專利名稱：脫乙酰殼多糖和殼多糖的生產(chǎn)的制作方法
殼多糖是β-(1，4)-D-葡糖胺的高度不溶性的N-乙?；酆衔铩Ｃ撘阴ざ嗵鞘菤ざ嗵堑乃崛苄悦撘阴；问健ざ嗵?、脫乙酰殼多糖及其衍生物具有多種工業(yè)用途，包括生產(chǎn)粘度控制劑、粘合劑、層析載體、增加紙張強度的試劑、絮凝劑、食品添加劑、藥物和化妝品。
通過使蟹或蝦殼去蛋白質(zhì)化和去鈣化可制備殼多糖。用熱堿溶液使殼多糖脫乙?；傻玫矫撘阴ざ嗵?。這種生產(chǎn)脫乙酰殼多糖的方法具有很多不利的特點，例如，該方法需要昂貴的熱能和對健康有潛在危害的苛性堿。該方法還產(chǎn)生大量廢料，因此必需大筆處理費用。另外，蝦或蟹殼的供應在很大程度上取決于季節(jié)和環(huán)境因素，對生產(chǎn)能力造成無法預料的限制。
本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)真菌Actinomucor taiwanensis和真菌Rhizopus azygosporus可產(chǎn)生異常高產(chǎn)量的脫乙酰殼多糖和殼多糖。
因此，本發(fā)明包括生產(chǎn)脫乙酰殼多糖或殼多糖的方法，所述方法的特征在于(1)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)Rhizopus azygosporus真菌或Actinomucor taiwanensis真菌以形成培養(yǎng)物，和(2)從細胞中分離脫乙酰殼多糖或殼多糖。例如，通過將真菌細胞與培養(yǎng)物分開并將脫乙酰殼多糖或殼多糖從分離出的細胞分離出來即可從培養(yǎng)物中分離得到脫乙酰殼多糖和殼多糖。
本發(fā)明還包括生產(chǎn)脫乙酰殼多糖或殼多糖的方法，所述方法包括(1)在對本發(fā)明方法有用的培養(yǎng)基中培養(yǎng)毛霉科真菌以形成培養(yǎng)物，和(2)從所得真菌培養(yǎng)物中分離出脫乙酰殼多糖或殼多糖。
對本發(fā)明方法有用的培養(yǎng)基可包括約5至60g/L(如約30g/L)的玉米浸出汁，約10至100g/L(如約50g/L)的葡萄糖，約0.01至30g/L(如約2.5g/L)的硫酸銨或其它適當組分。
本發(fā)明的方法能由含有Rhizopus azygosporus或Actinomucortaiwanensis真菌的培養(yǎng)物異常高產(chǎn)量地生產(chǎn)脫乙酰殼多糖或殼多糖。另外，我們發(fā)現(xiàn)含有玉米浸出汁、葡萄糖、酵母浸膏和硫酸銨的培養(yǎng)基能使真菌培養(yǎng)物的殼多糖和脫乙酰殼多糖產(chǎn)出量增加。因此，本發(fā)明的方法提供了另一種生產(chǎn)殼多糖和脫乙酰殼多糖的方法，而無需依賴對環(huán)境有害的化學物質(zhì)或甲殼類動物易變的產(chǎn)量。
從下列詳細描述和權(quán)利要求書中顯而易見本發(fā)明的其它特征或優(yōu)點。
本發(fā)明涉及由屬于毛霉科的真菌培養(yǎng)物大量生產(chǎn)脫乙酰殼多糖或殼多糖。
可用于本發(fā)明方法的具體真菌包括Rhizopus azygosporus或Actinomucor taiwanensis。可從臺灣食品工業(yè)和研究開發(fā)研究所(中國臺灣新竹300 Shih-Ping路331號)的培養(yǎng)物保藏和研究中心(CCRC)請求得到這兩種微生物，R.azygosporus的保藏目錄號為CCRC31158，A.taiwanensis的保藏目錄號為CCRC31159。
培養(yǎng)真菌的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，可用真菌接種YM瓊脂，于25℃至37℃將經(jīng)接種的瓊脂保溫3至6天。將得自真菌的孢子懸浮于液體中以得到104至107cfu/ml的原種。用該原種直接接種發(fā)酵培養(yǎng)基。
發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為3至8，其可含有10至100g/L碳源(如葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、糖蜜或豆油)、5至60g/L氮源(如豆粉、蛋白胨或玉米浸出汁)、0.5至20g/L酵母浸膏、0.01至30g/L(NH4)2SO4、0至3g/L K2HPO4、0至3g/L NaCl、0至1 5g/L MgSO4·7H2O和/或0至0.3g/L CaCl2。將真菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中再培養(yǎng)2至4天。
可使用標準方法從真菌菌絲體中分離和純化脫乙酰殼多糖。例如，可按McGahren等人，生物化學方法，1988-90，1984中所述，使用堿和酸處理以分離脫乙酰殼多糖。分離脫乙酰殼多糖的其它細節(jié)和步驟可參見歐洲申請0531991 A2；Yokoi等人，發(fā)酵與生物工程雜志，85246-249，1998；美國專利5,232,842；Rane等人，食品生物技術(shù)，711-33，1993；和Hang，生物技術(shù)通訊，12911-912，1990。
一般，從發(fā)酵肉湯中分離出細胞塊并用蒸餾水洗滌。然后用0.5至2N NaOH處理細胞，將該堿性混合物于121℃保溫15分鐘。離心沉淀固體物并用蒸餾水和乙醇洗滌。用2％醋酸溶液處理經(jīng)洗滌過的沉淀物，并于95℃保溫12小時。離心分離所得懸浮液，產(chǎn)生酸溶性上清液(含有脫乙酰殼多糖)和酸不溶性沉淀物(含有殼多糖)。
用2N NaOH將上清液的pH調(diào)節(jié)至10，從而沉淀出脫乙酰殼多糖。最后用蒸餾水洗滌脫乙酰殼多糖并凍干。酸不溶性的沉淀物也用蒸餾水洗滌并凍干。該酸不溶性和堿不溶性組分是純化的殼多糖。
無需進一步詳述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于上述內(nèi)容和下文的描述最大程度地利用本發(fā)明。下列實施例僅用于闡明本領(lǐng)域技術(shù)人員如何實施本發(fā)明，而不以任何方式限制其所公開的內(nèi)容。說明書中提及的任何出版物都列入本文作為參考。
下列實施例的結(jié)果簡述于實施例后出現(xiàn)的表1。
實施例1將Rhizopus azygosporus 4天斜面培養(yǎng)物的孢子懸浮液直接接種于含有100ml新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中。于28℃，以200rpm振蕩發(fā)酵48小時。每升培養(yǎng)基含有10g氮源(豆粉、蛋白胨或玉米浸出汁)、20g碳源(葡萄糖或玉米淀粉)、1g酵母浸膏、5g(NH4)2SO4、1gK2HPO4、1g NaCl、5g MgSO4·7H2O和0.1g CaCl2。
從發(fā)酵肉湯中回收細胞塊，于121℃用1N NaOH處理細胞15分鐘，將堿不溶性物質(zhì)懸浮于2％醋酸中，于95℃將所得混合物保溫12小時以溶解脫乙酰殼多糖。通過將酸溶性上清液的pH調(diào)節(jié)至10以沉淀出脫乙酰殼多糖。然后洗滌，干燥和稱重脫乙酰殼多糖。對酸不溶性物質(zhì)殼多糖也進行洗滌，干燥和稱重。以每升培養(yǎng)物中殼多糖或脫乙酰殼多糖的克數(shù)計算產(chǎn)量，結(jié)果示于表1。使用含有玉米淀粉和蛋白胨的培養(yǎng)基得到了最高產(chǎn)量的殼多糖和脫乙酰殼多糖。
實施例2將Actinomucor taiwanensis 4天斜面培養(yǎng)物的孢子懸浮液直接接種于含有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中。按實施例1所述進行發(fā)酵和脫乙酰殼多糖和殼多糖的分離，結(jié)果示于表1。使用含有玉米浸出汁和葡萄糖的培養(yǎng)基得到了最高產(chǎn)量的殼多糖和脫乙酰殼多糖。
實施例3按實施例1所述培養(yǎng)和處理R.azygosporus，所不同的是所有培養(yǎng)基含有蛋白胨作為氮源，碳源在葡萄糖、玉米淀粉、蔗糖、糖蜜和豆油中變動。玉米淀粉的加入使脫乙酰殼多糖和殼多糖達到0.9g/L的高產(chǎn)量，而豆油的加入使本實施例中殼多糖的最高產(chǎn)量為1.5g/L(表1)。
實施例4按實施例2所述培養(yǎng)和處理A.taiwanensis，所不同的是所有培養(yǎng)基含有玉米浸出汁作為氮源，碳源在葡萄糖、玉米淀粉、蔗糖、糖蜜和豆油中變動。作為碳源的葡萄糖的加入使本實施例中殼多糖和脫乙酰殼多糖達到最高產(chǎn)量(表1)。
實施例5按實施例1所述培養(yǎng)和處理R.azygosporus，所不同的是每升培養(yǎng)基含有30g玉米浸出汁，50g葡萄糖，2g酵母浸膏，2.5g(NH4)2SO4和0.05g CaCl2。此培養(yǎng)物的脫乙酰殼多糖產(chǎn)量高達1.1g/L(表1)。
實施例6按實施例2所述培養(yǎng)和處理A.taiwanensis，所不同的是每升培養(yǎng)基含有30g玉米浸出汁，50g葡萄糖，2g酵母浸膏，2.5g(NH4)25O4和0.05g CaCl2。此培養(yǎng)物的脫乙酰殼多糖(1.7g/L)和殼多糖(1.1g/L)的聯(lián)合產(chǎn)量最高(表1)。
實施例7按實施例6所述培養(yǎng)和處理A.taiwanensis，所不同的是每升培養(yǎng)基含有0.5g K2HPO4以取代CaCl2。此培養(yǎng)物的脫乙酰殼多糖產(chǎn)量高達1.4g/L。
表1中所用縮寫如下“R.a.”表示Rhizopus azygosporus；“A.t.”表示Actinomucor taiwanensis，“S.M.”表示豆粉；“C.S.L.”表示玉米浸出汁；“C.S.”表示玉米淀粉；“S.O.”表示豆油。表1中描述的所有培養(yǎng)物都含有酵母浸膏。
上述實施例1至7的結(jié)果表明(1)A.taiwanensis和R.azygosporus是殼多糖和脫乙酰殼多糖的超級生產(chǎn)者，(2)含有玉米浸出汁、葡萄糖和硫酸銨的培養(yǎng)基可增加由真菌產(chǎn)生的殼多糖和脫乙酰殼多糖的產(chǎn)量。
應理解盡管結(jié)合詳細描述描述了本發(fā)明，但上述描述僅想闡明而不是限制由所附權(quán)利要求書的范圍所限定的本發(fā)明范圍。其它方面、優(yōu)點和改動也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
表權(quán)利要求
1.生產(chǎn)脫乙酰殼多糖或殼多糖的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)Rhizopus azygosporus真菌以形成培養(yǎng)物，并從培養(yǎng)物中分離脫乙酰殼多糖或殼多糖。
2.權(quán)利要求1的方法，進一步包括從培養(yǎng)物中分離真菌細胞，其中從所述分離出的真菌細胞中分離脫乙酰殼多糖或殼多糖。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述培養(yǎng)基含有5至60g/L的玉米浸出汁。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述培養(yǎng)基含有30g/L的玉米浸出汁。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述培養(yǎng)基還含有10至100g/L的葡萄糖和0.01至30g/L的硫酸銨。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述培養(yǎng)基含有30g/L的玉米浸出汁，50g/L的葡萄糖和2.5g/L的硫酸銨。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基含有5至60g/L的玉米浸出汁，10至100g/L的葡萄糖和0.01至30g/L的硫酸銨。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述培養(yǎng)基含有30g/L的玉米浸出汁，50g/L的葡萄糖和2.5g/L的硫酸銨。
9.生產(chǎn)脫乙酰殼多糖或殼多糖的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)毛霉科真菌以形成培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)基含有5至60g/L的玉米浸出汁，10至100g/L的葡萄糖，0.01至30g/L的硫酸銨；和從真菌培養(yǎng)物中分離脫乙酰殼多糖或殼多糖。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述培養(yǎng)基含有30g/L的玉米浸出汁。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述培養(yǎng)基含有50g/L的葡萄糖。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述培養(yǎng)基含有2.5g/L的硫酸銨。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)Rhizopus azygosporus真菌或Actinomucor taiwanensis真菌并從培養(yǎng)物中分離脫乙酰殼多糖或殼多糖以生產(chǎn)殼多糖或脫乙酰殼多糖的方法。
文檔編號C12P19/26GK1515676SQ0312003
公開日2004年7月28日 申請日期2000年7月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月8日
發(fā)明者陳美惠, 陳慶源, 吳志律, 莊淑惠, 黃英娥, 陳彥霖, 袁國芳 申請人:食品工業(yè)發(fā)展研究所