專利名稱：一種多肽——人呼吸鏈nadh脫氫酶10和編碼這種多肽的多核苷酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地說，本發(fā)明描述了一種新的多肽——呼吸鏈NADH脫氫酶10，以及編碼此多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的制備方法和應用。
背景技術：
呼吸鏈NADH脫氫酶10(也稱輔酶Q氧化還原酶)，是一種寡聚酶的復合體，位于線粒體膜的內表面上，在葉綠體和藍藻細菌中也有發(fā)現(xiàn)。整個NADH脫氫酶復合體包括25-30個多肽亞基，從NADH來的電子通過這個復合體傳遞到輔酶Q。
在哺乳動物的脫氫酶中有一個分子量為75Kd的多肽，是酶復合體中最大的一條亞基，是酶的鐵硫(IP)位點的組成部分，它能結合兩個4Fe-4S簇(N-3，N-4)。另外，還發(fā)現(xiàn)產酸桿菌依賴NAD的氫化酶的γ-亞基、大腸桿菌NADH-輔酶Q氧化還原酶的G亞基等也有這種75Kd的亞基結構，并且也能結合兩個4Fe-4S簇。
這種75Kd的亞基有三個保守程度較高的區(qū)域，與鐵硫蛋白的結合有關(1)P-X(2)-C-[YWS]-X(7)-G-X-C-R-X-C； (2)C-P-X-C-[DE]-X-[GS](2)-X-C-X-L-Q；(3)R-C-[LIVM]-X-C-X-R-C-[LIVM]-X-[FY]。其中各有三個Cys殘基，其上的巰基能與含鐵硫原子的蛋白質結合，電子最初由NADH脫氫酶上的FMN輔基所接受，然后通過鐵硫復合物傳遞給輔酶Q，鐵能以氧化狀態(tài)(Fe3+)或還原狀態(tài)(Fe2+)存在，實際上就是電子的受體或供體。
在生物體中，呼吸代謝是一個重要的代謝過程，通過電子傳遞和氧化磷酸化作用最終生成ATP，從而滿足細胞對能量的需要，而電子傳遞的第一個步驟就是通過NADH脫氫酶復合體來完成。在大腦中，某些毒素能使NADH脫氫酶產生缺陷，導致一些腦疾的產生，比較常見的疾病如帕金森(Parkinson)綜合癥，有些人在40歲之后就會產生這種癥狀，這是由于線粒體中NADH脫氫酶復合體功能的削弱；另外，低的NADH脫氫酶活性會引起亨延頓(Huntington)癥。
由于如上所述呼吸鏈NADH脫氫酶10蛋白在機體重要功能中起重要作用，而且相信這些調節(jié)過程中涉及大量的蛋白，因而本領域中一直需要鑒定更多參與這些過程的呼吸鏈NADH脫氫酶10蛋白，特別是鑒定這種蛋白的氨基酸序列。新呼吸鏈NADH脫氫酶10蛋白編碼基因的分離也為研究確定該蛋白在健康和疾病狀態(tài)下的作用提供了基礎。這種蛋白可能構成開發(fā)疾病診斷和/或治療藥的基礎，因此分離其編碼DNA是非常重要的。
發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供分離的新的多肽——人呼吸鏈NADH脫氫酶10以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一個目的是提供編碼該多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有編碼人呼吸鏈NADH脫氫酶10的多核苷酸的重組載體。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有編碼人呼吸鏈NADH脫氫酶10的多核苷酸的基因工程化宿主細胞。
本發(fā)明的另一個目的是提供生產人呼吸鏈NADH脫氫酶10的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供針對本發(fā)明的多肽——人呼吸鏈NADH脫氫酶10的抗體。
本發(fā)明涉及一種分離的多肽，該多肽是人源的，它包含具有<210>2氨基酸序列的多肽、或其保守性變體、生物活性片段或衍生物。較佳地，該多肽是具有<210>2氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明另外涉及一種含有本發(fā)明多核苷酸的載體，特別是表達載體；一種用該載體遺傳工程化的宿主細胞，包括轉化、轉導或轉染的宿主細胞；一種包括培養(yǎng)所述宿主細胞和回收表達產物的制備本發(fā)明多肽的方法。
本發(fā)明還涉及一種能與本發(fā)明多肽特異性結合的抗體。
本發(fā)明還涉及一種篩選的模擬、激活、拮抗或抑制人呼吸鏈NADH脫氫酶10蛋白活性的化合物的方法，其包括利用本發(fā)明的多肽。本發(fā)明還涉及用該方法獲得的化合物。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
本發(fā)明提供了一種多肽——人呼吸鏈NADH脫氫酶10，其基本上是由<210>2所示的氨基酸序列組成的。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據(jù)重組生產方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人呼吸鏈NADH脫氫酶10的片段、衍生物和類似物。如本發(fā)明所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的人呼吸鏈NADH脫氫酶10相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明多肽的片段、衍生物或類似物可以是(I)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選的是保守氨基酸殘基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的；或者(II)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基上的某個基團被其它基團取代包含取代基；或者(III)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)這樣一種，其中附加的氨基酸序列融合進成熟多肽而形成的多肽序列(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)通過本文的闡述，這樣的片段、衍生物和類似物被認為在本領域技術人員的知識范圍之內。
本發(fā)明提供了分離的核酸(多核苷酸)，基本由編碼具有<210>2氨基酸序列的多肽的多核苷酸組成。本發(fā)明的多核苷酸序列包括<210>1的核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸是從人胎腦組織的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與<210>1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本發(fā)明所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有<210>2的蛋白質或多肽，但與<210>1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼<210>2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”是指包括編碼此多肽的多核苷酸和包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述描述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片斷、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(兩個序列之間具有至少50％，優(yōu)選具有70％的相同性)。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加用變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在9 5％以上，更好是97％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與<210>2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的核酸片段。如本發(fā)明所用，”核酸片段”的長度至少含10個核苷酸，較好是至少20-30個核苷酸，更好是至少50-60個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼人呼吸鏈NADH脫氫酶10的多核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發(fā)明的編碼人呼吸鏈NADH脫氫酶10的特異的多核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領域熟知的雜交技術分離多核苷酸。這些技術包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源的多核苷酸序列，和2)表達文庫的抗體篩選以檢出具有共同結構特征的克隆的多核苷酸片段。
本發(fā)明的DNA片段序列也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。DNA序列的直接化學合成是經(jīng)常選用的方法。更經(jīng)常選用的方法是cDNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標準方法是從高表達該基因的供體細胞分離mRNA并進行逆轉錄，形成質粒或噬菌體cDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術，試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得(Qiagene)。而構建cDNA文庫也是通常的方法(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。還可得到商業(yè)供應的cDNA文庫，如Clontech公司的不同cDNA文庫。當結合使用聚合酶反應技術時，即使極少的表達產物也能克隆。
可用常規(guī)方法從這些cDNA文庫中篩選本發(fā)明的基因。這些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標志基因功能的出現(xiàn)或喪失；(3)測定人呼吸鏈NADH脫氫酶10的轉錄本的水平；(4)通過免疫學技術或測定生物學活性，來檢測基因表達的蛋白產物。上述方法可單用，也可多種方法聯(lián)合應用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發(fā)明的多核苷酸的任何一部分同源，其長度至少10個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸。此外，探針的長度通常在2000個核苷酸之內，較佳的為1000個核苷酸之內。此處所用的探針通常是在本發(fā)明的基因序列信息的基礎上化學合成的DNA序列。本發(fā)明的基因本身或者片段當然可以用作探針。DNA探針的標記可用放射性同位素，熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等。
在第(4)種方法中，檢測人呼吸鏈NADH脫氫酶10基因表達的蛋白產物可用免疫學技術如Western印跡法，放射免疫沉淀法，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的多核苷酸序列信息適當?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本發(fā)明的基因，或者各種DNA片段等的多核苷酸序列可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al.PNAS，1977，745463-5467)測定。這類多核苷酸序列測定也可用商業(yè)測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列，測序需反復進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或直接用人呼吸鏈NADH脫氫酶10編碼序列經(jīng)基因工程產生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術產生本發(fā)明所述多肽的方法。
本發(fā)明中，編碼人呼吸鏈NADH脫氫酶10的多核苷酸序列可插入到載體中，以構成含有本發(fā)明所述多核苷酸的重組載體。術語“載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其它載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7啟動子的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都可以用于構建重組表達載體。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起始點、啟動子、標記基因和翻譯調控元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含編碼人呼吸鏈NADH脫氫酶10的DNA序列和合適的轉錄/翻譯調控元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細胞或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子等。在載體中插入增強子序列將會使其在高等真核細胞中的轉錄得到增強。增強子是DNA表達的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄?？膳e的例子包括在復制起始點晚期一側的100到270個堿基對的SV40增強子、在復制起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體/轉錄調控元件(如啟動子、增強子等)和選擇性標記基因。
本發(fā)明中，編碼人呼吸鏈NADH脫氫酶10的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可轉化或轉導入宿主細胞，以構成含有該多核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細胞。術語“宿主細胞”指原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；細菌細胞如鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9；動物細胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細胞等。
用本發(fā)明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重組載體轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。可供選擇的是用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，或者常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
通過常規(guī)的重組DNA技術，利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達或生產重組的人呼吸鏈NADH脫氫酶10(Science，1984；2241431)。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼人人呼吸鏈NADH脫氫酶10的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質。
在步驟(2)中，根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在步驟(3)中，重組多肽可包被于細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法包括但并不限于常規(guī)的復性處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
本發(fā)明的多肽以及該多肽的拮抗劑、激動劑和抑制劑可直接用于疾病治療，例如，可治療惡性腫瘤、腎上腺缺乏癥、皮膚病、各類炎癥、HIV感染和免疫性疾病等。
呼吸鏈NADH脫氫酶10是一種寡聚酶的復合體，含多個亞基。酶復合體中75Kd的多肽是最大的一條亞基。在生物體中，呼吸代謝是一個重要的代謝過程，通過電子傳遞和氧化磷酸化作用最終生成ATP，從而滿足細胞對能量的需要，而電子傳遞的第一個步驟就是通過NADH脫氫酶復合體來完成。
研究發(fā)現(xiàn)，在大腦中，某些毒素能使NADH脫氫酶產生缺陷，導致一些腦疾的產生，比較常見的疾病如帕金森(Parkinson)綜合癥，有些人在40歲之后就會產生這種癥狀，這是由于線粒體中NADH脫氫酶復合體功能的削弱；另外，低的NADH脫氫酶活性會引起亨延頓(Huntington)癥。
由此可見，特異的NADH脫氫酶75Kd亞基motif的表達異常，將致使本發(fā)明的含此motif的多肽的功能異常，從而導致呼吸鏈功能的異常，影響物質與能量的代謝，并產生相關的疾病如帕金森綜合癥、亨延頓氏癥、物質與能量代謝障礙性疾病、生長發(fā)育障礙、腫瘤等。
本發(fā)明也提供了篩選化合物以鑒定提高(激動劑)或阻遏(拮抗劑)人呼吸鏈NADH脫氫酶10的藥劑的方法。激動劑提高人呼吸鏈NADH脫氫酶10刺激細胞增殖等生物功能，而拮抗劑阻止和治療與細胞過度增殖有關的紊亂如各種癌癥。例如，能在藥物的存在下，將哺乳動物細胞或表達人呼吸鏈NADH脫氫酶10的膜制劑與標記的人呼吸鏈NADH脫氫酶10一起培養(yǎng)。然后測定藥物提高或阻遏此相互作用的能力。
人呼吸鏈NADH脫氫酶10的拮抗劑包括篩選出的抗體、化合物、受體缺失物和類似物等。人呼吸鏈NADH脫氫酶10的拮抗劑可以與人呼吸鏈NADH脫氫酶10結合并消除其功能，或是抑制該多肽的產生，或是與該多肽的活性位點結合使該多肽不能發(fā)揮生物學功能。
在篩選作為拮抗劑的化合物時，可以將人呼吸鏈NADH脫氫酶10加入生物分析測定中，通過測定化合物對人呼吸鏈NADH脫氫酶10和其受體之間相互作用的影響來確定化合物是否是拮抗劑。用上述篩選化合物的同樣方法，可以篩選出起拮抗劑作用的受體缺失物和類似物。能與人呼吸鏈NADH脫氫酶10結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，一般應對人呼吸鏈NADH脫氫酶10分子進行標記。
本發(fā)明提供了用多肽，及其片段、衍生物、類似物或它們的細胞作為抗原以生產抗體的方法。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還提供了針對人呼吸鏈NADH脫氫酶10抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫產生的片段。
多克隆抗體的生產可用人呼吸鏈NADH脫氫酶10直接注射免疫動物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。制備人呼吸鏈NADH脫氫酶10的單克隆抗體的技術包括但不限于雜交瘤技術(Kohlerand Milstein.Nature，1975，256495-497)，三瘤技術，人B-細胞雜交瘤技術，EBV-雜交瘤技術等。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結合的嵌合抗體可用已有的技術生產(Morrison et al，PNAS，1985，816851)。而已有的生產單鏈抗體的技術(U.S.PatNo.4946778)也可用于生產抗人呼吸鏈NADH脫氫酶10的單鏈抗體。
抗人呼吸鏈NADH脫氫酶10的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人呼吸鏈NADH脫氫酶10。
與人呼吸鏈NADH脫氫酶10結合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記，注入體內可跟蹤其位置和分布。這種放射性標記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細胞的定位和判斷是否有轉移。
抗體還可用于設計針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如人呼吸鏈NADH脫氫酶10高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人呼吸鏈NADH脫氫酶10陽性的細胞。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預防與人呼吸鏈NADH脫氫酶10相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷人呼吸鏈NADH脫氫酶10的產生或活性。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人呼吸鏈NADH脫氫酶10水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人呼吸鏈NADH脫氫酶10水平，可以用作解釋人呼吸鏈NADH脫氫酶10在各種疾病中的重要性和用于診斷人呼吸鏈NADH脫氫酶10起作用的疾病。
本發(fā)明的多肽還可用作肽譜分析，例如，多肽可用物理的、化學或酶進行特異性切割，并進行一維或二維或三維的凝膠電泳分析，更好的是進行質譜分析。
編碼人呼吸鏈NADH脫氫酶10的多核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術可用于治療由于人呼吸鏈NADH脫氫酶10的無表達或異常/無活性表達所致的細胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計用于表達變異的人呼吸鏈NADH脫氫酶10，以抑制內源性的人呼吸鏈NADH脫氫酶10活性。例如，一種變異的人呼吸鏈NADH脫氫酶10可以是縮短的、缺失了信號傳導功能域的人呼吸鏈NADH脫氫酶10，雖可與下游的底物結合，但缺乏信號傳導活性。因此重組的基因治療載體可用于治療人呼吸鏈NADH脫氫酶10表達或活性異常所致的疾病。來源于病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將編碼人呼吸鏈NADH脫氫酶10的多核苷酸轉移至細胞內。構建攜帶編碼人呼吸鏈NADH脫氫酶10的多核苷酸的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，etal.)。另外重組編碼人呼吸鏈NADH脫氫酶10的多核苷酸可包裝到脂質體中轉移至細胞內。
多核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
抑制人呼吸鏈NADH脫氫酶10mRNA的寡核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得，如固相磷酸酰胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內轉錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
編碼人呼吸鏈NADH脫氫酶10的多核苷酸可用于與人呼吸鏈NADH脫氫酶10的相關疾病的診斷。編碼人呼吸鏈NADH脫氫酶10的多核苷酸可用于檢測人呼吸鏈NADH脫氫酶10的表達與否或在疾病狀態(tài)下人呼吸鏈NADH脫氫酶10的異常表達。如編碼人呼吸鏈NADH脫氫酶10的DNA序列可用于對活檢標本進行雜交以判斷人呼吸鏈NADH脫氫酶10的表達狀況。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用人呼吸鏈NADH脫氫酶10特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測人呼吸鏈NADH脫氫酶10的轉錄產物。
檢測人呼吸鏈NADH脫氫酶10基因的突變也可用于診斷人呼吸鏈NADH脫氫酶10相關的疾病。人呼吸鏈NADH脫氫酶10突變的形式包括與正常野生型人呼吸鏈NADH脫氫酶10DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達；因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。該序列會特異性地針對某條人染色體具體位置且并可以與其雜交。目前，需要鑒定染色體上的各基因的具體位點。現(xiàn)在，只有很少的基于實際序列數(shù)據(jù)(重復多態(tài)性)的染色體標記物可用于標記染色體位置。根據(jù)本發(fā)明，為了將這些序列與疾病相關基因相關聯(lián)，其重要的第一步就是將這些DNA序列定位于染色體上。
簡而言之，根據(jù)cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應于引物的人基因的雜合細胞會產生擴增的片段。
體細胞雜合細胞的PCR定位法，是將DNA定位到具體染色體的快捷方法。使用本發(fā)明的寡核苷酸引物，通過類似方法，可利用一組來自特定染色體的片段或大量基因組克隆而實現(xiàn)亞定位?？捎糜谌旧w定位的其它類似策略包括原位雜交、用標記的流式分選的染色體預篩選和雜交預選，從而構建染色體特異的cDNA庫。
將cDNA克隆與中期染色體進行熒光原位雜交(FISH)，可以在一個步驟中精確地進行染色體定位。此技術的綜述，參見Verma等，Human Chromo somesa Manual ofBasic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance inMan(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯(lián)機獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關系。
接著，需要測定患病和未患病個體間的cDNA或基因組序列差異。如果在一些或所有的患病個體中觀察到某突變，而該突變在任何正常個體中未觀察到，則該突變可能是疾病的病因。比較患病和未患病個體，通常涉及首先尋找染色體中結構的變化，如從染色體水平可見的或用基于cDNA序列的PCR可檢測的缺失或易位。根據(jù)目前的物理作圖和基因定位技術的分辨能力，被精確定位至與疾病有關的染色體區(qū)域的cDNA，可以是50至500個潛在致病基因間之一種(假定1兆堿基作圖分辨能力和每20kb對應于一個基因)。
可以將本發(fā)明的多肽、多核苷酸及其模擬物、激動劑、拮抗劑和抑制劑與合適的藥物載體組合后使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用于疾病治療。
本發(fā)明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由制造、使用或銷售藥品或生物制品的政府管理機構所給出的指示性提示，該提示反映出生產、使用或銷售的政府管理機構許可其在人體上施用。此外，本發(fā)明的多肽可以與其它的治療化合物結合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、鼻內或皮內的給藥途徑。人呼吸鏈NADH脫氫酶10以有效地治療和/或預防具體的適應癥的量來給藥。施用于患者的人呼吸鏈NADH脫氫酶10的量和劑量范圍將取決于許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫(yī)生的判斷。
下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1是本發(fā)明呼吸鏈NADH脫氫酶10在8-59共52個氨基酸和結構域呼吸鏈NADH脫氫酶特征蛋白的氨基酸序列同源性比較圖。上方序列是呼吸鏈NADH脫氫酶10，下方序列是結構域呼吸鏈NADH脫氫酶特征蛋白。相同氨基酸在兩個序列間用單字符氨基酸表示，相似氨基酸用“+”表示。
圖2為分離的人呼吸鏈NADH脫氫酶10的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)。10kDa為蛋白質的分子量。箭頭所指為分離出的蛋白條帶。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人呼吸鏈NADH脫氫酶10的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎腦總RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene公司產品)從總RNA中分離poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA經(jīng)逆轉錄形成cDNA。用Smart cDNA克隆試劑盒(購自Clontech)將cDNA片段定向插入到pBSK(+)載體(Clontech公司產品)的多克隆位點上，轉化DH5α，細菌形成cDNA文庫。用Dye terminate cycle reaction sequencing kit(Perkin-Elmer公司產品)和ABI 377自動測序儀(Perkin-Elmer公司)測定所有克隆的5′和3′末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫(Genebank)進行比較，結果發(fā)現(xiàn)其中一個克隆0375E09的cDNA序列為新的DNA。通過合成一系列引物對該克隆所含的插入cDNA片段進行雙向測定。結果表明，0375E09克隆所含的全長cDNA為1743bp(如<210>1所示)，從第568bp至837bp有一個270bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個新的蛋白質(如<210>2所示)。我們將此克隆命名為pBS-0375E09，編碼的蛋白質命名為人呼吸鏈NADH脫氫酶10。
實施例2cDNA克隆的結構域分析將本發(fā)明的呼吸鏈NADH脫氫酶10的序列及其編碼的蛋白序列，用GCG中的profilescan程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul，SF et al.J.Mol.Biol.1990；215403-10]，在prosite等數(shù)據(jù)庫進行結構域分析。本發(fā)明的呼吸鏈NADH脫氫酶10在8-59與結構域呼吸鏈NADH脫氫酶特征蛋白有同源，同源結果示于圖1，同源率為0.31，得分為15.82；閾值為12.98。
實施例3用RT-PCR方法克隆編碼人呼吸鏈NADH脫氫酶10的基因用胎腦細胞總RNA為模板，以oligo-dT為引物進行逆轉錄反應合成cDNA，用Qiagene的試劑盒純化后，用下列引物進行PCR擴增Primer15’-GGGCACCAGCTGGGTTCTCCAGGG-3’Primer25’-TTCTGCAAAGATGTTTAATGCACT-3’Prime1為位于<210>1的5’端的第1bp開始的正向序列；Primer2為<210>1的中的3’端反向序列。
擴增反應的條件在50μl的反應體積中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司產品)。在PE9600型DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer公司)上按下列條件反應25個周期94℃30sec；55℃30sec；72℃2min。在RT-PCR時同時設β-actin為陽性對照和模板空白為陰性對照。擴增產物用QIAGEN公司的試劑盒純化，用TA克隆試劑盒連接到pCR載體上(Invitrogen公司產品)。DNA序列分析結果表明PCR產物的DNA序列與<210>1所示的1-1743bp完全相同。
實施例4Northern印跡法分析人呼吸鏈NADH脫氫酶10基因的表達用一步法提取總RNA[Anal.Biochem 1987，162，156-159]。該法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M異硫氰酸胍-25mM檸檬酸鈉，0.2M乙酸鈉(pH4.0)對組織進行勻漿，加入1倍體積的苯酚和1/5體積的氯仿-異戊醇(49∶1)，混合后離心。吸出水相層，加入異丙醇(0.8體積)并將混合物離心得到RNA沉淀。將得到的RNA沉淀用70％乙醇洗滌，干燥并溶于水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-嗎啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸鈉-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠上進行電泳。然后轉移至硝酸纖維素膜上。用α-32PdATP通過隨機引物法制備32P-標記的DNA探針。所用的DNA探針為圖1所示的PCR擴增的人呼吸鏈NADH脫氫酶10編碼區(qū)序列。將32P-標記的探針(約2×106cpm/ml)與轉移了RNA的硝酸纖維素膜在一溶液中于42℃雜交過夜，該溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鮭精DNA。雜交之后，將濾膜在1×SSC-0.1％SDS中于55℃洗30min。然后，用Phosphor Imager進行分析和定量。
實施例5重組人呼吸鏈NADH脫氫酶10的體外表達、分離和純化根據(jù)<210>1和圖1所示的編碼區(qū)序列，設計出一對特異性擴增引物，序列如下Primer35’-CCCCATATGATGGTGGCCCTGTTCTGGGGGAGCA-3’Primer45’-CATGGATCCTTAAGGGTCCTCTCTCACCAGCCAG-3’此兩段引物的5’端分別含有NheI和BamHI酶切位點，其后分別為目的基因5’端和3’端的編碼序列，NheI和BamHI酶切位點相應于表達載體質粒pET-28b(+)(Novagen公司產品，Cat.No.69865.3)上的選擇性內切酶位點。以含有全長目的基因的pBS-0375E09質粒為模板，進行PCR反應。PCR反應條件為總體積50μl中含pBS-0375E09質粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分別為10pmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司產品)1μl。循環(huán)參數(shù)94℃20s，60℃30s，68℃2min，共25個循環(huán)。用NheI和BamHI分別對擴增產物和質粒pET-28(+)進行雙酶切，分別回收大片段，并用T4連接酶連接。連接產物轉化用氯化鈣法大腸桿細菌DH5α，在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB平板培養(yǎng)過夜后，用菌落PCR方法篩選陽性克隆，并進行測序。挑選序列正確的陽性克隆(pET-0375E09)用氯化鈣法將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司產品)。在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，宿主菌BL21(pET-0375E09)在37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5小時。離心收集菌體，經(jīng)超聲波破菌，離心收集上清，用能與6個組氨酸(6His-Tag)結合的親和層析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司產品)進行層析，得到了純化的目的蛋白人呼吸鏈NADH脫氫酶10。經(jīng)SDS-PAGE電泳，在10kDa處得到一單一的條帶(圖2)。將該條帶轉移至PVDF膜上用Edams水解法進行N-端氨基酸序列分析，結果N-端15個氨基酸與<210>2所示的N-端15個氨基酸殘基完全相同。
實施例6抗人呼吸鏈NADH脫氫酶10抗體的產生用多肽合成儀(PE公司產品)合成下述人呼吸鏈NADH脫氫酶10特異性的多肽NH2-Met-Val-Ala-Leu-Phe-Trp-Gly-Ser-Arg-Val-Arg-Gln-Glu-Glu-Val-COOH將該多肽分別與血藍蛋白和牛血清白蛋白耦合形成復合，方法參見Avrameas，et al.Immunochemistry，1969；643。用4mg上述血藍蛋白多肽復合物加上完全弗氏佐劑免疫家兔，15天后再用血藍蛋白多肽復合物加不完全弗氏佐劑加強免疫一次。采用經(jīng)15μg/ml牛血清白蛋白多肽復合物包被的滴定板做ELISA測定兔血清中抗體的滴度。用蛋白A-Sepha ros e從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG。將多肽結合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離抗多肽抗體。免疫沉淀法證明純化的抗體可特異性地與人呼吸鏈NADH脫氫酶10結合。
序列表<110>上海博德基因開發(fā)有限公司<120>一種新的多肽--人呼吸鏈NADH脫氫酶10和編碼這種多肽的多核苷酸<130>0375E09<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1743<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(568)..(837)<223>
<400>1gggcaccagc tgggttctcc agggagcagg agttggacct ccatggagcc actaggcctg 60gcctcctcta cacatcccca gggctatctg gttaattcca tcaagctcag agttaaaagg120catatcagcc tggagtattt gggagagact ggctgcagat ccccgccagc caagatgcaa180gccactcggg acctgatgtc ggcagctgtg cctctactgc cctgaggact taccagaggg240agccctactg gccttccccc accacagcag ccctgcctgt gaagctcttg tttctgacat300ttcacaggca gagaggtgcc atcagttcgc ctccattcct tgccaccatg accagcctct360ccctgaactc tctcttgctc gggacctgcc tgagggctcc ctgctgcagt tcgccgtact420tccatctgct gggtgcctcc atcgttggtt gggtggggat ggggcatttt ctgagctaag480ctttgtcatt agtttgtgaa gcacctggtc agcaacctgc cccagacctg gagggtcttt540gtggactgaa ggtagacacc agccagc atg gtg gcc ctg ttc tgg ggg agc agg594Met Val Ala Leu Phe Trp Gly Ser Arg1 5gta agg cag gag gaa gtg ggt gag ctc cga gat gat gag cac atg aag 642Val Arg Gln Glu Glu Val Gly Glu Leu Arg Asp Asp Glu His Met Lys10 15 20 25cct gtg gcc cct tcg tac ctg caa tat gtc agg agc ctc acg ctc acc 690Pro Val Ala Pro Ser Tyr Leu Gln Tyr Val Arg Ser Leu Thr Leu Thr
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1 5 10 15Glu Leu Arg Asp Asp Glu His Met Lys Pro Val Ala Pro Ser Tyr Leu20 25 30Gln Tyr Val Arg Ser Leu Thr Leu Thr Gln Asp Pro Ala Gly Ala Arg35 40 45Leu His Leu Thr Gly Ser Glu Gly Arg Thr Gly Tyr His Thr Phe Leu50 55 60Thr Arg Pro Pro Phe Leu Trp Ala Leu Val Pro Pro Arg Gly Phe Leu65 70 75 80Gly Cys Trp Leu Val Arg Glu Asp Pro8權利要求
1.一種分離的多肽-人呼吸鏈NADH脫氫酶10，其特征在于它包含有<210>2所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、類似物或衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽、類似物或衍生物的氨基酸序列具有與<210>2所示的氨基酸序列至少95％的相同性。
3.如權利要求2所述的多肽，其特征在于它包含具有<210>2所示的氨基酸序列的多肽。
4.一種分離的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含選自下組中的一種(a)編碼具有<210>2所示氨基酸序列的多肽或其片段、類似物、衍生物的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸；或(c)與(a)或(b)有至少70％相同性的多核苷酸。
5.如權利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含編碼具有<210>2所示氨基酸序列的多核苷酸。
6.如權利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸的序列包含有<210>1中568-837位的序列或<210>1中1-1743位的序列。
7.一種含有外源多核苷酸的重組載體，其特征在于它是由權利要求4-6中的任一權利要求所述多核苷酸與質粒、病毒或運載體表達載體構建而成的重組載體。
8.一種含有外源多核苷酸的遺傳工程化宿主細胞，其特征在于它是選自于下列一種宿主細胞(a)用權利要求7所述的重組載體轉化或轉導的宿主細胞；或(b)用權利要求4-6中的任一權利要求所述多核苷酸轉化或轉導的宿主細胞。
9.一種具有人呼吸鏈NADH脫氫酶10活性的多肽的制備方法，其特征在于所述方法包括(a)在表達人呼吸鏈NADH脫氫酶10條件下，培養(yǎng)權利要求8所述的工程化宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人呼吸鏈NADH脫氫酶10活性的多肽。
10.一種能與多肽結合的抗體，其特征在于所述抗體是能與人呼吸鏈NADH脫氫酶10特異性結合的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的多肽——人呼吸鏈NADH脫氫酶10，編碼此多肽的多核苷酸和經(jīng)DNA重組技術產生這種多肽的方法。本發(fā)明還公開了此多肽用于治療多種疾病的方法，如惡性腫瘤，血液病，HIV感染和免疫性疾病和各類炎癥等。本發(fā)明還公開了抗此多肽的拮抗劑及其治療作用。本發(fā)明還公開了編碼這種新的呼吸鏈NADH脫氫酶10的多核苷酸的用途。
文檔編號C12N9/02GK1510131SQ02157759
公開日2004年7月7日 申請日期2002年12月26日 優(yōu)先權日2002年12月26日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅 申請人:上海博德基因開發(fā)有限公司