專利名稱：一種新的褐藻膠裂合酶及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的褐藻膠裂合酶及其制備方法和應(yīng)用。
在一般的褐藻膠裂合酶的制備方法中，經(jīng)常采用硫酸銨分級(jí)沉淀或凝膠色譜等方法，并且最后進(jìn)行離心冷凍干燥，這些制造方法的缺點(diǎn)是試驗(yàn)步驟復(fù)雜，流程長，成本高。另外，在制備該類褐藻膠裂合酶的純化過程中，原料褐藻膠與產(chǎn)物酶往往結(jié)合導(dǎo)致最終產(chǎn)物產(chǎn)率過低，這更是現(xiàn)有的制備方法急待解決的問題。
一種新的褐藻膠裂合酶，其特征是來源于海洋弧菌，分子量為28.5kD，該酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，最適pH為7.1。
一種褐藻膠裂合酶的制備方法，包括配制培養(yǎng)基，滅菌后接入弧菌，然后在恒溫?fù)u床振蕩發(fā)酵，其特征是將所得發(fā)酵液除菌后用微孔濾膜過濾，對(duì)上清液進(jìn)行壓濾濃縮至干，再用疏水層析除去與產(chǎn)品結(jié)合的褐藻膠。
用本發(fā)明的方法制得的褐藻膠裂合酶將褐藻膠酶解生產(chǎn)褐藻寡糖。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.本發(fā)明中的褐藻膠裂合酶活力高，生產(chǎn)褐藻寡糖需要的反應(yīng)條件溫和，作用時(shí)間短；2.本發(fā)明中的褐藻膠裂合酶溫度穩(wěn)定性好，-20℃時(shí)保存6個(gè)月仍能保證95％的活力，并在pH5-10的條件下均很穩(wěn)定，適于長時(shí)間保藏和運(yùn)輸；3.本發(fā)明中的褐藻膠裂合酶具有底物和產(chǎn)物專一性，專一作用于多聚甘露糖醛酸(poly(M))，酶解產(chǎn)物集中在聚合度為3-15的褐藻寡糖；4.本發(fā)明中的褐藻膠裂合酶制備方法中培養(yǎng)基配制簡單，發(fā)酵液中雜蛋白含量少，分離無需其它化學(xué)試劑，直接采用微孔濾膜過濾，簡單快捷，成本低；5.本發(fā)明中的疏水層析有效地除去了產(chǎn)品中多余的褐藻膠，使最終酶產(chǎn)率得以大幅提高。
及
具體實(shí)施例方式附圖1為本發(fā)明的褐藻膠裂合酶的SDS-PAGE圖譜；附圖2為本發(fā)明的褐藻膠裂合酶的相對(duì)活性與溫度的關(guān)系圖。
附圖3為本發(fā)明的褐藻膠裂合酶的相對(duì)活性與pH的關(guān)系圖。
按本發(fā)明的方法制備褐藻膠裂合酶時(shí)，先配制培養(yǎng)基，滅菌后接入弧菌，然后在恒溫?fù)u床振蕩發(fā)酵，所述的培養(yǎng)基由褐藻酸鈉、MgSO4、FeSO4、(NH4)2SO4、NaH2PO4、Na2HPO4·3H2O、NaCl，它們的重量比例為1∶0.01-0.04∶0.01-0.04∶0.1-0.4∶0.3-1.0∶0.5-2∶1-3。本實(shí)施例中各組份的重量仟克數(shù)依次為1、0.01、0.01、0.2、0.5、1、3。滅菌溫度為115-121℃，時(shí)間為15-30min。所述的弧菌為Vibrio sp.QY102，它與培養(yǎng)基按5-10∶100重量比接種量接種，然后在25-37℃下以200r/min發(fā)酵培養(yǎng)15-20小時(shí)，再將所得發(fā)酵液在4℃10000g-12000g，離心10min除菌體。選用孔徑為0.22μm或0.45μm的微孔濾膜，在室溫或4℃的低溫對(duì)上清液進(jìn)行壓濾濃縮至干，用1/10體積0.5-1.0mol/L的(NH4)2SO4水溶液溶解，離心除去沉淀后上疏水層析柱，用水洗脫即得褐藻膠裂合酶(凝膠色譜純)。酶活約2000-3000單位/毫升。
本發(fā)明中的褐藻膠裂合酶以十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測分子量，結(jié)果如圖1，純化后的酶在電泳凝膠上顯示為單一條帶，其分子量為28.5kD(千道爾頓)。在不同的溫度及pH條件下測定其酶活力，結(jié)果如附圖2和附圖3，該褐藻膠裂合酶最適反應(yīng)溫度為40℃，最適反應(yīng)pH為7.1。分別用聚甘露糖醛酸(poly(M))和聚古羅糖醛酸(poly(G))為底物檢測該褐藻膠裂合酶的活性，表明該酶具有專一作用于多聚甘露糖醛酸(poly(M))的活性。該褐藻膠裂合酶在-20℃下保藏半年，活性保持95％以上。
用本發(fā)明中的褐藻膠裂合酶由褐藻膠生產(chǎn)褐藻寡糖時(shí)，將褐藻膠(平均分子量20000)配成重量百分比濃度為0.3-1％的水溶液，按重量比1∶100的比例將褐藻膠裂合酶加入褐藻膠水溶液中，在40℃溫度下培育6-12小時(shí)，60％-80％的產(chǎn)物為聚合度為3-15的褐藻寡糖。其中褐藻膠裂合酶的用量為褐藻膠水溶液的0.1-1∶100(重量比)，酶解溫度為35-40℃，酶解反應(yīng)時(shí)間為4-12小時(shí)。用本發(fā)明中的褐藻膠裂合酶制備褐藻寡糖，反應(yīng)條件溫和，易于控制，產(chǎn)物專一，明顯優(yōu)于化學(xué)和物理降解，適合于工業(yè)化生產(chǎn)褐藻寡糖。
權(quán)利要求
1.一種新的褐藻膠裂合酶，其特征是來源于海洋弧菌，分子量為28.5kD，該酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，最適pH為7.1。
2.一種褐藻膠裂合酶的制備方法，包括配制培養(yǎng)基，滅菌后接入弧菌，然后在恒溫?fù)u床振蕩發(fā)酵，其特征是將所得發(fā)酵液除菌后用微孔濾膜過濾，對(duì)上清液進(jìn)行壓濾濃縮至干，再用疏水層析除去與產(chǎn)品結(jié)合的褐藻膠。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是所述的微孔濾膜孔徑為0.22μm或0.45μm，所述的對(duì)上清液進(jìn)行壓濾濃縮的溫度為室溫或4℃的低溫。
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是所述的疏水層析柱使用0.5-1.0mol/L(NH4)2SO4水溶解上，并用水洗脫。
5.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是培養(yǎng)基含有褐藻酸鈉、MgSO4、FeSO4、(NH4)2SO4、NaH2PO4、Na2HPO4·3H2O、NaCl，它們的重量比例為1∶0.01-0.04∶0.01-0.04∶0.1-0.4∶0.3-1.0∶0.5-2∶1-3。
6.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是所述的弧菌為Vibrio sp.QY102，它的接入量與培養(yǎng)基的重量比為1-10∶100。
7.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是滅菌溫度為115-121℃，時(shí)間為15-30min。
8.用本發(fā)明中的褐藻膠裂合酶將褐藻膠酶解生產(chǎn)褐藻寡糖。
全文摘要
一種褐藻膠裂合酶的制備方法，包括配制培養(yǎng)基，滅菌后接入弧菌，然后在恒溫?fù)u床振蕩發(fā)酵，其特征是將所得發(fā)酵液除菌后用微孔濾膜過濾，對(duì)上清液進(jìn)行壓濾濃縮至干，再用疏水層析除去與產(chǎn)品結(jié)合的褐藻膠。優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明中的褐藻膠裂合酶活力高，用它生產(chǎn)褐藻寡糖需要的反應(yīng)條件溫和，作用時(shí)間短；溫度穩(wěn)定性好，并在pH5－10的條件下均很穩(wěn)定；具有底物和產(chǎn)物專一性，專一作用于多聚甘露糖醛酸制備方法中培養(yǎng)基，配制簡單，發(fā)酵液中雜蛋白含量少，分離無需其它化學(xué)試劑，直接采用微孔濾膜過濾，簡單快捷，成本低。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1454992SQ0311227
公開日2003年11月12日 申請(qǐng)日期2003年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月16日
發(fā)明者于文功, 李京寶, 韓峰, 路新枝, 宮倩紅 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué)