專(zhuān)利名稱(chēng)：人瘦素蛋白在雞蛋蛋清中的特異表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域?qū)儆趧?dòng)物生物反應(yīng)器或基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及由自主設(shè)計(jì)和克隆各類(lèi)適合于人瘦素蛋白在雞蛋蛋清中特異表達(dá)的表達(dá)元件，并克隆為人瘦素蛋白輸卵管組織特異性表達(dá)的表達(dá)載體pXABOBSV40，利用脂質(zhì)體-精子雙載體系統(tǒng)導(dǎo)入外源基因獲得轉(zhuǎn)基因雞，最終在雞蛋蛋清中特異表達(dá)了有正確立體結(jié)構(gòu)的重組人瘦素蛋白，為利用雞輸卵管(雞蛋蛋清)生物反應(yīng)器生產(chǎn)有藥用、保健及生化試劑作用的蛋白質(zhì)奠定基礎(chǔ)。
人瘦素蛋白(leptin)是1994年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)由167個(gè)氨基酸組成的小蛋白，由脂肪組織產(chǎn)生，是肥胖相關(guān)的信號(hào)。脂肪組織的反饋信號(hào)作用到腦中心，控制飲食行為和活動(dòng)(代謝和運(yùn)動(dòng))，是ob(obese)基因的產(chǎn)物。脂肪組織產(chǎn)生的瘦素蛋白經(jīng)血液運(yùn)輸?shù)侥X，與下丘腦的受體作用后通過(guò)控制飲食攝入和能量消耗來(lái)控制哺乳動(dòng)物的體重(25-55歲)。實(shí)驗(yàn)證明注射瘦素蛋白可以將肥胖小鼠的體重恢復(fù)正常，被認(rèn)為是最具潛力的減肥藥物之一。如能在雞蛋蛋清中實(shí)現(xiàn)特異性高表達(dá)，將具有重大理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明提出的在雞蛋蛋清中特異表達(dá)外源基因人瘦素蛋白的方法，包括構(gòu)建一種可在雞蛋蛋清(雞輸卵管組織)特異表達(dá)人瘦素蛋白的表達(dá)載體pXABOBSV40，并通過(guò)脂質(zhì)體-精子雙載體法獲得轉(zhuǎn)基因雞，該轉(zhuǎn)基因后代雞所產(chǎn)雞蛋的蛋清中有可表達(dá)重組人瘦素蛋白，所表達(dá)的重組人瘦素蛋白具有天然的立體結(jié)構(gòu)，表達(dá)水平達(dá)到30毫克/升蛋清。
本發(fā)明中，可在雞蛋蛋清(雞輸卵管組織)特異表達(dá)人瘦素蛋白的表達(dá)載體pXABOBSV40，具體克隆流程見(jiàn)
圖1所示。該載體以pSK為出發(fā)質(zhì)粒，基本構(gòu)成元件包括X(Mar)元件(300-500bp)、卵清蛋白基因的啟動(dòng)子A片段(1.45kb)、卵清蛋白基因的第一個(gè)內(nèi)含子B片段(1.55kb)、ob基因(504bp)和SV40的大T抗原的轉(zhuǎn)錄終止子或卵清蛋白C片段作為轉(zhuǎn)錄終止子，以上各元件分別通過(guò)PCR反應(yīng)獲得，以特定限制性酶切位點(diǎn)克隆為輸卵管組織特異表達(dá)載體pXABOBSV40。
本發(fā)明中，通過(guò)脂質(zhì)體—精子雙載體法獲得轉(zhuǎn)基因雞的步驟如下由雞蛋蛋黃純化卵磷脂；構(gòu)建的表達(dá)載體pXABOBSV40用Sac I酶切線性化，加入質(zhì)粒DNA量1/10-1/20的魚(yú)精蛋白，超聲波法制備脂質(zhì)體；人工采集雄雞精子，用37℃-39℃預(yù)溫的KR溶液洗精液，離心收集精子后以37℃-39℃預(yù)溫的KR溶液懸浮精子，加入包埋有DNA的脂質(zhì)體，混勻后37℃-39℃保溫20-30分鐘，立即進(jìn)行人工授精，授精的精子數(shù)量控制在一只正常采精公雞采出的精液經(jīng)上述處理后與20只雌雞進(jìn)行人工授精，4天后同樣方法強(qiáng)化一次人工授精，收集雞蛋集中孵化21天得“轉(zhuǎn)基因”后代雞。
本發(fā)明中，各表達(dá)元件的克隆，進(jìn)一步介紹如下根據(jù)Genbank公布的前述各表達(dá)元件的序列，設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并引入克隆用雙酶切位點(diǎn)，X元件5’端和3’端的酶切位點(diǎn)為分別是Sac I和Not I；A片段5’和3’端的酶切位點(diǎn)分別為Not I和HindIII；B片段5’和3’兩端的酶切位點(diǎn)分別為HindIII和Nco I；ob基因通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，PCR獲得雙鏈cDNA，其5’和3’兩端的酶切位點(diǎn)為Noc I和Xho I；SV40的polyA或卵清蛋白C片段轉(zhuǎn)錄終止子的5’和3’兩端的酶切位點(diǎn)分別是Xho I和Kpn I。利用質(zhì)粒pSK上的多克隆酶切位點(diǎn)一步一步把以上元件克隆串聯(lián)起來(lái)組成雞輸卵管組織特異表達(dá)載體pXABOBSV40，克隆后的表達(dá)質(zhì)粒以PCR和酶切鑒定。
本發(fā)明中，獲得轉(zhuǎn)基因雞的步驟進(jìn)一步描述如下大規(guī)模制備表達(dá)載體pXABOBSV40，用SacI限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行線性化處理，純化后與1/10-1/20量的魚(yú)精蛋白混合，用于脂質(zhì)體包埋；從雞蛋蛋黃中通過(guò)丙酮-乙醚反復(fù)抽提卵磷脂，中性氧化鋁層析純化卵磷脂，純化的卵磷脂加入KR溶液(120mM NaCl，20mM KCl，5mM CaCl2，2mM MgSO4，30mMNaHCO3)，超聲波懸浮，加入待包埋的表達(dá)載體混合，加入與卵磷脂等量的用KR溶液溶解的膽酸鈉，對(duì)PBS透析獲得包埋了表達(dá)載體的脂質(zhì)體，脂質(zhì)體的大小通過(guò)控制組份比例控制在φ100-200nm左右；采集新鮮精液，用37℃-39℃預(yù)溫的KR溶液洗精液，離心收集精子后用KR溶液懸浮精子，加入包埋有表達(dá)載體的脂質(zhì)體，混勻后37℃-39℃保溫20-30分鐘，立即進(jìn)行人工授精，授精的精子數(shù)量控制在一只正常采精公雞采出的精液經(jīng)上述處理后與20只雌雞進(jìn)行人工授精。4天后重復(fù)上述人工授精一次，收集的雞蛋集中在全自動(dòng)控制的孵化箱內(nèi)孵化21天得“轉(zhuǎn)基因”后代雞。
本發(fā)明進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因雞的后代雞的外源基因及所產(chǎn)雞蛋蛋清中的外源基因表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，其方法和結(jié)果如下對(duì)后代“轉(zhuǎn)基因雞”一周齡開(kāi)始靜脈采血，按血細(xì)胞總DNA抽提方法抽提總DNA，設(shè)計(jì)ob基因PCR檢測(cè)特異引物，以無(wú)DNA模板的無(wú)菌水和非轉(zhuǎn)基因雞血細(xì)胞DNA為陰性對(duì)照，pXABOBSV40為陽(yáng)性對(duì)照，按人ob基因特異序列，設(shè)計(jì)并合成特異擴(kuò)增引物，PCR反應(yīng)檢測(cè)小雞總DNA中的外源基因，檢測(cè)結(jié)果顯示60％以上的后代雞帶有導(dǎo)入的外源基因pXABOBSV40。PCR檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。
對(duì)PCR反應(yīng)為陽(yáng)性的雞所產(chǎn)雞蛋蛋清蛋白進(jìn)行Western bloting分析，收集PCR反應(yīng)陽(yáng)性雞所產(chǎn)雞蛋雞蛋，PBS抽提蛋清蛋白。以自制的多抗(人ob基因克隆到pET41a中，在大腸桿菌B21中的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物—融合人瘦素蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，割膠帶取蛋白免疫兔子，獲得多克隆抗體)作為一抗進(jìn)行Western blotting分析，以非轉(zhuǎn)基因雞的雞蛋蛋清蛋白作為陰性對(duì)照，檢測(cè)雞蛋蛋清蛋白中重組人瘦素蛋白的表達(dá)情況(結(jié)果見(jiàn)圖3)，陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果顯示有24％的PCR反應(yīng)陽(yáng)性雞所產(chǎn)的雞蛋蛋清中表達(dá)了重組人瘦素蛋白。用購(gòu)自Biomol Research Laboratories(USA)的ELISA試劑盒，對(duì)個(gè)別Western blot陽(yáng)性雞的雞蛋蛋清中的Leptin進(jìn)行了定量分析，該試劑盒產(chǎn)用“三明治”原理，在96孔板上預(yù)包埋了抗人Leptin的單克隆抗體，當(dāng)樣品中的Leptin與該單抗結(jié)合后，再用結(jié)合位點(diǎn)不同于第一個(gè)單克隆抗體的第二個(gè)單克隆抗體進(jìn)行結(jié)合和顯色，因此特異性高，而且所反映的應(yīng)該是擁有完整天然立體結(jié)構(gòu)的Leptin的量。反應(yīng)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因雞雞蛋蛋清中確實(shí)表達(dá)了重組人瘦素蛋白，所表達(dá)的重組人瘦素蛋白與天然人瘦素蛋白有相同的立體結(jié)構(gòu)，定量分析顯示，轉(zhuǎn)基因雞雞蛋蛋清中表達(dá)重組人瘦素蛋白的表達(dá)水平為30mg/L蛋清。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)構(gòu)建了人瘦素蛋白基因能特異性在雞輸卵管中(最終可分泌到蛋清中)表達(dá)的表達(dá)載體。其中利用了一系列的分子遺傳學(xué)原理和分子生物學(xué)技術(shù)，在系統(tǒng)分析蛋清蛋白表達(dá)的分子機(jī)制后，根據(jù)現(xiàn)代真核生物分子遺傳學(xué)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)和克隆表達(dá)載體所需的各種元件，構(gòu)建了適于蛋清中特異表達(dá)的重組人瘦素蛋白表達(dá)載體。
(2)提供了有效的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。將脂質(zhì)體用于包埋外源表達(dá)載體。包埋后帶有外源表達(dá)載體的脂質(zhì)體與精子混合后對(duì)母雞人工授精，利用精卵受精過(guò)程把外源基因有效轉(zhuǎn)染到受精卵中。大規(guī)模轉(zhuǎn)基因雞試驗(yàn)顯示，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因方法的外源基因在轉(zhuǎn)基因后代雞中的有效率達(dá)到60％。
(3)通過(guò)Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)基因雞的雞蛋蛋清是否有外源基因人瘦素的表達(dá)產(chǎn)物，由轉(zhuǎn)基因雞所產(chǎn)蛋的蛋清的Western blotting結(jié)果顯示，約24％的轉(zhuǎn)基因雞可表達(dá)人瘦素蛋白。ELISA檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因雞的雞蛋蛋清中所表達(dá)的重組人瘦素蛋白與天然人瘦素蛋白的結(jié)構(gòu)一致，具有正確的立體結(jié)構(gòu)，瘦素蛋白的表達(dá)量達(dá)到30毫克/升蛋清。
本發(fā)明可應(yīng)用于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用雞蛋蛋清生產(chǎn)供藥用人瘦素蛋白的生物反應(yīng)器，或進(jìn)一步直接開(kāi)發(fā)雞蛋作為減肥保健品，也可為深入研究瘦素蛋白功能或檢測(cè)人瘦素蛋白提供蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
圖2為轉(zhuǎn)基因后代雞PCR檢測(cè)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖3為轉(zhuǎn)基因雞蛋蛋清蛋白的Western blotting檢測(cè)圖。其中，圖3(A)為蛋清蛋白SDS-PAGE圖，圖3(B)為Western blotting圖。
獲得轉(zhuǎn)基因雞的步驟進(jìn)一步描述如下大規(guī)模制備表達(dá)載體pXABOBSV40，用SacI限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行線性化處理，純化后與1/10量的魚(yú)精蛋白混合，用于脂質(zhì)體包埋；從雞蛋蛋黃中通過(guò)丙酮-乙醚反復(fù)抽提卵磷脂，中性氧化鋁層析純化卵磷脂，純化的卵磷脂加入KR溶液(120mM NaCl，20mM KCl，5mM CaCl2，2mM MgSO4，30mM NaHCO3)，超聲波懸浮，加入待包埋的表達(dá)載體混合，加入與卵磷脂等量的用KR溶液溶解的膽酸鈉，對(duì)PBS透析獲得包埋了表達(dá)載體的脂質(zhì)體，脂質(zhì)體的大小通過(guò)控制組份比例控制在φ100-200nm左右；采集新鮮精液，用37℃預(yù)溫的KR溶液洗精液，離心收集精子后用KR溶液懸浮精子，加入包埋有表達(dá)載體的脂質(zhì)體，混勻后37℃保溫20分鐘，立即進(jìn)行人工授精，授精的精子數(shù)量控制在一只正常采精公雞采出的精液經(jīng)上述處理后與20只雌雞進(jìn)行人工授精。4天后重復(fù)上述人工授精一次，收集的雞蛋集中在全自動(dòng)控制的孵化箱內(nèi)孵化21天得“轉(zhuǎn)基因”后代雞。
按照前述方法對(duì)轉(zhuǎn)基因雞的后代雞的外源基因及所產(chǎn)雞蛋蛋清中的外源基因表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示后代雞帶有導(dǎo)入的外源基因pXABOBSV40。PCR檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。
檢測(cè)雞蛋蛋清蛋白中重組人瘦素蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖3所示，陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果顯示雞蛋蛋清中表達(dá)了重組人瘦素蛋白。所表達(dá)的重組人瘦素蛋白與天然人瘦素蛋白有相同的立體結(jié)構(gòu)，定量分析顯示，轉(zhuǎn)基因雞雞蛋蛋清中表達(dá)重組人瘦素蛋白的表達(dá)水平為30mg/L蛋清。
權(quán)利要求
1.一種在雞蛋蛋清中特異表達(dá)外源基因人瘦素蛋白的方法，其特征在于構(gòu)建一種可在雞蛋蛋清特異表達(dá)人瘦素蛋白的表達(dá)載體pXABOBSV40，并通過(guò)脂質(zhì)體-精子雙載體法獲得轉(zhuǎn)基因雞，該轉(zhuǎn)基因后代雞所產(chǎn)雞蛋的蛋清中有轉(zhuǎn)基因雞可表達(dá)重組人瘦素蛋白，所表達(dá)的重組人瘦素蛋白具有天然的立體結(jié)構(gòu)，表達(dá)水平達(dá)到30毫克/升蛋清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于構(gòu)建載體pXABOBSV40的步驟如下該載體以pSK為出發(fā)質(zhì)粒，基本構(gòu)成元件包括X(Mar)元件(300-500bp)、卵清蛋白基因的啟動(dòng)子A片段(1.45kb)、卵清蛋白基因的第一個(gè)內(nèi)含子B片段(1.55kb)、ob基因(504bp)和SV40的大T抗原的轉(zhuǎn)錄終止子或卵清蛋白C片段作為轉(zhuǎn)錄終止子，以上各元件分別通過(guò)PCR反應(yīng)獲得，以特定限制性酶切位點(diǎn)克隆為輸卵管組織特異表達(dá)載體pXABOBSV40。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于獲得轉(zhuǎn)基因的雞的步驟如下由雞蛋蛋黃純化卵磷脂；構(gòu)建的表達(dá)載體pXABOBSV40用Sac I酶切線性化，加入質(zhì)粒DNA量1/10-1/20的魚(yú)精蛋白，超聲波法制備脂質(zhì)體；人工采集雄雞精子，用37℃-39℃預(yù)溫的KR溶液洗精液，離心收集精子后以37℃-39℃預(yù)溫的KR溶液懸浮精子，加入包埋有DNA的脂質(zhì)體，混勻后37℃-39℃保溫20-30分鐘，立即進(jìn)行人工授精，4-6天后同樣方法強(qiáng)化一次人工授精，收集雞蛋集中孵化21天得“轉(zhuǎn)基因”后代雞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于超聲法制備脂質(zhì)體的步驟如下從雞蛋蛋黃中通過(guò)丙酮-乙醚反復(fù)抽提卵磷脂，中性氧化鋁層析純化卵磷脂，純化的卵磷脂加入KR溶液，超聲波懸浮，加入待包埋的表達(dá)載體混合，加入與卵磷脂等量的用KR溶液溶解的膽酸鈉，對(duì)PBS透析獲得包埋了表達(dá)載體的脂質(zhì)體，脂質(zhì)體的大小通過(guò)控制組份比例控制在φ100-200nm左右。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人瘦素蛋白(leptin)在雞蛋蛋清中特異表達(dá)，屬于動(dòng)物生物反應(yīng)器或基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明構(gòu)建了可在雞蛋蛋清中特異表達(dá)人瘦素蛋白的表達(dá)載體pXABOBSV40；利用脂質(zhì)體－精子載體通過(guò)人工授精獲得帶有外源人瘦素蛋白基因的轉(zhuǎn)基因雞。檢測(cè)結(jié)果顯示，外源基因?qū)氲年?yáng)性率達(dá)60％以上；24％的后代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性雞所產(chǎn)雞蛋蛋清中表達(dá)了重組人瘦素蛋白，該重組人瘦素蛋白具有與天然人瘦素蛋白有相同的立體結(jié)構(gòu)，表達(dá)水平達(dá)到每升蛋清30毫克。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1418953SQ0215123
公開(kāi)日2003年5月21日 申請(qǐng)日期2002年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月12日
發(fā)明者王維榮, 嚴(yán)華祥, 黃偉達(dá), 楊長(zhǎng)鎖, 謝承光, 閔太善, 朱蕾, 張永芳, 陳瓔, 夏冠軍, 李明, 王億軍 申請(qǐng)人:上海復(fù)旦新楊生物科技有限責(zé)任公司, 復(fù)旦大學(xué)