(gè)重組酵母細(xì)胞系，其可以產(chǎn)生乙型肝炎病毒包膜蛋白的pre-S區(qū)(PCT/韓國專利申請?zhí)?2/00820；中國專利03102363.0)。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于治療病毒、細(xì)菌或真菌感染的重組高分子型MBL。
本發(fā)明所提供的重組高分子型MBL，是由pMSG-MBL轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞系后表達(dá)得到的寡聚體MBL。
其中，pMSG-MBL是從pMSG(韓國專利KCCM 10202)DNA序列構(gòu)建的，該序列包括β-球蛋白序列的核基質(zhì)附著體區(qū)域成分，SV40聚腺苷酸，胃泌素基因和MBL cDNA的轉(zhuǎn)錄終止序列。MBL cDNA是用PCR方法從人肝臟cDNA文庫制備的。宿主細(xì)胞系是動物細(xì)胞；優(yōu)選為中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，人肝細(xì)胞，和/或人胚腎(HEK)細(xì)胞；最優(yōu)選為中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種制備重組高分子型MBL的方法。
本發(fā)明所提供的制備重組高分子型MBL的方法，是用pMSG-MBL轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞系，被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞系經(jīng)培養(yǎng)篩選出重組高分子型MBL表達(dá)克隆，得到重組高分子型MBL。
其中，宿主細(xì)胞系是動物細(xì)胞，優(yōu)選為中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，人肝細(xì)胞，和/或人胚腎(HEK)細(xì)胞。宿主細(xì)胞系的培養(yǎng)方法包括懸浮培養(yǎng)、將細(xì)胞固定在培養(yǎng)燒瓶或瓶子或生物反應(yīng)器上培養(yǎng)等。
所篩選出的重組高分子型MBL表達(dá)克隆是CHO MBL/D1-3 KCTC 10472BP。所述CHOMBL/D1-3是通過在培養(yǎng)基中加入增量氨甲喋呤(MTX)選擇得到的。
本發(fā)明還提供了純化重組高分子型MBL的方法。可以使用重組pre S或任何其它糖基化蛋白純化重組高分子型MBL。例如，首先將重組pre S(recombinant pre S fromYeast，patent；PCT/KR02/00820)固定在適當(dāng)?shù)闹|(zhì)上，接著裝柱，然后用適當(dāng)?shù)木彌_液平衡該柱，最后在存在鈣離子的情況下將帶有重組高分子型MBL的培養(yǎng)基加樣到該柱上，用含有EDTA或EGTA的緩沖液洗脫重組高分子型MBL。該柱基質(zhì)可以是任何合適的基質(zhì)，例如瓊脂糖。該柱的平衡可以用提供重組高分子型MBL與pre S的最佳結(jié)合的緩沖液進(jìn)行。該緩沖液所含鈣離子的范圍在2mM-20mM之間。該被純化的重組高分子型MBL的來源可以是人血清或任何其它含有重組高分子型MBL的物質(zhì)，如CHO MBL/D1-3的培養(yǎng)基。從柱上洗脫重組高分子型MBL可以用任何含有EDTA或EGTA的溶液進(jìn)行，其中所述溶液所含EDTA或EGTA的濃度范圍在5mM-10mM之間。如果有必要，可以重復(fù)該親和柱步驟。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供重組高分子型MBL的兩種用途。
本發(fā)明所提供的重組高分子型MBL第一種用途是以純化的重組高分子型MBL為活性成分治療微生物(如SARS病毒)感染和/或增強(qiáng)零或低水平血清MBL的個(gè)體免疫力的藥物。
該藥物可以包括水，緩沖液，和/或穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑包括3％到30％的至少一種下述物質(zhì)甘油，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，海藻糖，麥芽糖，白蛋白，和氨基酸。
該藥物還可以包括MBL締合蛋白，如MASP 1，MASP 2，MASP 3，和/或Map19。這些MBL締合蛋白可以是天然源或重組蛋白。
該藥物可以是油懸浮液、溶液或固體形式。如該藥物為固體，可以在給藥之前將該藥物溶解于上述溶液(具體為哪些溶液)中。
該藥物的給藥途徑可以是腹腔注射，皮下腹腔注射，肌肉注射或靜脈內(nèi)注射或一個(gè)組合方法。
上述藥物的建議用量一般為0.2-0.5mg/kg/day療程為15至30天。
本發(fā)明所提供的重組高分子型MBL的第二種用途是作為補(bǔ)體激活觸發(fā)物。
本發(fā)明所提供的補(bǔ)體激活觸發(fā)物是以重組高分子型MBL為活性成分的復(fù)合物。該復(fù)合物是可通過pre S或任何與MBL結(jié)合的糖基化蛋白或肽或甘露糖包被在脂質(zhì)體或PLGA[聚(D，L-乳酸-共-羥基乙酸)]納米顆粒上，然后再與重組高分子型MBL結(jié)合得到的。該復(fù)合物優(yōu)選為重組高分子型MBL-pre S-PLGA復(fù)合物，它是通過包被有pre-S的PLGA納米顆粒結(jié)合重組高分子型MBL得到的，且在存在無MBL的血清的情況下激活補(bǔ)體。納該米顆粒的直徑在10nM-10μM之間。
該補(bǔ)體激活觸發(fā)物可以被廣泛地用于治療微生物如病毒、細(xì)菌和/或真菌感染。
本發(fā)明的重組高分子型MBL與從人血清純化的天然MBL相似，表現(xiàn)出高分子量多聚體型。而且，本發(fā)明的CHO細(xì)胞系尤其是CHO MBL/D1-3產(chǎn)生了大量功能性MBL，這使得將該克隆用于工業(yè)生產(chǎn)MBL成為可能。


圖1A為純化的重組高分子型MBL的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)1B為純化的重組高分子型MBL的Western印跡分析2A為人血漿MBL與糖基化蛋白或甘露聚糖的結(jié)合曲線圖2B為人重組高分子型(rhMBL)與糖基化蛋白或甘露聚糖的結(jié)合曲線圖3為rhMBL的補(bǔ)體激活曲線圖4A為pre S結(jié)合PLGA納米顆粒示意4B為pre S包被的PLGA納米顆粒在水相中的示意5A為PLG-pre S結(jié)合到包被rhMBL免疫板上的PLG結(jié)合體積-OD曲線圖5B為rhMBL結(jié)合到PLG-pre S包被免疫板上的rhMBL結(jié)合濃度-OD曲線圖6為PLG-pre S的C4激活曲線圖7為在逐漸增加量的rhMBL存在下SARS冠狀病毒對FRhk-4細(xì)胞的感染柱狀8A為FRhK-4細(xì)胞在2.5ug/ml的rhMBL中感染SARS病毒的顯微鏡觀察8B為FRhK-4細(xì)胞在0.63ug/ml的rhMBL中感染SARS病毒的顯微鏡觀察8C為FRhK-4細(xì)胞在0.16ug/ml的rhMBL中感染SARS病毒的顯微鏡觀察8D為FRhK-4細(xì)胞在0.02ug/ml的rhMBL中感染SARS病毒的顯微鏡觀察8E為FRhK-4細(xì)胞在0.0024ug/ml的rhMBL中感染SARS病毒的顯微鏡觀察8F為FRhK-4細(xì)胞在對照中感染SARS病毒的顯微鏡觀察圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、重組高分子型MBL的CHO細(xì)胞系的構(gòu)建(1)表達(dá)載體的構(gòu)建MBL cDNA是使用人肝臟cDNA文庫通過PCR方法制備的，它可以被克隆進(jìn)pEZ載體，pEZ-MBL2-5中。核苷酸序列是用儲存在基因庫中的序列(Gene Bank NM_000242)驗(yàn)證的。使用該pEZ-MBL2-5 DNA作為模板，通過PCR方法用正引物(ctagctagccaccatgtccctgtttccatcactc)和反引物(gaagatctcagatagggaactcacagacg)制備的用于MBL表達(dá)的750bp MBL cDNA。這對引物包括用于克隆的Kozak序列和限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。該cDNA被克隆進(jìn)pMSG載體中以制備pMSG-MBL。MBL的序列通過基因庫序列再次得到驗(yàn)證。
(2)pMSG-MBL轉(zhuǎn)染進(jìn)表達(dá)宿主中①pMSG-MBL DNA的制備在pMSG-MBL DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)DH5α[supE44，ΔlacU169(Φ80 lacZΔM15)，hsdR17，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1]大腸桿菌中之后，在含有100μg/mL氨芐青霉素的100mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體。通過使用QUIAPREP質(zhì)粒Midi試劑盒(Quiagen，USA)，從該培養(yǎng)物中制備pMSG-MBL。該pMSG-MBL線性DNA是用Sca I進(jìn)行消化制備得到的。
②制備宿主細(xì)胞將CHO DG44(dhfr-/dhfr-)在含有10％ cFBS的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定細(xì)胞數(shù)。然后調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)，成為在含有10％ cFBS的α-MEM中2×105個(gè)/mL細(xì)胞，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
③轉(zhuǎn)化在室溫下將含有2μg的pMSG-MBL DNA，5.3μL DosperTM，和16ng pDCH1P(Plasmid with DHFR gene，Venolia，etal.1987，Somat.Cell Mol.Genet.13，491-501)的混合物培養(yǎng)45分鐘。然后將該混合物加入到宿主細(xì)胞中，于37攝氏度培養(yǎng)6小時(shí)。培養(yǎng)后，去除培養(yǎng)基，加入3mL含cFBS的新鮮α-MEM。然后在3天后，當(dāng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞增加到足夠多時(shí)，通過胰蛋白酶(trypsine)處理收獲細(xì)胞，且于2mL無核苷的含有10％透析FBS的α-MEM中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)大約10天，培養(yǎng)基每2天換一次。
(3)MBL生產(chǎn)細(xì)胞的選擇和MBL基因的擴(kuò)增通過在培養(yǎng)基中逐漸加入增量的MTX，擴(kuò)增在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)的MBL基因。把轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié)到4×105個(gè)/孔，且在存在10nM MTX的情況下培養(yǎng)，直到細(xì)胞達(dá)到融合狀態(tài)。然后通過類似方式將MTX的濃度增加到1μM。在每一步，使用抗MBL抗體通過Western印跡分析確定MBL表達(dá)水平。MBL的水平隨著MTX濃度的增加而增加，單克隆選自適合于1μM MTX的細(xì)胞。
(4)單個(gè)最佳細(xì)胞的選擇(克隆)對于單細(xì)胞克隆，將1μM MTX適應(yīng)細(xì)胞分配到96孔板中，0.5個(gè)細(xì)胞/孔。該平板在含有10％透析FBS和1μM MTX的α-MEM中培養(yǎng)。大約2周后，當(dāng)單細(xì)胞集落形成時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到24孔板中。當(dāng)細(xì)胞增加到足夠時(shí)，在分析表達(dá)水平后，將細(xì)胞冷凍。所選擇的細(xì)胞系是CHO MBL/D1-3。
按照傳統(tǒng)方法在還原和非還原條件下對重組細(xì)胞系產(chǎn)生的MBL進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳和Western印跡分析，結(jié)果如圖1A和B所示，表明產(chǎn)生的人重組高分子型(rhMBL)(rhMBL)與天然的MBL的聚丙烯酰胺電泳和Western印跡分析圖譜一致。圖1A中，泳道1為非還原條件，rhMBL(1.2μg)；泳道2為還原條件，rhMBL(6μg)；泳道3為非還原條件，血漿MBL(0.3μg)；泳道4為還原條件，血漿MBL(1.5μg)；泳道M為分子量標(biāo)記物。在Western印跡分析中，第一抗體是抗人MBL(1∶1,500稀釋)多克隆抗體，第二抗體是抗小鼠IgG-HRP(1∶5,000稀釋)抗體；圖中泳道1為rhMBL，非還原條件；泳道2為rhMBL，還原條件；泳道3為血漿MBL，非還原條件；泳道4為血漿MBL，還原條件；泳道M為分子量標(biāo)記物。
(5)重組高分子型MBL表達(dá)水平的估算使用CHO MBL/D1-3細(xì)胞系，通過比較來自人血清的已知量的純化MBL估算MBL表達(dá)水平。將5×105個(gè)細(xì)胞在T25燒瓶中培養(yǎng)，T25燒瓶裝有無核苷含有10％透析FBS的α-MEM。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90％融和度時(shí)，用3mL含有5％透析FBS的相同培養(yǎng)基取代上述培養(yǎng)基。4天后，將培養(yǎng)基稀釋10倍，經(jīng)估計(jì)培養(yǎng)基中重組高分子型MBL的量為50μg/106個(gè)細(xì)胞/天。
實(shí)施例2、重組高分子型(rMBL)的純化(1)pre S瓊脂糖柱的制備將1克CNBr活化的瓊脂糖4B懸浮于1mM HCl溶液中，用相同溶液清洗數(shù)次。在pH8.3的含有0.2M NaHCO3和0.5M NaCl的聯(lián)合緩沖液中，將6.4mg pre S與清洗后的瓊脂糖混合，以得到pre S的終濃度為0.5-10mg/mL。于室溫下培養(yǎng)2小時(shí)后，加入含有0.1M tris的封閉緩沖液，pH8.0，并于室溫下保留2小時(shí)。然后用封閉緩沖液清洗pre S-瓊脂糖，通過Western印跡分析評估固定化pre-S的量。
(2)通過使用pre S-瓊脂糖柱純化rMBL通過使用pre S與MBL結(jié)合的性質(zhì)進(jìn)行純化。pre S可以利用本發(fā)明的發(fā)明人構(gòu)建的重組酵母細(xì)胞系(PCT/韓國申請?zhí)?2/00820；中國申請?zhí)?3102363.0)，進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)。pre S-瓊脂糖被填充到柱上，用含有20mM Tris pH7.6，150mM NaCl，10mM CaCl2，和0.05％ Tween 20的MBL結(jié)合緩沖液平衡。將CHO細(xì)胞培養(yǎng)基中或者血清中的MBL加到該柱上，并且用加樣緩沖液進(jìn)行粗放清洗。然后用含有20mM TrispH7.6，150mM NaCl，5mM EDTA，和0.05％ Tween 20的洗脫緩沖液從該柱中洗脫MBL。用這種方式，僅一步就可以產(chǎn)生99.9％的純MBL，如圖1A和1B所示。
實(shí)施例3、rMBL(重組高分子型MBL)功能的證實(shí)rMBL的生物活性已經(jīng)通過兩種不同功能確定(1)rMBL特異性以鈣依賴方式結(jié)合到糖基化蛋白上，和(2)在存在糖基化蛋白和MASPs的情況下激活補(bǔ)體(C4裂解)。
(1)rMBL與糖基化蛋白的結(jié)合①甘露聚糖結(jié)合將在50mM碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液中的甘露聚糖溶液，加樣到Nunc Maxisorp免疫板中，使每孔1μg。于4攝氏度過夜培養(yǎng)，以便用甘露聚糖包被平板。將其用含有20mM Tris pH7.6，150mM NaCl，10mM CaCl2，和0.05％ Tween-20的沖洗緩沖液沖洗4次，并且用0.2％ BSA處理1小時(shí)。在用沖洗緩沖液沖洗平板3次后，在含有20mM Tris pH7.6，1M NaCl，10mM CaCl2，0.1％ BSA，0.05％ Tween-20的100μL結(jié)合緩沖液中加入1μg MBL/孔。于室溫溫育2小時(shí)后，用沖洗緩沖液將平板沖洗6次，并且顯色。首先，將平板用小鼠抗人MBL單克隆抗體(Dobeel，MBL8F6，1∶100稀釋)于室溫溫育2小時(shí)。接著加入抗小鼠IgG-HRP抗體(1∶1500稀釋)，并于室溫下溫育1小時(shí)。最后通過OPD(Sigma，USA)顯色，150μl/孔。通過加入3M HCl終止顯色，50μl/孔。用自動ELISA平板閱讀器(酶標(biāo)儀)于492nm測量OD。
用天然MBL比較甘露聚糖與rMBL的結(jié)合活性。結(jié)果如圖2A和B所示，表明rMBL與從人血清純化的天然MBL的結(jié)合活性相似。兩者都同樣以劑量依賴的方式結(jié)合甘露聚糖，但不能與BSA結(jié)合。
②rMBL與pre S的結(jié)合使用與MBL和甘露聚糖結(jié)合相同的方法，使用1μg pre S完成MBL與pre S的結(jié)合。用天然MBL比較甘露聚糖與rMBL的結(jié)合活性。結(jié)果如圖2A和B所示，表明rMBL與從人血清純化的天然MBL的結(jié)合活性相似。兩者都同樣以劑量依賴的方式結(jié)合preS，但不能與BSA結(jié)合。
(2)rMBL的補(bǔ)體激活①用甘露聚糖包被板進(jìn)行補(bǔ)體激活如(1)中①所述用1μg/孔甘露聚糖包被Nunc Maxisorp免疫板孔，將該平板于室溫下用rMBL溫育。不含血清的MBL被用作MASPs(MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶)的來源。在溫育2小時(shí)后，用清洗緩沖液將平板清洗6次，并且于室溫下用500ng/孔C4溫育。然后，將其于室溫下用抗C4抗體-HRP溫育1小時(shí)，通過加入150μL OPD顯色。20分鐘后，加入3M HCl終止顯色反應(yīng)，50μL/孔，于492nm測量OD值。該實(shí)驗(yàn)顯示了rMBL具有相對于C4裂解血清MBL的可相比美的活性。
②用pre S包被板進(jìn)行補(bǔ)體激活用與(2)中①類似的方式，用pre S包被(1μg/孔)板確定MBL補(bǔ)體激活活性。結(jié)果如圖3所示，表明pre S在MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶的激活上比甘露聚糖好。
實(shí)施例4、作為補(bǔ)體激活觸發(fā)物的重組高分子型MBL復(fù)合物(1)pre S包被納米顆粒的制備①PLGA納米顆粒的制備將分子量范圍為1,000-100,000的聚(D，L-lactic-co-glycolic acid)[PLGA]溶解于有機(jī)溶劑中，如甲醇或二氯甲烷中。然后將其分散到SDS或Tween溶液中，在猛烈攪拌的同時(shí)保持過夜。從中回收納米顆粒。
②PEG與納米顆粒的共軛使用具有雜官能反應(yīng)基團(tuán)(X-PEG-Y)的聚(乙二醇)[PEG]。在有機(jī)溶劑或水溶液中，反應(yīng)基團(tuán)X被激活，然后在納米顆粒上與反應(yīng)基團(tuán)(-OH，-COOH)共軛。在該共軛中所用的連接物(X-)可以是如下述化學(xué)基團(tuán)
③pre S與共軛到PEG上的納米顆粒的共軛pre S的共軛可以通過賴氨酸或精氨酸上的ε-胺或N-末端胺實(shí)現(xiàn)。C-末端或ε-羧酸也可以被使用，以進(jìn)行pre S與共軛到納米顆粒上的PEG的共軛。在這些游離Y反應(yīng)基團(tuán)中，PEG可以被共軛到pre S上的羧酸或胺上。其中連接物(Y-)可以是下述化學(xué)基團(tuán) pre S與共軛到PEG上的納米顆粒的共軛示意圖如圖4A和圖4B所示。關(guān)于蛋白質(zhì)與PLGA納米顆粒結(jié)合的詳細(xì)操作程序在以前的出版物中有描述(H.S.Yoo et al，J.Controlled Release，82，17-27，2002 and S.H.Choi and T.G.Park，Intl.J.Pharmaceutics，203，193-202，2000)。pre S與一個(gè)PLGA顆粒結(jié)合的數(shù)量為100,000-300,000個(gè)。
(2)pre S-PLGA作為MBL激活的功能分子按照實(shí)施例3中pre S與rhMBL結(jié)合的方法完成rhMBL與pre S-PLGA的結(jié)合，以及通過rhMBL-pre S-PLGA復(fù)合物實(shí)現(xiàn)補(bǔ)體激活。結(jié)果分別如圖5A和B及圖6所示，圖5A表明補(bǔ)體激活由PLG-pre S的量決定；圖5B表明補(bǔ)體激活由rhMBL的增加量決定；圖6表明隨著PLG-pre s數(shù)量的增加，rhMBL締合的MASPs被激活到分裂C4上。圖5A和B及圖6中，PLG-pre S<C>表示PEG被共軛到pre S的羧基上；PLG-preS<N>表示PEG被共軛到pre S的胺基上。在此，發(fā)現(xiàn)MBL包被板不能用于補(bǔ)體激活作用大概由于阻滯了MASPs與被固定的MBL在固體表面的締和。因此，還在水相中進(jìn)行了補(bǔ)體激活作用的測定，PLGA-pre S與共軛到PEG上的納米顆粒的共軛、MBL、MASPs和C4。從這個(gè)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，單體的pre S與共軛到PEG上的納米顆粒的共軛，不同于PLGA-pre S與共軛到PEG上的納米顆粒的共軛，不能穩(wěn)定的與MBL復(fù)合，也不能激活MBL與MASPs聯(lián)合的補(bǔ)體活化作用。
實(shí)施例5、rhMBL對SARS冠狀病毒的中和作用用不同數(shù)量的含rhMBL培養(yǎng)基進(jìn)行胎兒恒河猴腎細(xì)胞(FRhk-4)感染SARS冠狀病毒的試驗(yàn)，結(jié)果如圖7和圖8A-F所示，圖7表明2.5ug/ml的rhMBL能阻滯病毒的感染，與沒有rhMBL存在的細(xì)胞相比，能降低病毒感染至15％以下。圖8A-F表明，在2.5ug/ml的MBL存在下，顯微鏡圖顯示有健康的細(xì)胞。而無MBL存在下，感染病毒的細(xì)胞只顯示有死亡和腫大的細(xì)胞?？紤]到人類血清中正常的MBL水平為2.5ug/ml，rhMBL在生理濃度下阻滯SARS冠狀病毒。關(guān)于SARS冠狀病毒的生長和通過RT-PCR病毒檢測的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)在以前的出版物中已有描述(Ksiazek T.G.et al，N.Engl.J.Med.2003；348，201953-66 and Peiris J.S.et al，Lancet 2003；361，93661319-25)。
權(quán)利要求
1.一種重組高分子型MBL，是由pMSG-MBL轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞系后表達(dá)得到的寡聚體MBL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組高分子型MBL，其特征在于所述宿主細(xì)胞系為動物細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組高分子型MBL，其特征在于所述宿主細(xì)胞系為中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，人肝細(xì)胞，和/或人胚腎(HEK)細(xì)胞。
4.一種制備權(quán)利要求1所述重組高分子型MBL的方法，是用pMSG-MBL轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞系，被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞系經(jīng)培養(yǎng)篩選出重組高分子型MBL表達(dá)克隆，得到重組高分子型MBL。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述宿主細(xì)胞系是動物細(xì)胞，優(yōu)選為中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，人肝細(xì)胞，和/或人胚腎(HEK)細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述宿主細(xì)胞系的培養(yǎng)方法包括懸浮培養(yǎng)、將細(xì)胞固定在培養(yǎng)燒瓶或瓶子或生物反應(yīng)器上培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述篩選出的重組高分子型MBL表達(dá)克隆是CHO MBL/D1-3 KCTC 10472BP。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述CHO MBL/D1-3是通過在培養(yǎng)基中加入增量氨甲喋呤(MTX)選擇得到的。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述方法還包括純化重組高分子型MBL的方法，即使用重組pre S或任何其它糖基化蛋白純化重組高分子型MBL。
10.一種以純化的重組高分子型MBL為活性成分治療微生物感染和/或增強(qiáng)零或低水平血清MBL的個(gè)體免疫力的藥物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物，其特征在于所述藥物中還包括水，緩沖液，和/或穩(wěn)定劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥物，其特征在于所述穩(wěn)定劑包括3％到30％的至少一種下述物質(zhì)甘油，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，海藻糖，麥芽糖，白蛋白，和氨基酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求10、11或12所述的藥物，其特征在于所述藥物中還包括MASP1，MASP 2，MASP 3，和/或Map19。
14.根據(jù)權(quán)利要求10、11或12所述的藥物，其特征在于所述藥物為油懸浮液、溶液或固體形式。
15.一種以重組高分子型MBL為活性成分的補(bǔ)體激活觸發(fā)物，是通過pre S或與MBL結(jié)合的糖基化蛋白或肽或甘露糖包被在脂質(zhì)體或PLGA納米顆粒上，然后再與重組高分子型MBL結(jié)合得到的復(fù)合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的補(bǔ)體激活觸發(fā)物，其特征在于所述補(bǔ)體激活觸發(fā)物為重組高分子型MBL-pre S-PLGA復(fù)合物；所述納米顆粒的直徑為10nM-10μM。
17.權(quán)利要求1-3所述的重組高分子型MBL在制備治療病毒、細(xì)菌和/或真菌感染藥物中的應(yīng)用。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其特征在于所述病毒為SARS病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組高分子型MBL及其制備方法與應(yīng)用，目的是提供一種用于治療病毒、細(xì)菌或真菌感染的重組高分子型MBL。本發(fā)明所提供的重組高分子型MBL，是由pMSG－MBL轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞系后表達(dá)得到的寡聚體MBL。本發(fā)明還提供了該重組高分子型MBL的制備方法，即用pMSG－MBL轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞系，被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞系經(jīng)培養(yǎng)篩選出重組高分子型MBL表達(dá)克隆，得到重組高分子型MBL。本發(fā)明還提供了以重組高分子型MBL為活性成分治療微生物感染和/或增強(qiáng)零或低水平血清MBL的個(gè)體免疫力的藥物。本發(fā)明的以重組高分子型MBL為活性成分的補(bǔ)體激活觸發(fā)物可用于治療病毒、細(xì)菌和/或真菌感染。
文檔編號C12N15/09GK1572874SQ03149970
公開日2005年2月2日 申請日期2003年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月24日
發(fā)明者文洪模 申請人:文洪模, 阮北耀, 儀忠軍