專利名稱:一種敗血癥檢測芯片及其制備工藝和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)體外診斷技術(shù),具體的講是一種基因芯片——一種敗血癥檢測芯片及其制備工藝和使用方法。
背景技術(shù):
敗血癥是常見的臨床疾病,幾乎在各個科室均可能出現(xiàn)。雖然目前醫(yī)療水平提高,新藥物新療法不斷出現(xiàn),敗血癥的發(fā)病率顯著降低,但嚴(yán)重的敗血癥一旦出現(xiàn)往往是致命的。因而能否得到及時恰當(dāng)?shù)闹委熀艽蟪潭壬先Q于診斷是否準(zhǔn)確迅速。有多種因素影響敗血癥的治療效果,可概括的分為致病菌的毒力,患者自身的免疫力以及醫(yī)療護(hù)理情況。日益增加的抗生素的使用使臨床治療不得不面臨致病菌耐藥問題,以及由此所造成的人力、物力的浪費(fèi)。致病菌種類多種多樣,各種屬的理化性質(zhì)和耐藥特性不同,甚至同種屬中、不同亞型間致病毒力差異都很大,同樣給臨床治療造成很大麻煩。
傳統(tǒng)檢測敗血癥致病菌的方法包括革蘭氏染色,基于抗體的免疫法檢測和細(xì)菌培養(yǎng)等。鏡檢簡單快速,卻需要有相當(dāng)數(shù)量的細(xì)菌??贵w檢測雖然速度較快,但一次只能檢測一種抗體,效率低。細(xì)菌培養(yǎng)將靈敏度提高了,培養(yǎng)時間卻成為不可逾越的障礙。而且抗生素的應(yīng)用還可以造成革蘭氏染色及細(xì)菌培養(yǎng)的假陰性結(jié)果。發(fā)明一種高效高靈敏度的檢測方法成為必需。
發(fā)明內(nèi)容
1、發(fā)明目的本發(fā)明提供一種敗血癥檢測芯片及其制備工藝和使用方法,其目的在于解決敗血癥檢測中存在的效率低、診斷不準(zhǔn)確等方面存在的問題。
2、技術(shù)方案本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來加以實(shí)現(xiàn)的一種敗血癥檢測芯片及其制備工藝和使用方法,其特征在于該芯片為玻璃基片上分布有多個不同區(qū)域的微陣列,在每個微陣列區(qū)域中,分別固定有常見的敗血癥致病菌的特異性探針。
探針的大小為15-20個堿基,設(shè)計60個探針,所設(shè)計的探針序列見下文;本發(fā)明制備工藝按如下步驟進(jìn)行(1)、設(shè)計敗血癥特異性探針和引物;從數(shù)據(jù)庫中獲得可靠的敗血癥致病菌基因序列,根據(jù)所述的探針序列設(shè)計探針;從數(shù)據(jù)庫中獲得可靠的敗血癥致病菌病毒基因序列,選擇同用引物F4825`-CGGCTAACTC TGTGCCAGC;R789ATCTATGGGA CCATCAGGTACGG-5`針對16s部分基因序列進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增同時標(biāo)記熒光素;(2)、合成探針;(3)、制備芯片;用去離子水將合成的探針溶解,濃度為200mmol/l,在玻璃基片上進(jìn)行點(diǎn)樣;點(diǎn)好的芯片于37℃下水化3天,然后在80℃下烘干2小時;以探針緩沖液及蒸餾水沖洗玻片,吹干;以封閉液封閉玻片,之后洗滌3次,吹干備用。
對待測血樣的預(yù)處理過程中,PCR擴(kuò)增引物序列見下文;探針5’端加氨基修飾。
點(diǎn)樣從幾十點(diǎn)到上千點(diǎn),點(diǎn)的大小為50-100微米左右。
探針緩沖液為1xSSC,0.1%SDS;封閉液為1%BSA,PH=7 0.01mol/l PB。使用方法按如下步驟進(jìn)行(1)取病人靜脈血3-5毫升,分別提取DNA,備用;如需長時間放置,在-20℃下凍存;(2).PCR擴(kuò)增在反應(yīng)管中加入擴(kuò)增反應(yīng)混合物——Taq酶,相應(yīng)的處理好的樣品和引物,足量的dNTP以及熒光素Cy3標(biāo)記的dUTP;擴(kuò)增條件如下94℃ 5min94℃ 30sec56℃ 30sec72℃ 1min72℃ 5min以上步驟為30個循環(huán);(3).雜交;PCR產(chǎn)物與芯片上的探針在60℃下雜交2小時,雜交緩沖液(10xSSC,0.1%SDS)與PCR產(chǎn)物的比例為1∶1,洗滌3次。
(4).檢測;用掃描儀掃描雜交后的芯片,得到圖像并輸出結(jié)果;
(5).數(shù)據(jù)分析將芯片分析結(jié)果輸出。
3、優(yōu)點(diǎn)及效果基因芯片是近幾年在高科技領(lǐng)域內(nèi)出現(xiàn)的最具時代特征的重大科技進(jìn)展之一,它是物理學(xué)、化學(xué)、微電子學(xué)、精密機(jī)械與生命科學(xué)交叉綜合的高科技?;蛐酒傻牟皇请娮釉骷?,采用在位組合化學(xué)、微電子芯片光刻技術(shù),或者利用其它方法將大量特定序列的DNA探針有序地固定在基片上,在與待測樣品DNA作用后,即可檢測到大量的生命信息,包括基因識別、基因突變和基因表達(dá)等。利用基因芯片可以快速、高效地獲取或處理大量的生命信息,它對生命科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷、新藥篩選和司法鑒定等具有革命性的推動作用。
本發(fā)明提供了一種敗血癥檢測芯片。將已經(jīng)合成的特異性探針矩陣固定于基片表面,通過芯片與待測樣本DNA雜交,即可獲取大量與敗血癥相關(guān)的生物學(xué)信息。利用這種芯片,通過一次操作就可以同時完成敗血癥致病菌的檢測。該基因芯片具有診斷準(zhǔn)確、特異性高、信息量大的特點(diǎn)。如果將此芯片成功應(yīng)用于臨床,必將帶來極大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施的具體步驟是1.設(shè)計敗血癥特異性探針和引物從NCBI等數(shù)據(jù)庫獲得可靠的敗血癥致病菌基因序列以及耐藥特征序列等,選擇敗血癥致病菌16s基因序列,利用生物信息學(xué)軟件設(shè)計引物和特異性的探針。選擇同用引物F4825`-CGGCTAACTC TGTGCCAGC;R789ATCTATGGGA CCATCAGGTACGG-5`針對16s部分基因序列進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增同時標(biāo)記Cy3熒光素。在基因芯片上以點(diǎn)樣的方式固定61種不同病原菌特異探針,鑒別Acinetobacter、Actinomyces、Borrelia burgdorferi、Burkholderia cepacia、Bacteroides fragilis、Burkholderia pseudomallei、Bartonella sp.、Borrelia afzelii、Borrelia garinii、Clostridium difficile、Clostridium perfringens、Capnocytophaga ochracea、Chlamydia pneumoniae、Clostridium septicum、Coxiella burnetii strain1M、Escherichia coli、Enterobacter aerogenes、Enterococcus dispar[duran]、Enterococcus faecalis strainK4、Enterococcus faecium、Flavimonasoryzihabitans、Flavobacterium sp.、Fusobacterium necrophorum、Haemophilus influenzae、Klebsiellaoxytoca-16、Klebsiella pneumoniae、Leptospira interrogans、Lactobacillus sp.B5406、Legionellasp.strain LLAP9、Mycobacterium tuberculosis、Moraxella sp.、Mycoplasma pneumoniae strainATCC15531、Neisseria meningitidis、Nocardia asteroides、p-mor、p-pro、Peptococcus niger、Peptostreptococcus sp.、Prevotella intermedia ATCC25611、Proteus vulgaris、Pseudomonas sp.、Rhodococcus sp.、Rickettsia typhi strain Wilmington、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcushaemolyticus、s-aea、Streptococcus agalactiae、Streptococcus bovis、Streptococcus milleri、Streptococcus pyogenes、Staphylococcus haemolyticus、Salmonella、Serratia sp.、Staphylococcusaureus、Staphylococcus saccharolyticus、Stenotrophomonas sp.、Treponema pallidum、V.cholerae、V.vulnificus、bacillus subtilis病原微生物。
2.合成探針由上海生物工程有限公司合成。探針5’端加氨基修飾。
3.制備芯片根據(jù)需要設(shè)定點(diǎn)樣程序,矩陣分布根據(jù)探針雜交動力學(xué)要求及點(diǎn)樣方便與否安排。用去離子水將合成的探針溶解,濃度為200mmol/l。使用CEL公司生產(chǎn)的玻璃基片,用BioRobotics公司的點(diǎn)樣儀按預(yù)先設(shè)定好的程序進(jìn)行點(diǎn)樣。按照不同要求從幾十點(diǎn)到上千點(diǎn),點(diǎn)的大小為50-100微米左右,點(diǎn)間距依點(diǎn)的數(shù)量而定。點(diǎn)好的芯片于37℃下水化3天,然后在80℃下烘干2小時。以探針緩沖液(1xSSC,0.1%SDS)及蒸餾水沖洗玻片,吹干。以封閉液(1%BSA,PH=7 0.01mol/l PB)封閉玻片,之后洗滌3次。吹干備用。
上述敗血癥檢測芯片的應(yīng)用方法包括以下步驟(1).處理樣品取病人靜脈血3-5毫升,用溶菌酶溶解,氯仿抽提,乙醇沉淀法提取細(xì)菌DNA,備用。如需長時間放置,在-20℃下凍存。
(2).PCR擴(kuò)增在反應(yīng)管中加入擴(kuò)增反應(yīng)混合物,Taq酶,處理好的樣品和引物,足量的dNTP以及熒光素(Cy3)標(biāo)記的dUTP。擴(kuò)增條件如下94℃ 5min94℃ 30sec56℃ 30sec30個循環(huán)72℃ 1min72℃ 5min以上步驟為30個循環(huán);
(3).雜交PCR產(chǎn)物與芯片上的探針在60℃下雜交2小時,雜交緩沖液(10xSSC,0.1%SDS)與PCR產(chǎn)物的比例為1∶1。洗滌3次。
(4).檢測用Genomic Solutions公司的掃描儀掃描雜交后的芯片,得到圖像并輸出結(jié)果。
(5).數(shù)據(jù)分析Genomic Solutions公司的掃描儀的配套分析軟件將芯片分析結(jié)果輸出。
以下結(jié)合具體的實(shí)施例對發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明實(shí)施例設(shè)計敗血癥引物及常見致病菌特異性探針60個。探針的大小為15-20個堿基。由上海生物工程有限公司合成。探針5’端加氨基修飾。
制備基因芯片用CEL公司生產(chǎn)的玻璃基片,使用BioRobotics公司的點(diǎn)樣儀按預(yù)先設(shè)定好的程序進(jìn)行點(diǎn)樣。用去離子水將合成的探針溶解,濃度為200mmol/l。點(diǎn)好的芯片于37℃下水化3天,然后在80℃下烘干2小時。以探針緩沖液(1xSSC,0.1%SDS)及蒸餾水沖洗玻片,吹干。以封閉液(1%BSA,PH=7 0.01mol/l PB)封閉玻片,之后洗滌3次。吹干備用。
處理樣品取臨床培養(yǎng)結(jié)果為金黃色葡萄球菌感染的患者靜脈血少量,用苯酚氯仿抽提,乙醇沉淀法沉淀得DNA,備用。
PCR擴(kuò)增采用的引物序列是F4825`-CGGCTAACTC TGTGCCAGC;R789ATCTATGGGA CCATCAGGTACGG-5`.。
反應(yīng)總體積為20μl,在反應(yīng)管中加入10X buffer 2μl,Taq酶0.2μl,處理好的樣品0.8μl和上下游引物各2μl,dNTP0.8μl以及Cy3標(biāo)記的dUTP1.2μl,其余的用H2O。擴(kuò)增條件如下94℃ 5min94℃ 30sec56℃ 40sec72℃ 1min72℃ 5min以上步驟為30個循環(huán);
雜交PCR產(chǎn)物與芯片上的探針在60℃下雜交2小時,雜交緩沖液(10xSSC,0.1%SDS)與PCR產(chǎn)物的比例為1∶1。洗滌3次。
檢測用Genomic Solutions公司的掃描儀掃描雜交后的芯片,得到圖像并輸出結(jié)果。
數(shù)據(jù)分析Genomic Solutions公司的掃描儀的配套分析軟件將芯片結(jié)果輸出。與臨床檢驗(yàn)結(jié)果比較,符合率100%。
敗血癥檢測芯片引物及探針序列表Sepsisprimer SequenceF482 5`-CGGCTAACTC TGTGCCAGCR789 ATCTATGGGA CCATCAGGTACGG-5`Probe SequenceAcinetobacter F577 5`-CAAATGTGAA ATCCCCGAGCActinomyces F577 5`-CCGTGAAATC CCCTGGCTBorrelia burgdorferi F577 5`-AAGTCTATGC ATAAAATACC ACAGCTCBurkholderia cepacia F577 5`-TGAAATCCCC GGGCTCABacteroides fragilis F577 5`-TTGTGAAAGT TTGCGGCTCABurkholderia pseudomallei F557 5`-CTAAGACCGA TGTGAAATCC CCBartonella sp.F557 5`-TAAGTCAGAG GTGAAATCCC AGGBorrelia afzelii F557 5`-TCTATGCATA AAATACCACA GCTCABorrelia garinii F557 5`-TGCATAAAAT ACCACGGCTC AClostridium difficile F557 5`-AGTCAGGAGT GAAAGGCTAC GGClostridium perfringens F557 5`-GATGATTAAG TGGGATGTGA AATACCCapnocytophaga ochracea F557 5`-TATTAAGTCA GGGGTGAAAG GTTTCChlamydia pneumoniae F557 5`-AAGGAAAGTT AGATGTTAAA TTTTGGGClostridium septicum F557 5`-GCGGACTTTT AAGTGAGATG TGA5`-ATGTGAAATA CCCGGGCTCACoxiella burnetii strainlMF557 5`-TCTAAGTCGG ATGTGAAAGC CCEscherichia coli F557 5`-TGTTAAGTCA GATGTGAAAT CCCCEnterobacter aerogenesF557 5`-AGGCGGTCTG TTAAGTCAGA TGTEnterococcus dispar[duran]F557 5`-AGGCGGTTTC TTAAGTCTGA TGTe-dis, 5`-CAGGCGGTTT CTTAAGTCTG ATGEnterococcus faecalis strainK4F557 5`-AGGCGGTTTC TTAAGTCTGA TGTe-faeci 5`-GCAGGCGGTT CTTAAGTCTG AEnterococcus faecium F557 5`-AGGCGGTTCT TAAGTCTGAT GTGFlavimonas oryzihabitans F557 5`-GGGTGGTTTG TTAAGTTGGA TGTFlavobacterium sp.F557 5`-TTAAGTCAGT AGTGAAATCT TGCAGCFusobacte rium necrophorumF557 5`-GCGGGTTCAT AAGTCTGATG TTAAHaemophilus influenzaeF557 5`-AGGCGGTTAT TTAAGTGAGG TGTKlebsiella oxytoca-16 F557 5`-CGGTCTGTCA AGTCGGATGT Gk-oxy5`-GATCTGGAGG AATACCGGTG GKlebsiella pneumoniae F557 5`-CGGTCTGTCA AGTCGGATGT GLeptospira interrogansF557 5`-TGTGAAAACT GCGGGCTCALactobacillus sp.B5406F557 5`-AAGTCTGATG TGAAAGCCCT CGLegionella sp.strain LLAP9F557 5`-AGGTGGTTTG GTAAGTTATC TGTGAMycobacterium tuberculosisF557 5`-GTTTGTCGCG TTGTTCGTGAMoraxella sp. F557 5`-TGACTTTTAA GTCAGGGGTG AAAT
Mycoplasma pneumoniae strain ATCC 15531 F5575`-GGATTGAAAA GTCTGGTGTT AAAGGNeisseria meningitidis F5575`-AGACGGTTAC TTAAGCAGGA TGTGNocardia asteroides F5575`-GTCGTTTGTG AAAACTTGGG Gp-morF5575`-GGTTGATTGA GTCAGATGTG AAATCp-proF5575`-GCGGTTGATT AAGTTAGATG TGAAAPeptococcus nigerF5575`-AGGCGGTAAA TTAAGTCAGG TGTPeptostreptococcus sp. F5575`-GTGGTCTTTC AAGTCGGTGG TTPrevotella intermedia ATCC 25611 F5575`-ATGATTAAGC GTGACGTGAA ATGProteus vulgaris F5575`-CAATTAAGTC AGATGTGAAA GCCCPseudomonas sp.strain Circle F5575`-AGGTGGTTAG TTAAGTTGGATGTGARhodococcus sp F5575`-CGTTTGTGAA AACCAGCAGCRickettsia typhi strain Wilmington F5575`-TTTAGTAAGT TGGAAGTGAA AGCCCStaphylococcus epidermidis F5575`-AGTCTGATGT GAAAGCCCACGepi-hae 5`-AACTGGAAAA CTTGAGTTCA GAAGAGStaphylococcus haemolyticus F5575`-AGTCTGATGT GAAAGCCCACGhae-epi 5`-ATTGGAAACT GTAAAACTTG AGTGCs-aeaF5575`-AGGCGGTTCT TTAAGTCTGA AGTTStreptococcus agalactiae F5575`-AGGCGGTTAG ATAAGTCTGA AGTTStreptococcus bovis F5575`-AGGCGGTTTA ATAAGTCTGA AGTTAAStreptococcus milleriF5575`-GCGGTTAGAA AAGTCTGAAG TGAAStreptococcus pyogenes F5575`-TCTGAAGTTA AAGGCATTGG CTCStaphylococcus haemolyticus F5575`-TCAAGTCGGA TGTGAAGTCC CSalmonella F5575`-TGAAATCCCC GGGCTCASerratia sp. F5575`-GTGAAATCC CCGCGCTTAStaphylococcus aureusF5575`-AGTCTGATGT GAAAGCCCACGStaphylococcus saccharolyticus F5575`-AGTCTGATGT GAAAGCCCAC GStenotrophomonas sp. F5575`-AGGTGGTCGT TTAAGTCTGT TGTGTreponema pallidum F5575`-GCGGACTGGT AAGCCTGGTV.cholerae F5575`-TCAGATGTGA AAGCCCTGGGV.vulnificus F5575`-GAAAGCCCGG GGCTCAbacillus subtilisF557CTGATGTGAAAGCCCCCGPCR擴(kuò)增引物序列如下Sepsisprimer SequenceF4825`-CGGCTAACTC TGTGCCAGCR789ATCTATGGGA CCATCAGGTACGG-5`
權(quán)利要求
1.一種敗血癥檢測芯片及其制備工藝和使用方法,其特征在于該芯片為玻璃基片上分布有多個不同區(qū)域的微陣列,在每個微陣列區(qū)域中,分別固定有常見的敗血癥致病菌的特異性探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的敗血癥檢測芯片及其制備工藝和使用方法,其特征在于探針的大小為15-20個堿基,設(shè)計60個探針,所設(shè)計的探針序列如下SepsisProbeSequenceAcinetobacter F577 5`-CAAATGTGAA ATCCCCGAGCActinomyces F577 5`-CCGTGAAATC CCCTGGCTBorrelia burgdorferiF577 5`-AAGTCTATGC ATAAAATACC ACAGCTCBurkholderia cepaciaF577 5`-TGAAATCCCC GGGCTCABacteroides fragilisF577 5`-TTGTGAAAGT TTGCGGCTCABurkholderia pseudomallei F557 5`-CTAAGACCGA TGTGAAATCC CCBartonella sp. F557 5`-TAAGTCAGAG GTGAAATCCC AGGBorrelia afzeliiF557 5`-TCTATGCATA AAATACCACA GCTCABorrelia gariniiF557 5`-TGCATAAAAT ACCACGGCTC AClostridium difficile F557 5`-AGTCAGGAGT GAAAGGCTAC GGClostridium perfringens F557 5`-GATGATTAAG TGGGATGTGA AATACCCapnocytophaga ochracea F557 5`-TATTAAGTCA GGGGTGAAAG GTTTCChlamydia pneumoniaeF557 5`-AAGGAAAGTT AGATGTTAAA TTTTGGGClostridium septicumF557 5`-GCGGACTTTT AAGTGAGATG TGA5`-ATGTGAAATA CCCGGGCTCACoxiella burnetii strain1M F557 5`-TCTAAGTCGG ATGTGAAAGC CCEscherichia coliF557 5`-TGTTAAGTCA GATGTGAAAT CCCCEnterobacter aerogenes F557 5`-AGGCGGTCTG TTAAGTCAGA TGTEnterococcus dispar[duran] F557 5`-AGGCGGTTTC TTAAGTCTGA TGTe-dis, 5`-CAGGCGGTTT CTTAAGTCTG ATGEnterococcus faecalis strainK4 F557 5`-AGGCGGTTTC TTAAGTCTGA TGTe-faeci 5`-GCAGGCGGTT CTTAAGTCTG AEnterococcus faeciumF557 5`-AGGCGGTTCT TAAGTCTGAT GTGFlavimonas oryzihabitansF557 5`-GGGTGGTTTG TTAAGTTGGA TGTFlavobacterium sp. F557 5`-TTAAGTCAGT AGTGAAATCT TGCAGCFusobacterium necrophorum F557 5`-GCGGGTTCAT AAGTCTGATG TTAAHaemophilus influenzae F557 5`-AGGCGGTTAT TTAAGTGAGG TGTKlebsiella oxytoca-16 F557 5`-CGGTCTGTCA AGTCGGAATGT Gk-oxy5`-GATCTGGAGG AATACCGGTG GKlebsiella pneumoniae F557 5`-CGGTCTGTCA AGTCGGATGT GLeptospira interrogans F5575`-TGTGAAAACT GCGGGCTCALactobacillus sp.B5406 F5575`-AAGTCTGATG TGAAAGCCCT CGLegionella sp.strain LLAP9 F5575`-AGGTGGTTTG GTAAGTTATC TGTGAMycobacterium tuberculosis F5575`-GTTTGTCGCG TTGTTCGTGAMoraxella sp.F5575`-TGACTTTTAA GTCAGGGGTG AAATMycoplasma pneumoniae strain ATCC 15531 F5575`-GGATTGAAAA GTCTGGTGTT AAAGGNeisseria meningitidis F5575`-AGACGGTTAC TTAAGCAGGA TGTGNocardia asteroides F5575`-GTCGTTTGTG AAAACTTGGG Gp-morF5575`-GGTTGATTGA GTCAGATGTG AAATCp-proF5575`-GCGGTTGATT AAGTTAGATG TGAAAPeptococcus nigerF5575`-AGGCGGTAAA TTAAGTCAGG TGTPeptostreptococcus sp. F5575`-GTGGTCTTTC AAGTCGGTGG TTPrevotella intermedia ATCC 25611 F5575`-ATGATTAAGC GTGACGTGAA ATGProteus vulgaris F5575`-CAATTAAGTC AGATGTGAAA GCCCPseudomonas sp.strain Circle F5575`-AGGTGGTTAG TTAAGTTGGATGTGARhodococcus sp F5575`-CGTTTGTGAA AACCAGCAGCRickettsia typhi strain Wilmington F5575`-TTTAGTAAGT TGGAAGTGAA AGCCCStaphylococcus epidermidis F5575`-AGTCTGATGT GAAAGCCCAC Gepi-hae 5`-AACTGGAAAA CTTGAGTTCA GAAGAGStaphylococcus haemolyticus F5575`-AGTCTGATGT GAAAGCCCAC Ghae-epi 5`-ATTGGAAACT GTAAAACTTG AGTGCs-aeaF5575`-AGGCGGTTCT TTAAGTCTGA AGTTStreptococcus agalactiae F5575`-AGGCGGTTAG ATAAGTCTGA AGTTStreptococcus bovis F5575`-AGGCGGTTTA ATAAGTCTGA AGTTAAStreptococcus milleriF5575`-GCGGTTAGAA AAGTCTGAAG TGAAStreptococcus pyogenes F5575`-TCTGAAGTTA AAGGCATTGG CTCStaphylococcus haemolyticus F5575`-TCAAGTCGGA TGTGAAGTCC CSalmonella F5575`-TGAAATCCCC GGGCTCASerratia sp. F5575`-GTGAAATCC CCGCGCTTAStaphylococcus aureusF5575`-AGTCTGATGT GAAAGCCCAC GStaphylococcus saccharolyticus F5575`-AGTCTGATGT GAAAGCCCAC GStenotrophomonas sp. F5575`-AGGTGGTCGT TTAAGTCTGT TGTGTreponema pallidum F5575`-GCGGACTGGT AAGCCTGGTV.cholerae F5575`-TCAGATGTGA AAGCCCTGGGV.vulnificus F5575`-GAAAGCCCGG GGCTCAbacillus subtilisF557CTGATGTGAAAGCCCCCG
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的敗血癥檢測芯片及其制備工藝和使用方法,其特征在于本發(fā)明制備工藝按如下步驟進(jìn)行(1)、設(shè)計敗血癥特異性探針和引物;從數(shù)據(jù)庫中獲得可靠的敗血癥致病菌基因序列,根據(jù)所述的探針序列設(shè)計探針;從數(shù)據(jù)庫中獲得可靠的敗血癥致病菌病毒基因序列,選擇同用引物F4825`-CGGCTAACTC TGTGCCAGC;R789ATCTATGGGA CCATCAGGTACGG-5`針對16s部分基因序列進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增的同時標(biāo)記熒光素;(2)、合成探針;(3)、制備芯片;用去離子水將合成的探針溶解,得到濃度為200mmol/l的溶液,在玻璃基片上進(jìn)行點(diǎn)樣;點(diǎn)好的芯片于37℃下水化3天,然后在80℃下烘干2小時;以探針緩沖液及蒸餾水沖洗玻片,吹干;以封閉液封閉玻片,之后洗滌3次,吹干備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的敗血癥檢測芯片及其制備工藝和使用方法,其特征在于對待測血樣的預(yù)處理過程中,PCR擴(kuò)增引物序列如下Sepsisprimer SequenceF482 5`-CGGCTAACTC TGTGCCAGCR789 ATCTATGGGA CCATCAGGTACGG-5`
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的敗血癥檢測芯片及其制備工藝和使用方法,其特征在于在合成探針的步驟中,探針5’端加氨基修飾。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的敗血癥檢測芯片及其制備工藝和使用方法,其特征在于點(diǎn)樣從幾十點(diǎn)到上千點(diǎn),點(diǎn)的大小為50-100微米左右。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的敗血癥檢測芯片及其制備工藝和使用方法,其特征在于探針緩沖液為1xSSC,0.1%SDS;封閉液為1%BSA,PH=7 0.01mol/l PB。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的敗血癥檢測芯片及其制備工藝和使用方法,其特征在于使用方法按如下步驟進(jìn)行取病人靜脈血3-5毫升,分別提取DNA,備用;如需長時間放置,在-20℃下凍存;(2).PCR引物擴(kuò)增在反應(yīng)管中加入擴(kuò)增反應(yīng)混合物——Taq酶,相應(yīng)的處理好的樣品和引物,足量的dNTP以及熒光素Cy3標(biāo)記的dUTP;擴(kuò)增條件如下94℃5min94℃30sec56℃30sec72℃ 1min72℃ 5min以上步驟為30個循環(huán);(3).雜交;PCR產(chǎn)物與芯片上的探針在60℃下雜交2小時,雜交緩沖液(10xSSC,0.1%SDS)與PCR產(chǎn)物的比例為1∶1,洗滌3次。(4).檢測;用掃描儀掃描雜交后的芯片,得到圖像并輸出結(jié)果;(5).數(shù)據(jù)分析將芯片分析結(jié)果輸出。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)體外診斷技術(shù),具體地講是一種基因芯片——敗血癥檢測芯片及其制備工藝和使用方法。它是在玻璃基片上分布有多個不同區(qū)域的微陣列,在每個微陣列區(qū)域中,分別固定有常見的敗血癥致病菌的特異性探針。利用相應(yīng)探針與經(jīng)擴(kuò)增并加入熒光標(biāo)記的細(xì)菌DNA雜交,經(jīng)掃描儀掃描芯片,并對雜交信號進(jìn)行處理分析,獲得有關(guān)信息。這種芯片能同時檢測多種致病菌存在與否,具有診斷快速準(zhǔn)確、特異性高、信息量大的特點(diǎn),對臨床診斷和流行病學(xué)篩查都有很大幫助。
文檔編號C12Q1/68GK1515691SQ0311145
公開日2004年7月28日 申請日期2003年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月14日
發(fā)明者趙雨杰, 魏誠佑, 侯偉健, 王天驕, 王紹成, 馬佳明, 何群, 馬汝海, 張玉魁, 潘忠誠 申請人:趙雨杰, 魏誠佑, 侯偉健, 何群, 馬汝海, 王紹成, 張玉魁, 潘忠誠, 王天驕, 馬佳明