專利名稱：一種腫瘤免疫治療及預防性疫苗的組成、制備、應(yīng)用方案的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤的生物免疫治療領(lǐng)域和腫瘤預防免疫領(lǐng)域。特別涉及通過腫瘤疫苗特異性誘導、刺激活化生物體腫瘤特異性T淋巴細胞，激發(fā)、增強生物體腫瘤預防免疫和抗腫瘤免疫功能；以及一種非細胞性腫瘤疫苗的制備及其在特異性抗腫瘤免疫治療和腫瘤預防免疫中的應(yīng)用方案。
二、技術(shù)背景一、抗腫瘤免疫的特異性識別機制大量實驗室、動物試驗和臨床研究資料表明腫瘤的發(fā)生、生長、形成與生物機體的免疫系統(tǒng)功能缺陷有關(guān)。在正常健康生物機體，當正常細胞由于基因突變等因素開始分化為腫瘤細胞時，免疫系統(tǒng)會早期識別這些突變細胞，并對這些“非已”(Non-self)細胞發(fā)動免疫攻擊。這種特異免疫識別機制和特異性免疫攻擊效應(yīng)構(gòu)成正常機體的抗腫瘤免疫。
腫瘤細胞之所以能夠在生物機體內(nèi)失控生長、繁殖，主要原因是機體抗腫瘤免疫機制的缺陷和不完全，從而使機體處在一種對腫瘤細胞的免疫“靜默”(Silence)或“耐受”(Tolerance)狀態(tài)。尤其反映在機體免疫細胞不能對腫瘤細胞進行特異性免疫識別，即抗腫瘤特異性免疫識別障礙。免疫細胞對腫瘤細胞的特異性識別機制主要由MHC或HLA(主要組織相溶性復合物，人類白細胞抗原)和腫瘤多肽組成復合物形成T淋巴細胞特異性識別的第一信號；而B7(B7-1，B7-2)等其它協(xié)同刺激因子(Costimulatory Factors)構(gòu)成T淋巴細胞特異性識別的第二信號。完備的上述“雙信號系統(tǒng)”是抗腫瘤特異性免疫識別的必要先決條件。大多數(shù)腫瘤細胞的“雙信號系統(tǒng)”缺失或不完全，因而造成腫瘤細胞的“免疫逃逸”(Escape)；致使機體抗腫瘤免疫不能有效活化，對腫瘤細胞發(fā)動免疫攻擊性應(yīng)答。
上述雙信號系統(tǒng)中MHC-I或HLA-I類分子腫瘤多肽復合物可被CD8+淋巴細胞受體(TCell Receptor；TCR)所識別；MHC-II或HLA-II類分子腫瘤多肽復合物被CD4+T淋巴細胞TCR識別，而上述T淋巴細胞的CD28受體則可與B7分子結(jié)合，繼而激活CD4+和CD8+T淋巴細胞并使其增殖，誘發(fā)特異性細胞免疫效應(yīng)。CD8+T淋巴細胞在抗腫瘤免疫效應(yīng)中可產(chǎn)生直接對腫瘤細胞的特異性殺傷效應(yīng)，這類細胞稱為細胞毒性殺傷T細胞(Cytotoxic TLyphocytes；CTL)；而CD4+T淋巴細胞通常稱為T輔助細胞(T Helper；TH)，其可通過分泌各種因子為IL-12，INF-R，IL-2等促進CTL殺傷效應(yīng)和輔助B淋巴細胞產(chǎn)生抗腫瘤抗體。二、抗原提呈細胞(Antigen-Presenting Cells；APC)的重要作用。
APC是存在于生物體內(nèi)免疫系統(tǒng)中一類具有重要功能的免疫細胞。APC具有攝取、加工、處理抗原并將經(jīng)加工處理的抗原信息通過一定的識別機制，特異性地提呈給相應(yīng)的淋巴細胞，從而誘發(fā)機體特異性的細胞免疫和體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。
APC在機體免疫應(yīng)答過程中起著抗原特異性信號的加工、載體功能即攝取處理、傳遞抗原特異性信號、介導、激發(fā)免疫系統(tǒng)對相應(yīng)的抗原發(fā)動特異性免疫應(yīng)答。
具有APC功能的細胞，廣義而言，包括機體內(nèi)所有的有核細胞；分布于全身各組織器官。按其提呈抗原的能力，可分為非專職性APC，如內(nèi)皮細胞、纖維細胞、上皮及間皮細胞等，它們的APC功能較弱，故稱非專職能APC。另外一類APC，主要是指樹突細胞(Dendritic Cell，DC)、巨噬細胞和B淋巴細胞；這類細胞具有較強的抗原提呈功能，稱為專職性APC(Professional APC)。
上述APC中，DC由美國學者Steinman于1973年發(fā)現(xiàn)，是迄今為止機體內(nèi)具有最強抗原提呈功能的細胞。由于成熟的DC具有許多樹突樣偽足形態(tài)，因此稱為樹突狀細胞。該類細胞的顯著特征是對初始T細胞(Naive T cells)具有極強的激活能力，并使其增殖；而巨噬細胞、B淋巴細胞僅能刺激已活化的或記憶性T細胞。因此，DC細胞是機體免疫應(yīng)答的始動者，在免疫應(yīng)答的誘發(fā)、介導、調(diào)節(jié)、促進過程中具有十分重要的獨特地位。通過調(diào)節(jié)DC的功能來改變調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答；提高機體的特異性抗腫瘤免疫能力，具有極其重要的臨床應(yīng)用價值。三、腫瘤細胞的“免疫逃逸”機制一般認為，在正常機體內(nèi)免疫系統(tǒng)具有免疫監(jiān)視(Immune Surveillance)功能其能夠早期識別發(fā)生突變的正常細胞，從而予以清除，阻止其向腫瘤細胞的分化、增殖。因此，機體的免疫功能正常與否和腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有十分密切的關(guān)系。當機體免疫功能低下或受抑制或正常免疫平衡發(fā)生紊亂時，腫瘤的發(fā)生幾率增加；而在腫瘤發(fā)生后，腫瘤細胞進行性“免疫逃逸”增殖使機體免疫系統(tǒng)功能進一步受到抑制；二者互為因果，雙方各綜合因素的消長、對抗，決定著腫瘤的最后轉(zhuǎn)歸。
在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，除機體自身免疫系統(tǒng)發(fā)生紊亂外，與腫瘤細胞本身所具有的免疫逃逸機制密切有關(guān)，其主要表現(xiàn)在以下方面
1、腫瘤細胞起源于機體發(fā)生突變的正常細胞。因此，腫瘤細胞的大部分結(jié)構(gòu)成分均屬“自身(Self)”正常成分；而機體免疫系統(tǒng)并不對此類自身抗原成分產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
2、腫瘤細胞對其腫瘤抗原表達具有“屏蔽作用”。有些腫瘤抗原屬一種多糖蛋白質(zhì)復合物成分，其免疫源性很差或由于機體產(chǎn)生的相應(yīng)抗體與腫瘤抗原結(jié)合，“封閉”了其抗原位點，從而導致機體很難對其進行免疫識別。
3、腫瘤抗原的基因型極不穩(wěn)定，隨機突變率高。因此，其抗原的表型改變迅速、多樣，造成機體對腫瘤抗原的特異性識別、免疫應(yīng)答上的障礙。
4、腫瘤細胞的“雙信號”系統(tǒng)缺陷；多數(shù)腫瘤細胞表現(xiàn)為“雙信號”系統(tǒng)成分的表達缺失或根本不表達或功能不完整，使其不能完整地將腫瘤抗原信息提呈給免疫系統(tǒng)，使機體抗腫瘤免疫處在一種“免疫耐受狀態(tài)”，而導致抗腫瘤免疫應(yīng)答功能低下或免疫無能。
5、腫瘤細胞分泌某些免疫抑制因子如IL-10、PGE-2、TGF-β等，這些因子對APC具有明顯抑制作用，使APC的抗原提呈發(fā)生困難或直接抑制T、B淋巴細胞的增殖和巨噬細胞的活化；另外，某些腫瘤可分泌FasL(Fas配體；Fas Ligand)，其與相應(yīng)免疫細胞膜表面的死亡受體(Fas)結(jié)合，造成具有潛在抗腫瘤能力的免疫細胞發(fā)生“凋亡”(Apoptotic Death)，而削弱機體抗腫瘤免疫的能力。
6、腫瘤細胞在體內(nèi)的增殖、生長、轉(zhuǎn)移、播散極為迅速，給機體免疫系統(tǒng)造成沉重的“免疫負荷”，使機體抗腫瘤免疫功能相對低下，不足以徹底清除眾多的腫瘤細胞而致使腫瘤失控生長。
另外，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，一個十分值得注意的方面是腫瘤患者機體的抗腫瘤免疫一直處在與腫瘤生長保護機制的抗爭消漲之中。只不過在腫瘤細胞生長旺盛時，機體抗腫瘤免疫免疫應(yīng)答功能低下，處在一種免疫“耐受”或“無能”的負平衡狀態(tài)；即腫瘤患者體內(nèi)具有潛在的抗腫瘤免疫能力。并且，在適當?shù)臈l件下可重新恢復其功能。這是臨床對腫瘤患者實施免疫治療的理論基礎(chǔ)和前提。
綜上所述，腫瘤患者的免疫機能紊亂特征可歸納如下1、腫瘤患者的抗腫瘤免疫應(yīng)答的“負荷超載”；2、腫瘤患者體內(nèi)微環(huán)境的免疫抑制或耐受狀態(tài)；3、腫瘤細胞本身的抗原提呈能力以及其它APC功能低下缺陷，不足以引起機體有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答；四、腫瘤免疫治療的戰(zhàn)略與方案
根據(jù)機體抗腫瘤免疫功能的特殊性結(jié)合免疫學、分子生物學的最新進展以及大量的體外、動物實驗研究成果，當前抗腫瘤臨床免疫治療的戰(zhàn)略設(shè)計為減輕腫瘤免疫負荷及解除抗腫瘤免疫抑制，耐受狀態(tài)；重新激發(fā)、恢復強化患者自身的抗腫瘤免疫功能，達到新的免疫系統(tǒng)正平衡；充分體現(xiàn)腫瘤個體化特異性免疫治療的特點。
臨床上通過手術(shù)切除腫瘤可減輕腫瘤對免疫系統(tǒng)造成的“過度免疫負荷”，通過體外對患者APC功能的人為改變、調(diào)整即避免了腫瘤患者體內(nèi)的免疫抑制微環(huán)境，又顯著提高了APC的抗原提呈功能；通過在體外激活CTL并賦予其特異性識別能力，然后輸回病人體內(nèi)直接發(fā)揮特異性腫瘤殺傷效應(yīng)。達到對“免疫耐受狀態(tài)”的糾正，重新激發(fā)、強化患者自身抗腫瘤免疫機能的臨床療效。
近年來，根據(jù)以上原則，各國科學工作者對各種腫瘤免疫治療方案(腫瘤疫苗設(shè)計)進行了大量的體外、體內(nèi)研究，取得了令人滿意的結(jié)果，尤其對APC中的DC在抗腫瘤治療中的重要作用，給予了一致充分肯定。
下表列舉了近年來國際上常用的主要腫瘤疫苗設(shè)計方案腫瘤疫苗種類及應(yīng)用研究
上述腫瘤疫苗設(shè)計方案中，DC/腫瘤融合細胞是近年來發(fā)展的一種新型腫瘤疫苗，以這種疫苗設(shè)計的臨床治療方案，目前認為是最有前景的腫瘤免疫治療方案。這種疫苗的顯著特點是將具有最強APC功能的DC與腫瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞；該細胞同時具有腫瘤細胞產(chǎn)生全部腫瘤抗原的能力(包括已知和未知的)和DC細胞全面(包括MHC-I/II)提呈腫瘤抗原的能力，同時為免疫活性細胞提供完整的雙信號識別系統(tǒng)，從而有效地激發(fā)免疫活性細胞產(chǎn)生對腫瘤的特異性識別殺傷效應(yīng)，達到臨床治療作用。
上表所列舉的各種腫瘤設(shè)計方案均經(jīng)體外試驗、動物試驗以及臨床前研究證明了其各自的有效性。但仍存在以下主要不足和局限1、制備技術(shù)復雜如純化鑒定腫瘤抗原，基因重組表達腫瘤抗原；腫瘤基因轉(zhuǎn)染技術(shù)等疫苗設(shè)計。2、引入病毒載體分子如腫瘤DNA疫苗和腫瘤基因轉(zhuǎn)染設(shè)計等。3、抗原提呈效率低如RNA導入APC，腫瘤細胞或腫瘤細胞溶解物與APC或T淋巴細胞共培養(yǎng)(Pulse)等設(shè)計。4、抗原提呈不完全如腫瘤DNA疫苗，腫瘤RNA疫苗設(shè)計，其不能通過MHC或HLA-II類分子對腫瘤抗原進行提呈。而腫瘤細胞及其溶解物與APCs或淋巴細胞共培養(yǎng)疫苗設(shè)計又不能有效通過MHC或HLA-I類分子進行腫瘤抗原提呈。5、多數(shù)為單價腫瘤疫苗設(shè)計僅供特定個體患者腫瘤免疫治療使用而無預防免疫方案。6、難以轉(zhuǎn)為生物制藥進行大規(guī)模生產(chǎn)。
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APC細胞或APC前體細胞可取自同一(Autologous)或不同(Allogeinic)生物個體的骨髓、外周血、皮膚、淋巴結(jié)、脾臟，經(jīng)體外處理后或直接用與同一個體或不同個體的同類或不同類腫瘤細胞融合制成APC/腫瘤雜交瘤細胞。APC/腫瘤雜交細胞融合后的雜交細胞同時具有APC細胞和腫瘤細胞的雙重細胞生物學特性；即雜交細胞中APC細胞部分完整高效的抗原提呈系統(tǒng)，如MHC(HLA)生物合成系統(tǒng)攝取、酶學降解處理自身或非自身腫瘤抗原成分形成腫瘤多肽，然后對MHC(HLA)和腫瘤多肽組裝形成MHC(HLA)-腫瘤多肽復合物并表達于細胞膜表面。雜交瘤細胞中的腫瘤細胞部分可持續(xù)不斷合成已知和未知的全部特異性腫瘤抗原和腫瘤相關(guān)抗原，并通過上述APC細胞的抗原提呈系統(tǒng)提呈于細胞膜表面，形成可被腫瘤特異性T淋巴細胞識別的第一信號，即MHC(HLA)-腫瘤抗原多肽復合物。在第二信號協(xié)同刺激因子B7(B7-1和B-7)和其它有關(guān)成分的共同作用下，激活腫瘤抗原特異性T細胞(TH，CTL)，從而全面活化生物體特異性抗腫瘤免疫，對腫瘤細胞進行殺傷清除。
本發(fā)明首次表明激活機體抗腫瘤特異性免疫并不需要以完整的APC/腫瘤雜交細胞作為疫苗，APC/腫瘤雜交細胞的提取物具有與完整雜交細胞相同的腫瘤疫苗活性。能全面激活人體抗腫瘤特異性免疫，尤其能強有效地刺激CD4+(TH)和CD8+(CTL)淋巴細胞活化，發(fā)揮對腫瘤細胞的特異性免疫殺傷效應(yīng)。
本發(fā)明建立的APC/腫瘤雜交瘤細胞提取物腫瘤疫苗制備方法較現(xiàn)有APC/腫瘤雜交細胞的全細胞疫苗制備方法更為簡便、安全、有效；適于大規(guī)模生物制藥生產(chǎn)。現(xiàn)存的全細胞性腫瘤疫苗制備需在APC/腫瘤細胞融合前對腫瘤細胞進行放射性滅活處理，使腫瘤細胞喪失分化增殖能力，需要昂貴的放射性照射儀；另外，經(jīng)放射線處理后的腫瘤細胞有可能產(chǎn)生腫瘤特異性抗原基因突變(Mutation)使腫瘤原有腫瘤特異性抗原發(fā)生改變，導致腫瘤疫苗的特異性下降；另外由于融合后的雜交瘤細胞喪失分化再增殖能力，因此腫瘤疫苗的制備產(chǎn)量受到限制。本發(fā)明在APC/腫瘤細胞融合前可不需對腫瘤細胞進行放射性處理及任何其它滅活處理，能使腫瘤細胞保留其良好的分化，增殖活性以及持續(xù)產(chǎn)生原有腫瘤特異性抗原的能力。一方面顯著提高了細胞融合效率；另一方面APC/腫瘤細胞融合后形成的雜交瘤細胞仍可保持較好的分化增殖活性，可進行體外短期或長期連續(xù)傳代培養(yǎng)，建立永久雜交瘤細胞系，為腫瘤疫苗制備提供豐富的細胞來源，滿足大量腫瘤疫苗制備要求，適于轉(zhuǎn)為生物制藥大規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明中所述及的腫瘤疫苗的另一特征是能根據(jù)實際應(yīng)用需要，靈活調(diào)整、組合疫苗制備方式，從而實現(xiàn)單價、多價、甚至通用腫瘤疫苗的制備。
1、單價腫瘤疫苗制備基本方法是APC細胞和腫瘤細胞均來源于同一生物個體。通過細胞融合技術(shù)獲得APC/腫瘤雜交細胞，在體外特定條件下培養(yǎng)，使雜交細胞產(chǎn)生高水平的MHC(HLA)-腫瘤抗原多肽表達和協(xié)同刺激因子B7表達以及其它相關(guān)細胞因子(如ICAM-1，IFA-3，CD40等)表達。然后制成雜交細胞提取物腫瘤疫苗。其中預留一部分雜交細胞連續(xù)培養(yǎng)建立細胞系備用。由該種方法制備的疫苗具有極強的針對性，可特異性地誘發(fā)同一腫瘤患者機體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫效應(yīng)，對患者體內(nèi)的腫瘤細胞進行選擇性殺滅、清除。從而實現(xiàn)對該腫瘤患者的個體化、特異性生物免疫治療。而由此獲得的雜交細胞系既可用于該腫瘤患者的后續(xù)治療；同時又可作為多價腫瘤疫苗制備的組成部分。
2、多價腫瘤疫苗制備上述單價腫瘤疫苗制備中的APC細胞和腫瘤細胞均采自同一腫瘤患者，由于T細胞特異性識別機制的限制，其疫苗具有嚴格的個體特異性，故在實際應(yīng)用中一般僅限于某特定個體，另外在臨床上常常難以獲得某特定個體患者的腫瘤細胞(如術(shù)后、復發(fā)患者)，以致無法制備自體腫瘤疫苗(Autologous Tumor Vaccine)。在這種情況下可采取以下替代方法獲得單價、多價或廣譜疫苗。應(yīng)用于同類腫瘤或/和不同類腫瘤患者的臨床免疫治療1)自體APC細胞與一種或一種以上的異體同類腫瘤細胞或/和同類腫瘤細胞系融合。如黑色素細胞瘤患者自體APC細胞與多種異體黑色素細胞瘤細胞或細胞系融合，形成自體APC/多種異體黑色素細胞瘤雜交細胞，這種雜交細胞具有多種黑色素細胞瘤抗原多肽/HLA復合物，同時提呈多種黑色素瘤細胞特異性抗原。將此混合雜交瘤細胞制成細胞提取物，通過黑色素細胞瘤共同抗原交叉提呈機制(Cross Priming)激活患者黑色素細胞瘤抗原特異性T細胞，對相應(yīng)病人實施免疫治療。
2)一個或多個異體APC細胞與多種異體同類或不同類腫瘤細胞和/或腫瘤細胞系融合。
通過腫瘤共同抗原提呈機制或/和特異性腫瘤抗原交叉提呈機制，上述混合雜交細胞提取物仍可激發(fā)或部分激發(fā)患者的抗特異性腫瘤免疫效應(yīng)。
由一個以上多個個體APC細胞與多個同類或不同類腫瘤細胞進行融合，可制備針對同類腫瘤的單價疫苗也可制備針對多種腫瘤的多價疫苗。
本發(fā)明中所述及的APC/腫瘤雜交細胞提取物可經(jīng)過進一步純化獲得相應(yīng)的單一組分或純化組分，根據(jù)臨床應(yīng)用需要分別單獨使用或組合使用。其主要包括但不限于下列內(nèi)容細胞膜組分、細胞漿組分、細胞核組分；HLA組分HLA-腫瘤多肽復合物、HLA-I腫瘤多肽復合物、HLA-II-腫瘤多肽復合物、熱休克蛋白(Heat Shock Protein；HSP)、HSP-腫瘤多肽復合物、蛋白組分、RNA、DNA分子及其片段多肽組分、腫瘤相關(guān)抗原及其多肽組分、腫瘤特異性抗原及其多肽組分、細胞膜受體組分、各種CD分子組分等。來自多種APC/腫瘤雜交瘤細胞提取物及其各種上述組分可根據(jù)具體患者腫瘤類型組合成各種具有多價或廣譜抗腫瘤的活性疫苗。
本發(fā)明中所述及的腫瘤疫苗另一特征是具有抗腫瘤免疫治療和腫瘤預防性免疫的雙重功能。根據(jù)實際需要，利用上述多價或廣譜腫瘤疫苗對正常人群或某些相應(yīng)腫瘤高危人群進行預防性免疫，使其處在正常生理狀態(tài)下的免疫細胞獲得完整的腫瘤抗原刺激；即HLA-腫瘤特異性多肽復合物和協(xié)同刺激因子等。通過特異性識別機制，接受腫瘤疫苗免疫正常機體處在靜息狀態(tài)的T淋巴細胞免疫系統(tǒng)活化并產(chǎn)生特異性的免疫記憶細胞(Memory cells)。上述過程與機體免疫系統(tǒng)初次接受某種異已抗原成分發(fā)生的效應(yīng)十分類似。當對同一個體進行第二次相同腫瘤疫苗接種(二次接種或加強免疫)或該個體出現(xiàn)相應(yīng)的腫瘤細胞生長，且該腫瘤細胞的腫瘤抗原成分可被初次腫瘤疫苗產(chǎn)生的特異性記憶淋巴細胞識別時，即可迅速全面誘發(fā)機體細胞免疫(記憶性T細胞)和體液免疫系統(tǒng)(記憶性B細胞)的抗腫瘤應(yīng)答，對相應(yīng)的細胞進行特異性殺傷、清除，從而阻止腫瘤細胞的繼續(xù)生長、預防腫瘤形成。
免疫佐劑(Immuno-Adjuvant)屬于一類非特異性免疫增強劑。這類佐劑包括卡介苗(BCG)、短小棒狀桿菌(CP)、脂多糖(CPS)、弗氏佐劑(CFA和IFA)、脂質(zhì)體等。當其與特異性抗原或免疫刺激物如疫苗先后或同時使用時，可增強、延長、放大機體特異性免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明所述及的腫瘤疫苗在具體應(yīng)用中強調(diào)與上述免疫佐劑配合使用，借以加強腫瘤疫苗在腫瘤預防免疫和抗腫瘤免疫治療中的作用，進一步強化生物機體的特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。
本發(fā)明所述及的腫瘤疫苗在實際臨床應(yīng)用中，可與其它各種腫瘤治療方法同時或先后使用，如手術(shù)、化療、放療、各種生物因子治療，以及其它免疫治療如抗體治療等。其中，本發(fā)明著重強調(diào)與特異性細胞免疫方法的聯(lián)合使用。這種方案的基本設(shè)計為以本發(fā)明所述及的腫瘤疫苗或其它腫瘤疫苗在體外IL-2等其它刺激因子的參與下與腫瘤患者自身的T淋巴細胞進行共培養(yǎng)，使T淋巴細胞脫離患者免疫抑制內(nèi)環(huán)境在體外適當培養(yǎng)條件下接受腫瘤疫苗的特異性刺激活化，形成腫瘤特異性CTL并進行大量增殖，然后回輸病人體內(nèi)迅速直接發(fā)揮特異性腫瘤殺傷效應(yīng)。在腫瘤特異性CTL回輸?shù)耐瑫r或回輸前后，接種腫瘤疫苗，可加強放大延長患者機體特異性抗腫瘤免疫效應(yīng)能力。
舉例例一外周血DC制備1、無菌條件下抽取人體外周血10-300ml。2、以Ficoll-Paque梯度離心分離單個核細胞并混懸在RPMI1640培養(yǎng)液中。3、將單個核細胞培養(yǎng)瓶置于37℃，CO2孵箱溫育30分鐘-5小時。4、吸棄非貼壁細胞。5、以培養(yǎng)液洗滌貼壁細胞后加入一定量的DC培養(yǎng)液(RPMI1640，1％-30％人血清；50-2000單位/ml的GM-CSF和IL-4)。6、在37℃，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-12天；收獲前加入一定量的INF促進DC進一步成熟。7、收獲成熟的DC混懸于培養(yǎng)液中備用。例二骨髓DC制備1、無菌、麻醉條件下按臨床常規(guī)由人體髂骨穿刺抽取5-100ml骨髓。2、低速離心后，吸棄上清液，加入一定量的紅細胞(RBC)沉降液，靜置一定時間。3、加入RBC裂解液，破碎RBC，離心收集骨髓有核細胞。4、按一定濃度將骨髓有核細胞置于培養(yǎng)瓶中，加入DC培養(yǎng)液。5、在37℃，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-12天。6、收獲DC細胞備用。例三實體瘤腫瘤細胞制備1、在無菌條件下將腫瘤組織剪切為1-2mm3的小塊置于PRMI1640培養(yǎng)液中加入一定量的膠原酶和DNA酶。2、在37℃溫育30分鐘-4小時。3、過濾除去塊狀組織后，離心收集細胞組分。4、洗滌細胞加入RBC溶解液破壞RBC。5、離心收集有核細胞后，以Ficoll-Paque分層液梯度離心收集腫瘤細胞。6、混懸腫瘤細胞于適當培養(yǎng)液中備用。例四DC/腫瘤細胞融合(PEG融合)1、將DC和腫瘤細胞按一定比例混合，離心吸棄上清液。2、在37℃溫育無菌條件下緩慢加入一定量的25-55％PEG溶液，邊加邊混勻。3、繼續(xù)緩慢加入5-10ml細胞培養(yǎng)液(含血清的RPMI1640)。4、洗滌離心收獲融合細胞并加入細胞培養(yǎng)液。5、在37℃，CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)2-48小時后用于進一步腫瘤疫苗制備或連續(xù)傳代培養(yǎng)建立細胞系。例五DC/腫瘤雜交細胞提取物疫苗制備(方法一)1、取一定量DC/腫瘤融合細胞，置于無菌試管中2、將上述試管置于-20℃以下，10分鐘-2小時3、取出試管置37℃水浴中5-10分鐘4、重復步驟2、3共2-5次。5、該反復凍融后的DC/腫瘤雜交細胞混合提取物可直接應(yīng)用于臨床腫瘤患者的免疫治療或經(jīng)進一步純化后使用。例六特異性抗腫瘤CTL的誘導制備方法1、按臨床常規(guī)無菌靜脈采集人外周血10-100ml。2、以淋巴細胞分層液梯度，離心收集單個核細胞組分；或以細胞分離機采集外周血單個核細胞。3、將單個核細胞在適當培養(yǎng)液中靜置30分鐘-5小時，收集非附壁細胞。4、經(jīng)洗滌后，將細胞混懸在含血清培養(yǎng)液中并加入培養(yǎng)瓶中。5、在培養(yǎng)液中加入一定量DC/腫瘤雜交細胞提取物以及IL-2等其它因子；在37℃ CO2孵箱中連續(xù)培養(yǎng)5-12天。6、洗滌活化增殖后的CTL備用。例七DC/腫瘤雜交細胞提取物疫苗制備(方法二)1、取一定量DC/腫瘤雜交細胞，置于勻漿器內(nèi)。2、設(shè)定勻漿機轉(zhuǎn)速(rpm)500-5000轉(zhuǎn)/分。3、起動勻漿機，勻漿10秒-1分鐘；暫停勻漿1-5分鐘。重復上述過程3-10次。4、勻漿制備疫苗的全部操作應(yīng)在低溫、無菌條件下進行。5、制備后的疫苗保存在低溫環(huán)境備用。例八DC/腫瘤雜交細胞提取物的臨床抗腫瘤免疫治療方案1、在無菌條件下取一定量的腫瘤疫苗(1000-100,000雜交細胞提取物)，或/和與一定量免疫試劑混合(如BCG等)對病人進行皮下淋巴結(jié)注射。2、同時以一定量的白介素如IL-2或其它細胞因子皮內(nèi)或肌肉注射作為輔助綜合治療；持續(xù)注射3-10天。3、腫瘤疫苗可隔1-4周視臨床情況作重復注射，加強免疫效果。4、在治療過程中對機體各項免疫學指標進行動態(tài)監(jiān)測，適時調(diào)整疫苗治療方案。例九DC/腫瘤雜交細胞提取物的腫瘤預防免疫方案1、在無菌條件下取一定量的相應(yīng)腫瘤疫苗(或與免疫佐劑混合，如BCG等)，對相應(yīng)腫瘤的高危人群或正常人群進行皮下，淋巴結(jié)或周圍組織免疫注射。2、隔14周進行加強免疫注射，共2-3次。3、監(jiān)測各項免疫學指標，評價預防免疫效果。
四、發(fā)明小結(jié)采用腫瘤患者自身APC/腫瘤細胞融合方案制備的細胞雜交性腫瘤疫苗成功的解決了腫瘤病人的特異性個體化抗腫瘤免疫治療難題。但這種全細胞疫苗方案由于制備方法的要求較高以及只適用于某個特定腫瘤患者使用和不能滿足生物制藥規(guī)模生產(chǎn)要求等諸多缺點，使其在臨床抗腫瘤免疫中的應(yīng)用范圍受到嚴格限制。
本發(fā)明以APC/腫瘤細胞雜交瘤的提取物作為一種新型的非全細胞腫瘤疫苗設(shè)計和制備方法，具有獨到的特點和優(yōu)越性；另外，在實際應(yīng)用中的腫瘤免疫治療方案和預防免疫方案具有理論以及實際應(yīng)用上的合理性和可行性。
這種新型腫瘤疫苗將抗腫瘤免疫的個體特異性與多價、廣譜腫瘤疫苗的通用性相結(jié)合，具有抗腫瘤免疫治療和腫瘤預防性免疫的雙重特性。同時，這種腫瘤疫苗的制備方法簡單、靈活、使用安全并易于生物制藥的規(guī)?；a(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種由抗原提呈細胞(Angigen Presenting Cells，APC)尤其是樹突狀細(DendriticCells；DC)和腫瘤細胞經(jīng)融合形成APC/腫瘤細胞雜交細胞的細胞提取物(CellExtracts)作為腫瘤疫苗的制備方法及其在腫瘤預防免疫和抗腫瘤生物免疫治療中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1中的APC/腫瘤細胞雜交細胞進一步解釋為具有特異性激發(fā)生物體抗腫瘤免疫的細胞；尤其指攜帶HLA(MHC)-特異性腫瘤抗原多肽復合物、協(xié)同刺激因子B7(Costimulatory Factor；B7-1，B7-2)和細胞粘附因子(ICAM-1、LFA-3等)；及其它與T淋巴細胞活化有關(guān)的各種成分(CD40等)。
3.權(quán)利要求1中的APC/腫瘤細胞雜交細胞進一步解釋為包括具有或不具有分裂增殖功能的APC/腫瘤細胞雜交細胞；其能暫時產(chǎn)生或/和持續(xù)、永久產(chǎn)生激活腫瘤特異性T淋巴細胞所需的各種生物活性成分。
4.權(quán)利要求1中的APC/腫瘤細胞雜交細胞提取物解釋為通過物理、化學、酶學、生化、生物學方法使APC/腫瘤細胞雜交細胞破裂制備成的亞細胞成分；其至少必須包含一種能夠激活增強生物體特異性抗腫瘤免疫功能的亞細胞成分。
5.權(quán)利要求1中的APC/腫瘤雜交細胞提取物是指具有刺激、增強生物機體抗腫瘤免疫反應(yīng)的任何已知和未知成分。例如細胞膜成分、細胞漿內(nèi)含物、細胞核成分；蛋白質(zhì)分子及其片段、蛋白質(zhì)多肽復合物、脂蛋白、糖蛋白、蛋白質(zhì)復合物、DNA分子其片段、RNA分子等。
6.權(quán)利要求1中APC/腫瘤雜交細胞提取物進一步解釋為包含細胞膜和細胞內(nèi)所有可溶性成分和不可溶成分；但至少必需包含一種或一種以上足以活化生物體特異性抗腫瘤T淋巴細胞的活性成分。該類成分包括已知和未知的蛋白質(zhì)、多肽、蛋白質(zhì)多肽復合物、脂類；DNA分子，RNA分子及其他生物分子。
7.權(quán)利要求1中的APC/腫瘤雜交細胞提取物進一步解釋為通過物理化學方法、生物學方法、免疫學方法如細胞凍融、超聲破碎、微波、電磁波、激光、勻漿、離心、梯度密度離心、層析、親和層析，沉淀、透析、超濾、酶學消化等提取純化方法獲得的單一純化組分或多種純化組分。
8.權(quán)利要求7中雜交細胞提取物純化組分進一步解釋為可活化生物體腫瘤特異性T淋巴的任何單一或復合組分。其主要包括下列內(nèi)容細胞膜組分，MHC(HLA)分子、MHC(HLA)-I分子、MHC(HLA)-II分子、MHC(HLA)-I-腫瘤多肽復合物、MHC(HLA)-II-腫瘤多肽復合物，HSP分子、HSP-腫瘤多肽復合物、B7蛋白、B7.1(CD80)分子、B7.2(CD86)分子、ICAM分子、LFA分子、CD40分子、各種其他CD分子、各種其他細胞粘附因子、各種細胞受體分子、多肽成分、酶成分；或任何已知和未知的腫瘤相關(guān)抗原和特異性腫瘤抗原成分等。
9.權(quán)利要求1中APC細胞解釋為生物體內(nèi)任何具有抗原提呈功能的細胞。其主要包括職業(yè)性抗原提呈細胞樹突狀細胞、巨噬細胞、B淋巴細胞；非專職性抗原提呈細胞任何具有抗原提呈功能的其它有核細胞，如上皮細胞、內(nèi)皮細胞、間皮細胞、間質(zhì)細胞、纖維細胞、單個核細胞、各種腫瘤細胞等。
10.權(quán)利要求2中的APC細胞進一步解釋為經(jīng)過改造或誘導，使原來不具有APC功能的細胞轉(zhuǎn)化為具有APC功能的細胞。如各種干細胞、胚胎干細胞、血液中的各種干細胞、組織干細胞、纖維母細胞、DC前體細胞、上皮細胞、間皮細胞、內(nèi)皮細胞、間質(zhì)細胞前體細胞、間質(zhì)細胞、腫瘤細胞等。
11.權(quán)利要求1中的APC細胞可通過體外與特異性腫瘤抗原成分共培養(yǎng)(Pulse)，在各種輔助生物因子的共同作用下，使其具有針對相應(yīng)腫瘤抗原的特異性抗原提呈功能。
12.權(quán)利要求1中的APC細胞進一步解釋為經(jīng)過分子生物學方法，細胞生物學方法改造或誘導使原來不具有APC功能的細胞或APC前體細胞轉(zhuǎn)變成為具有APC功能的細胞。如基因或重組基因?qū)毎霓D(zhuǎn)染；RNA導入，或以特異性蛋白成分交聯(lián)于細胞膜表面分子，或腫瘤特異性多肽負載其細胞表面上的HLA(MHC)分子；或以一種或一種以上的細胞因子誘導刺激等方法。
13.權(quán)利要求1中的腫瘤細胞進一步解釋為存在于生物體未經(jīng)改造或誘導處理，或經(jīng)過改造或誘導處理的腫瘤細胞，從而增強其腫瘤抗原提呈能力或腫瘤免疫源性以刺激特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。
14.權(quán)利要求1中的APC/腫瘤融合雜交細胞制備的特征是在APC和腫瘤細胞融合前，可對腫瘤細胞進行射線、藥物等滅活處理，使其喪失增殖能力；或無需對腫瘤細胞進行放射性滅活或其它滅活處理，從而保證在形成融合細胞后，仍保持雜交細胞持續(xù)產(chǎn)生原始腫瘤抗原和有效的腫瘤抗原提呈能力以及細胞分裂增殖活性。
15.權(quán)利要求1中的細胞融合技術(shù)解釋為任何使兩個生物活性細胞形成另一新雜交細胞的物理、化學、生物學技術(shù)和方法；其包括電融合、PEG融合、微波細胞融合、受體介導融合等方法。APC/腫瘤雜交細胞的融合方式主要包括以下種類a)自體APC細胞與自體腫瘤細胞融合形成的雜交細胞b)自體APC細胞與異體腫瘤細胞或腫瘤細胞系融合形成的雜交細胞c)自體APC細胞與來自多個異體的腫瘤細胞或腫瘤細胞系融合形成的雜交細胞d)異體APC細胞與異體腫瘤細胞或腫瘤細胞系融合形成的雜交細胞e)多個異體APC細胞與多個異體腫瘤細胞或腫瘤細胞系融合形成的混合雜交細胞
16.權(quán)利要求1中的APC/腫瘤雜交細胞提取物至少含有一種或一種以上的APC/腫瘤雜交細胞成分，即雜交細胞提取物可來自一種APC/腫瘤細胞雜交細胞，也可來自多種APC/腫瘤雜交細胞。
17.權(quán)利要求1中的APC細胞和腫瘤細胞可分別來自同一人類或非人類生物個體，亦可來自不同的人類或非人類生物個體。
18.APC/細胞與腫瘤細胞融合后，需在體外進行適當時間(30分鐘以上)培養(yǎng)借以保證雜交細胞特異性提呈腫瘤抗原生物學過程的完成。APC/腫瘤細胞雜交細胞可在體外進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，建立永久雜交細胞系作為腫瘤疫苗來源。
19.該腫瘤疫苗引入生物體內(nèi)的途徑包括皮下皮內(nèi)注射，淋巴結(jié)周圍注射、淋巴結(jié)內(nèi)注射、肌肉注射、靜脈注射、胸腔注射、腹腔注射、脊髓鞘內(nèi)注射腫瘤周圍局部注射、腫瘤內(nèi)注射、全身多點注射等。上述引入途徑可視具體情況單獨使用或聯(lián)合使用。
20.該腫瘤疫苗引入生物體內(nèi)的方式包括單獨使用或與其它一種或一種以上免疫佐劑如卡介苗(BCG)、QS-21、HSP、ISCOMS、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑；或與一種或一種以上的細胞因子、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素12(IL-12)、γ-干擾素(INF γ)、GM-CSF聯(lián)合使用；或與經(jīng)體外培養(yǎng)、刺激、誘導、活化、增殖后具有特異性腫瘤殺傷效應(yīng)的細胞毒性T淋巴細胞(Cytoxicity T Cells；CTL)的回輸治療聯(lián)合使用；或與抗腫瘤特異性抗體治療或其它增強免疫功能的抗體如抗CD40抗體、抗CD28抗體聯(lián)合使用等。
21.本發(fā)明中的腫瘤及腫瘤細胞解釋為包括良性、惡性腫瘤的任何原發(fā)性及繼發(fā)性和轉(zhuǎn)移的腫瘤和腫瘤細胞。這些腫瘤、腫瘤細胞的組織來源可為上皮組織、間葉組織、血液組織等；例如各種癌、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、母細胞瘤、纖維瘤，各種肺癌、腸癌(大腸癌、結(jié)腸癌、直腸癌等)；各種肝癌；各種胃癌；各種腎癌；前列腺癌；各種乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌；各種皮膚癌、黑色素細胞瘤；各種鼻咽癌；各種食道癌等。
全文摘要
本發(fā)明以抗原提呈細胞(Antigen Presenting Cells，APC)尤其是樹突狀細胞(DendriticCells，DCs)與腫瘤細胞融合形成雜交細胞，然后將此雜交細胞制成細胞提取物作為非細胞性腫瘤疫苗(Cell Free Tumor Vaccine)應(yīng)用于臨床腫瘤的預防免疫和生物免疫治療。該疫苗可特異性地誘導、激活、增強生物體預防腫瘤和抗腫瘤免疫機能。對生物體新生的腫瘤和現(xiàn)存的腫瘤細胞發(fā)揮選擇性、特異性殺傷效應(yīng)。因此，該腫瘤疫苗同時具有腫瘤預防免疫和抗腫瘤免疫治療的雙重特性。
文檔編號C12N5/16GK1446583SQ0215344
公開日2003年10月8日 申請日期2002年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月29日
發(fā)明者陳格, 蔡鵬 申請人:帕弗瑞生物技術(shù)(北京)有限公司