專利名稱：通過遺傳改變莽草酸路徑來改變生物體中精細(xì)化學(xué)品含量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)生物體尤其是植物用來產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品尤其是維生素E、維生素K和/或泛醌的方法，其中所述生物體尤其是植物的莽草酸路徑在野生型基礎(chǔ)上被遺傳改變，本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因生物體自身。
生物體，尤其是植物，呈現(xiàn)出一系列具有高經(jīng)濟(jì)重要性的作為精細(xì)化學(xué)品的代謝物。以舉例方式提及的精細(xì)化學(xué)品為芳族氨基酸、水楊酸衍生物、類苯丙烷(phenylpropanoids)、黃酮類化合物、1，2-二苯乙烯、呫噸酮和醌，尤其是具維生素E或維生素K活性的混合的含異戊二烯基的脂類化合物。
用于產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的生物技術(shù)方法為培養(yǎng)可產(chǎn)生這些精細(xì)化學(xué)品的生物體并從生物體中分離目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品。
以定向方式改變生物體中精細(xì)化學(xué)品含量，通過生物技術(shù)產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的經(jīng)濟(jì)方法及用生物體作為已加工或未加工的食品或飼料是人們所希望的，其中所述以定向方式改變生物體中精細(xì)化學(xué)品含量如增加想要的精細(xì)化學(xué)品含量和/或阻止代謝物向不想要的精細(xì)化學(xué)品的轉(zhuǎn)變。
經(jīng)濟(jì)上重要的精細(xì)化學(xué)品的實(shí)例為塑體醌、泛醌以及類異戊二烯側(cè)鏈連接至芳香母核上的具維生素E或維生素K活性的化合物。
天然存在的具維生素E活性的八種化合物均為6-色原烷醇衍生物(Ullmann工業(yè)化學(xué)百科全書(Ullmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry)，A 27卷(1996)，VCH Verlagsgesellschaft，第4章，478-488，維生素E)。生育酚基團(tuán)(1a-d)顯示一個(gè)飽和側(cè)鏈，而生育三烯酸基團(tuán)(2a-d)顯示一個(gè)不飽和側(cè)鏈 1a，α-生育酚R1＝R2＝R3＝CH31b，β-生育酚R1＝R3＝CH3，R2＝H1c，γ-生育酚R1＝H，R2＝R3＝CH31d，δ-生育酚R1＝R2＝H，R3＝CH3 2a，α-生育三烯酸R1＝R2＝R3＝CH32b，β-生育三烯酸R1＝R3＝CH3，R2＝H2c，γ-生育三烯酸R1＝H，R2＝R3＝CH32d，δ-生育三烯酸R1＝R2＝H，R3＝CH3在本發(fā)明中，維生素E理解為包括具維生素E活性的所有上述生育酚和生育三烯酸。
這些具維生素E活性的化合物是重要的天然脂溶性抗氧化劑。人和動物維生素E缺乏可導(dǎo)致病理生理學(xué)上的疾病。因此，將維生素E化合物作為食品和飼料、藥物制劑和化妝品中的添加物是有大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值的。
天然存在的具維生素K活性的化合物為1，4-萘醌衍生物(Ullmann工業(yè)化學(xué)百科全書，A27卷(1996)，VCH Verlagsgesellschaft，第5章，488-506，維生素K)。葉綠醌(早期名稱維生素K1)呈現(xiàn)出一個(gè)很大程度上飽和的側(cè)鏈，而甲基萘醌類(早期名稱維生素K2)呈現(xiàn)出一個(gè)具4至13個(gè)異戊二烯殘基的不飽和側(cè)鏈。
在本發(fā)明中，維生素K理解為包括所有具維生素K活性的化合物，尤其是上述化合物。
類異戊二烯側(cè)鏈的生物合成始于異戊二烯焦磷酸酯(IPP)。IPP與其異構(gòu)體二甲烯丙焦磷酸酯(DMAPP)相平衡。IPP與DMAPP首尾縮合產(chǎn)生單萜(C10)香葉基焦磷酸(GPP)。進(jìn)一步添加IPP單元產(chǎn)生倍半萜(C15)焦磷酸法呢酯(FPP)和雙萜(C20)香葉基香葉焦磷酸酯(GGPP)。
葉綠醌含有C20葉綠基鏈，其中只有第一個(gè)異戊二烯單元含有雙鍵。GGPP通過香葉基香葉焦磷酸酯氧化還原酶(GGPPOR)轉(zhuǎn)化為葉綠基焦磷酸酯(PPP)，后者進(jìn)一步形成生育酚的起始物質(zhì)。
導(dǎo)致維生素E和K形成的混合的含異戊二烯基脂類的環(huán)結(jié)構(gòu)為醌，其起始代謝物來自莽草酸路徑。
分支酸從赤蘚糖-4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)開始，通過它們的縮合，經(jīng)中間體3’-脫氫奎尼酸、3’-脫氫莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸和5’-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸產(chǎn)生3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)而形成的。赤蘚糖-4-磷酸在卡爾文循環(huán)中形成，而PEP是通過糖原酵解提供的。
在高等植物中，酪氨酸是從分支酸開始，通過預(yù)苯酸和arogenate而形成的。芳族氨基酸酪氨酸轉(zhuǎn)化為羥基苯丙酮酸，后者通過雙加氧作用轉(zhuǎn)化為尿黑酸。
尿黑酸接下來結(jié)合葉綠基焦磷酸酯(PPP)或香葉基香葉焦磷酸酯以形成α-生育酚和α-生育三烯酸的前體，分別名為2-甲基-6-葉綠基-氫醌和2-甲基-6-香葉基香葉基氫醌。與作為甲基供體的S-腺苷甲硫氨酸的甲基化作用步驟首先產(chǎn)生2，3-二甲基-6-葉綠基醌醇，接下來環(huán)化產(chǎn)生γ-生育酚，并進(jìn)一步甲基化產(chǎn)生α-生育酚。
通過過表達(dá)或下調(diào)生育酚合成路徑的生物合成基因來改變植物中的維生素E含量是公知的，為了本發(fā)明的目的，其中所述生育酚合成路徑理解為從羥基苯丙酮酸至生育酚的生物合成路徑。
WO 97/27285描述了通過提高生育酚表達(dá)或通過下調(diào)對羥基苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD)來改變生育酚含量。
WO 99/04622和D.DellaPenna等，科學(xué)(Science)1998，282，2098-2100描述了來自集胞藻屬(Synechocystis)PCC6803和擬南芥菜(Arabidopsisthaliana)的編碼γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的基因序列，并描述了將其摻入轉(zhuǎn)基因植物，后者具改變的維生素E含量。
進(jìn)一步公知在植物中通過過表達(dá)或下調(diào)類異戊二烯側(cè)鏈生物合成路徑的生物合成基因來改變維生素E含量。
WO 99/23231顯示了在轉(zhuǎn)基因植物中香葉基香葉還原酶的表達(dá)導(dǎo)致增加的生育酚生物合成。
WO 00/08169描述了編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶和香葉基香葉焦磷酸酯氧化還原酶的基因序列，并描述了將它們摻入轉(zhuǎn)基因植物，后者具改變的維生素E含量。
雖然所有這些方法產(chǎn)生的生物體尤其是植物具有改變的精細(xì)化學(xué)品維生素E的含量，但對于通過從轉(zhuǎn)基因生物體分離而產(chǎn)生維生素E的方法而言，維生素E含量水平仍經(jīng)常不令人滿意。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供通過培養(yǎng)可產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的生物體或轉(zhuǎn)基因生物體來產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的進(jìn)一步的方法，其中所述生物體或轉(zhuǎn)基因生物體具有不顯示上述現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的優(yōu)化特性。
我們發(fā)現(xiàn)該目的通過這樣一種產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的方法而達(dá)到，其中培養(yǎng)其莽草酸路徑在野生型基礎(chǔ)上被遺傳改變的生物體。
為了本發(fā)明的目的，尤其是對高等植物而言，莽草酸路徑理解為始于D-赤蘚糖-4-磷酸，經(jīng)莽草酸、分支酸、預(yù)苯酸、arogenate、酪氨酸直至并包括4-羥基苯丙酮酸的上述生物合成路徑(G.Michal，生物化學(xué)路徑，生物化學(xué)圖集(Biochemical pathways，Biochemie-Atlas)，SpektrumAkademischer Verlag Heidelberg，柏林，1999，59至60頁，圖4.7-1和第4.7.1章)。
優(yōu)選地，為了本發(fā)明目的，將莽草酸路徑理解為從莽草酸至4-羥基苯丙酮酸的代謝路徑，尤其優(yōu)選地理解為從分支酸至4-羥基苯丙酮酸的代謝路徑，在植物中該代謝路徑從分支酸經(jīng)預(yù)苯酸、arogenate和酪氨酸而進(jìn)行。
精細(xì)化學(xué)品理解為來自莽草酸路徑的生物體代謝產(chǎn)物。在此上下文中，莽草酸路徑如上所述始于D-赤蘚糖-4-磷酸并終止于4-羥基苯丙酮酸。對于這些代謝物而言，莽草酸路徑的起始化合物D-赤蘚糖-4-磷酸、終產(chǎn)物4-羥基苯丙酮酸以及所有上述中間體構(gòu)成了由生物體生物轉(zhuǎn)化為代謝物的起始化合物，它們此后也稱為中間體。
優(yōu)選的精細(xì)化學(xué)品為芳族氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)、水楊酸衍生物、葉酸衍生物、類苯丙烷(如木素、木酚素或香豆素，尤其是莨菪亭或莨菪苷)、黃酮類化合物(如查耳酮、黃烷酮、黃烷醇、花色素或異黃酮類化合物)、1，2-二苯乙烯、呫噸酮或醌衍生物(如維生素E、維生素K、泛醌、塑體醌或紫草寧。
尤其優(yōu)選的精細(xì)化學(xué)品為維生素E、維生素K或泛醌，尤其是維生素E。
根據(jù)莽草酸路徑的遺傳改變是否導(dǎo)致朝向形成莽草酸路徑之一部分的某一中間體的代謝物流量增加或減少，在生物體中由該中間體生物合成的精細(xì)化學(xué)品含量得以增加或減少。因此，莽草酸路徑的遺傳改變優(yōu)選地理解為朝向莽草酸路徑中間體的代謝物流量的增加或減少。
導(dǎo)致朝向中間體的代謝物流量增加的莽草酸路徑的遺傳改變，以及由此對應(yīng)的精細(xì)化學(xué)品的遺傳改變?yōu)橄铝蟹椒ˋ、B或CA提高野生型莽草酸路徑中至少一種酶的活性，例如通過過表達(dá)莽草酸路徑的編碼具該酶活性的蛋白質(zhì)的基因，通過關(guān)閉導(dǎo)致中間體產(chǎn)生的代謝路徑的反向調(diào)節(jié)機(jī)制，如關(guān)閉反饋抑制或?qū)朐谀繕?biāo)生物體中不受調(diào)節(jié)的直向同源基因。
B向生物體中導(dǎo)入至少一種這樣的基因，對該基因而言在野生型中不存在直向同源基因且其橋接野生型莽草酸路徑的代謝路徑。例如，由于該新基因的功能，該基因可在橋接終止處引起朝向中間體的物質(zhì)流量增加。
C滅活編碼這樣的酶的基因，該酶與產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物的代謝路徑的酶競爭。
導(dǎo)致朝向中間體的代謝物流量減少的莽草酸路徑的遺傳改變，以及由此對應(yīng)的精細(xì)化學(xué)品的遺傳改變?yōu)橄铝蟹椒―、E或FD過表達(dá)一種代謝基因，并因此提高偏離該中間體的對應(yīng)的酶活性；E滅活編碼形成該中間體的酶的基因，例如通過反義技術(shù)或共抑制來滅活；F表達(dá)這樣的基因，對該基因而言在野生型中不存在直向同源基因。例如該基因可橋接野生型的莽草酸路徑的代謝路徑，并且由于新基因的功能，該基因可引起朝向橋接中間體的物質(zhì)流量減少。
在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物體中莽草酸路徑的遺傳改變導(dǎo)致朝向目標(biāo)中間體的代謝物流量增加，并因此增加了相應(yīng)的目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品。
優(yōu)選通過至少一種選自方法A和B的方法，也就是說通過方法A和/或B，增加朝向莽草酸路徑的目標(biāo)中間體流量并因此增加目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品，方法A和B具有上述含義。
因此，本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括進(jìn)行至少一種選自A和B方法，用于遺傳改變莽草酸路徑，A和B具有下列含義A提高野生型莽草酸路徑的至少一種酶的活性；B將至少一種基因?qū)肷矬w，其中對該基因而言，在野生型中不存在其直向同源基因且其橋接野生型的莽草酸路徑的代謝路徑。
根據(jù)方法A可實(shí)現(xiàn)對野生型莽草酸路徑的至少一種酶活性的提高，例如通過過表達(dá)編碼具該酶活性的蛋白質(zhì)的核酸即莽草酸路徑的基因，通過關(guān)閉導(dǎo)致中間體產(chǎn)生的代謝路徑的反向調(diào)節(jié)機(jī)制，如關(guān)閉反饋抑制或?qū)朐谀繕?biāo)生物體中不受調(diào)節(jié)的直向同源基因。
優(yōu)選地，野生型莽草酸路徑的至少一種酶的活性是根據(jù)方法A通過過表達(dá)莽草酸路徑中編碼具該酶活性的蛋白質(zhì)的核酸而提高的。
在本方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，方法A是通過向生物體導(dǎo)入編碼分支酸變位酶的核酸而進(jìn)行的。
分支酸變位酶理解為具有將分支酸轉(zhuǎn)化為預(yù)苯酸的酶活性的蛋白質(zhì)。
原則上，所有的分支酸變位酶均可用于本發(fā)明的方法中，如歐芹(Petroselinum Crispum)分支酸變位酶(登記號T14902，T14901)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)分支酸變位酶(T36865)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)分支酸變位酶(A33894)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)分支酸變位酶(AAD30065)或下面描述的擬南芥菜分支酸變位酶或下面描述的大腸桿菌(E.coli)分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶(tyrA)的分支酸變位酶活性。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用了編碼這樣的分支酸變位酶的分支酸變位酶基因，其中所述分支酸變位酶的活性在生物體中受到減輕的翻譯后調(diào)節(jié)。減輕的調(diào)節(jié)理解為與野生型的調(diào)節(jié)相比，對活性的調(diào)節(jié)為不超過99％，優(yōu)選地不超過70％，尤其優(yōu)選地為50％，特別優(yōu)選地為0％，即對活性沒有調(diào)節(jié)。
編碼其活性在生物體中受到減輕的調(diào)節(jié)，尤其是不受到調(diào)節(jié)的分支酸變位酶的分支酸變位酶基因?yàn)槔缭诒磉_(dá)位點(diǎn)處受到減輕的翻譯后調(diào)節(jié)，尤其是不受到翻譯后調(diào)節(jié)的來自不同屬生物體的分支酸變位酶基因，或?yàn)閬碜韵嗤矬w或來自相關(guān)屬生物體的分支酸變位酶基因。
根據(jù)本發(fā)明，生物體理解為原核生物或真核生物，如細(xì)菌、酵母、藻類、蘚類植物、真菌或植物，它們作為野生型或通過遺傳改變后可產(chǎn)生上述精細(xì)化學(xué)品。優(yōu)選的生物體為光合活性生物體，如藍(lán)細(xì)菌、蘚類植物、藻類或植物，它們的野生型已能產(chǎn)生上述的精細(xì)化學(xué)品。
尤其優(yōu)選的生物體為植物。
根據(jù)本發(fā)明方法的方法A的一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，將編碼其活性受到減輕的翻譯后調(diào)節(jié)的分支酸變位酶的分支酸變位酶基因?qū)胫参铩?br>
它們?yōu)槔缫恍┘?xì)菌分支酸變位酶基因或由其衍生的分支酸變位酶基因，即為編碼這樣的蛋白質(zhì)的核酸，其中所述蛋白質(zhì)包含細(xì)菌分支酸變位酶的氨基酸序列，其活性在植物中受到減輕的翻譯后調(diào)節(jié)，如下面描述的編碼大腸桿菌分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶(tyrA)的分支酸變位酶活性的核酸或通過氨基酸的替換、插入或刪除而衍生于該序列的序列，后者在氨基酸水平上與細(xì)菌分支酸變位酶的序列具有至少30％的同源性，優(yōu)選地至少50％的同源性，更優(yōu)選地至少70％的同源性，尤其優(yōu)選地至少90％的同源性，且其具有分支酸變位酶的酶特性。
在本說明書中，術(shù)語“替換”理解為用一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸。優(yōu)選進(jìn)行所謂的保守置換，其中替換氨基酸具有與原始氨基酸類似的特性，如用Asp置換Glu、用Asn置換Gln、用Ile置換Val、用Ile置換Leu以及用Thr置換Ser。
刪除是用直接鍵替換氨基酸。優(yōu)選的刪除位置為多肽的末端和獨(dú)立的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)合處。
插入為將氨基酸導(dǎo)入多肽鏈，直接鍵在形式上被一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換。
兩個(gè)蛋白質(zhì)間的同源性優(yōu)選地理解為在全長蛋白質(zhì)中氨基酸的一致性，其優(yōu)選地通過比較，在程序算法GAP(UWGCG，University ofWisconsin，Genetic Computer Group)的輔助下設(shè)置下列參數(shù)來計(jì)算間隔權(quán)重12長度權(quán)重4平均匹配2.912平均不匹配 -2.003因此，在氨基酸水平上與上述大腸桿菌分支酸變位酶的序列具至少30％同源性的蛋白質(zhì)應(yīng)理解為這樣的蛋白質(zhì)，將其序列與上述分支酸變位酶的序列優(yōu)選地使用上述程序算法，用上面設(shè)置的參數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果為具有至少30％的同源性。
細(xì)菌分支酸變位酶基因或由其衍生的分支酸變位酶基因也可編碼具有分支酸變位酶特性和其它酶特性的蛋白質(zhì)，如下述來自大腸桿菌K12的分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶基因(tyrA)。如下所述，當(dāng)組合進(jìn)行方法A和B時(shí)該實(shí)施方案是尤其優(yōu)選的。
在本發(fā)明方法的方法A的一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，尤其是當(dāng)只進(jìn)行方法A時(shí)，將分支酸變位酶基因?qū)肷矬w的特定位點(diǎn)，在該位點(diǎn)處，相應(yīng)的分支酸變位酶受到減輕的翻譯后調(diào)節(jié)。
在此上下文中，優(yōu)選使用在表達(dá)位點(diǎn)處受到減輕的翻譯后調(diào)節(jié)的來自相同生物體或來自相關(guān)屬生物體的編碼分支酸變位酶的核酸。
分離自生物體不同部位的分支酸變位酶同工型在它們的調(diào)節(jié)方面是不同的。
可將來自生物體或相關(guān)屬生物體特定部位的相應(yīng)分支酸變位酶基因?qū)刖幋a的分支酸變位酶不受到翻譯后調(diào)節(jié)的生物體的其它部位。
在植物中本發(fā)明方法的一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案為將編碼植物胞質(zhì)分支酸變位酶的核酸導(dǎo)入植物質(zhì)體來實(shí)施方法A。
原則上適用于此目的的核酸為編碼植物胞質(zhì)分支酸變位酶的所有核酸，優(yōu)選地為編碼擬南芥菜胞質(zhì)分支酸變位酶的核酸(Seq ID No.3)和由其衍生的天然或非天然核酸。
已發(fā)現(xiàn)在多種生物體中，存在多種同工型的分支酸變位酶。因此從擬南芥菜分離了三種不同的分支酸變位酶(Eberhard等，1993，F(xiàn)EBS 334，233-236；Eberhard等，1996，植物雜志(Plant J.)10，815-821；Mobley等，1999，基因(Gene)15；240(1)115-123)。
這些同工型在它們的定位和它們的酶特性方面相互間是不同的。這樣，分支酸變位酶-1位于質(zhì)體且通過芳族氨基酸變構(gòu)調(diào)節(jié)。
胞質(zhì)同工酶分支酸變位酶-2受到未知的調(diào)節(jié)(Benesova，M.Bode，R，植物化學(xué)(Phytochemistry)1992，31，2983-2987)。
編碼擬南芥菜胞質(zhì)分支酸變位酶的核酸以及由其衍生的天然或非天然核酸應(yīng)理解為編碼這樣的蛋白質(zhì)的核酸，其中所述蛋白質(zhì)包含胞質(zhì)分支酸變位酶氨基酸序列(SEQ ID No.4)，或包含通過氨基酸的替換、插入或刪除衍生于該序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ ID No.4具有至少30％的同源性，優(yōu)選地至少50％的同源性，更優(yōu)選地至少70％的同源性，尤其優(yōu)選地至少90％的同源性，且其具有分支酸變位酶的酶特性。
因此，在氨基酸水平上與序列SEQ ID No.4具有至少30％同源性的蛋白質(zhì)應(yīng)理解為這樣的蛋白質(zhì)，通過將其序列與序列SEQ ID No.4優(yōu)選地使用上述程序算法，用上面設(shè)置的參數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果為具有至少30％的同源性。
在本發(fā)明方法的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，將編碼擬南芥菜胞質(zhì)分支酸變位酶(SEQ ID No.4)的核酸導(dǎo)入植物的質(zhì)體。
例如可根據(jù)遺傳密碼通過反向翻譯多肽序列獲得合適的核酸序列。
為此目的優(yōu)選使用的密碼子為那些根據(jù)植物特異的密碼子使用而頻繁使用的密碼子。通過參考計(jì)算機(jī)對所研究植物的其它已知基因的估定易于確定密碼子使用。
在本發(fā)明方法的一個(gè)進(jìn)一步尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，將序列SEQ ID No.3的核酸導(dǎo)入植物質(zhì)體。序列SEQ ID No.3代表擬南芥菜胞質(zhì)分支酸變位酶(分支酸變位酶-2)基因。
將編碼分支酸變位酶的核酸導(dǎo)入植物質(zhì)體可如如下詳述的將分支酸變位酶預(yù)苯酸脫氫酶導(dǎo)入植物那樣通過導(dǎo)入表達(dá)盒而進(jìn)行，其中表達(dá)盒中的核酸序列編碼分支酸變位酶融合蛋白質(zhì)，融合蛋白質(zhì)中的一部分為支配該多肽轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。優(yōu)選葉綠體特異的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其在將胞質(zhì)分支酸變位酶轉(zhuǎn)運(yùn)至葉綠體后，被從分支酸變位酶部分酶切掉。
在本發(fā)明方法的一個(gè)進(jìn)一步尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，將這樣的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物，其中所述核酸構(gòu)建體包含編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸和包含編碼以下蛋白質(zhì)的核酸，該蛋白質(zhì)包含氨基酸序列SEQ ID No.4，或包含通過氨基酸的替換、插入或刪除衍生于該序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ ID No.4具有至少30％的同源性，且其具有分支酸變位酶的酶特性。
編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸為例如在三個(gè)閱讀框中的煙草質(zhì)體轉(zhuǎn)酮醇酶的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的三個(gè)盒的DNA序列，它們?yōu)樵贜coI切割位點(diǎn)處具有ATG密碼子的KpnI/BamHI片段pTP09KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGATCC_BamHIpTP10KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTGGATCC_BamHIpTP11KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGGATCC_BamHI，或?yàn)榫幋a擬南芥菜質(zhì)體分支酸變位酶-1的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸(SEQ ID No.7)KpnI_GGCGTCATTGTTGATGAGATCGTCTTGTTGCTCCTCTGCGATTGGTGGGTTCTTCGACCATCGACGTGAATTATCAACCTCAACACCCATTTCCACTCTTCTTCCTCTTCCATCAACCAAATCTTCTTTCTCTGTTCGTTGTTCTCTTCCTCAGCCATCAAAGCCACGCTCTGGAACCAGCTCTGTTCACGCCGTTATGACACTCG_NCo1編碼擬南芥菜質(zhì)體分支酸變位酶-1的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸優(yōu)選地用于胞質(zhì)分支酸變位酶在質(zhì)體中的定位。
因此，在本發(fā)明方法的一個(gè)進(jìn)一步尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，將這樣的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物，其中所述核酸構(gòu)建體包含編碼擬南芥菜質(zhì)體分支酸變位酶-1的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸和包含編碼以下蛋白質(zhì)的核酸，該蛋白質(zhì)包含氨基酸序列SEQ ID No.4，或包含通過氨基酸的替換、插入或刪除衍生于該序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ ID No.4具有至少30％的同源性，且其具有分支酸變位酶的酶特性。
在本發(fā)明方法的方法A的一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，將包含序列(SEQ ID No.5)的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物。
SEQ ID No.5構(gòu)成了編碼擬南芥菜質(zhì)體分支酸變位酶-1的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸和編碼擬南芥菜胞質(zhì)分支酸變位酶-2的核酸的核酸構(gòu)建體。
本申請尤其涉及這些核酸構(gòu)建體，并涉及它們在本發(fā)明方法的方法A中的應(yīng)用。
圖1以舉例的方式示出了從赤蘚糖-4-磷酸至維生素E的生物合成示意圖。由于分支酸變位酶基因增加的表達(dá)，野生型的莽草酸路徑被遺傳改變，且朝向羥基苯丙酮酸的代謝物流量增加。對于羥基苯丙酮酸，現(xiàn)在可得到較大量的，其進(jìn)一步朝向生育酚反應(yīng)。提高的羥基苯丙酮酸含量導(dǎo)致向維生素E和/或維生素K的轉(zhuǎn)化提高。提高的羥基苯丙酮酸含量優(yōu)選地導(dǎo)致增加的維生素E含量。
如下詳述的那樣構(gòu)建表達(dá)盒使用如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(Molecular CloningA LaboratoryManual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約(1989)；T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合實(shí)驗(yàn)(Experiments with Gene Fusions)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約(1984)以及Ausubel，F(xiàn).M.等，分子生物學(xué)最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience(1987)中所述的常規(guī)重組和克隆技術(shù)將合適的啟動子與合適的分支酸變位酶核酸序列融合，且優(yōu)選地將編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸插入啟動子和分支酸變位酶核酸序列之間，即優(yōu)選地將合適的啟動子與合適的上述核酸構(gòu)建體并與聚腺苷酸化信號融合。
用于改變野生型莽草酸路徑的方法B如上所述通過將至少一種這樣的基因?qū)肷矬w而進(jìn)行，所述基因在野生型中不存在其直向同源基因且其橋接野生型莽草酸路徑的代謝路徑。該基因編碼這樣的酶，由于新的酶活性，該酶引起朝向橋接終止處的中間體的物質(zhì)流量增加。該新的酶活性優(yōu)選地不受生物體的調(diào)節(jié)，也就是說使代謝路徑短路，以避免如在代謝中的限制性調(diào)節(jié)位置。這使得可以將朝向限速物質(zhì)的代謝物流量與現(xiàn)存的調(diào)節(jié)解偶聯(lián)。
與野生型直向同源的基因理解為來自另一生物體的基因，該基因所編碼的酶活性在野生型中已存在。
因此，表述“在野生型中不存在其直向同源基因的基因”理解為來自另一生物體的基因，在轉(zhuǎn)化前該基因所編碼的酶活性不存在于野生型中或未被活化。
與野生型直向同源的基因優(yōu)選地理解為來自另一生物體的功能等同物，功能等同物理解為基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的全部特性。
因此，表述“在野生型中不存在其直向同源基因的基因”優(yōu)選地理解為在野生型中該基因不存在上面定義的功能等同物，因此建立了產(chǎn)生替代代謝路徑的代謝性能，用來產(chǎn)生已存在于植物中的產(chǎn)物(包括代謝物)。
根據(jù)本發(fā)明，如上所述的用于方法A的生物體理解為原核生物體或真核生物體，如細(xì)菌、酵母、藻類、蘚類植物、真菌或植物，它們作為野生型或通過遺傳改變后可產(chǎn)生上述精細(xì)化學(xué)品。優(yōu)選的生物體為光合活性生物體，如藍(lán)細(xì)菌、蘚類植物、藻類或植物，它們的野生型已能產(chǎn)生上述的精細(xì)化學(xué)品。
尤其優(yōu)選的生物體為植物。
因此，在本發(fā)明方法的一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，將植物用作欲轉(zhuǎn)化的生物體。在這種情況下，基因?yàn)榧?xì)菌基因，該基因在優(yōu)選地適于進(jìn)行方法B的植物中不存在其直向同源基因。
在本發(fā)明方法的方法B的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該植物莽草酸路徑的代謝路徑被至少一種導(dǎo)入的基因橋接。
在本發(fā)明方法的方法B的一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，將編碼預(yù)苯酸脫氫酶的核酸導(dǎo)入植物。編碼預(yù)苯酸脫氫酶的所有基因均適用于本發(fā)明方法的該優(yōu)選實(shí)施方案。
預(yù)苯酸脫氫酶理解為具有將預(yù)苯酸轉(zhuǎn)化為4-羥基苯丙酮酸酶活性的酶。
編碼預(yù)苯酸脫氫酶且可用于本發(fā)明方法的核酸的實(shí)例為來自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(存取號X78413)、集胞藻屬spec PCC 6803(slr2081)、恐獸球菌(Deinococcus radiodurans)(AAF10695)或枯草芽孢桿菌(P20692)的預(yù)苯酸脫氫酶基因，這些基因均是已知的，且可從國際互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫中得到。通過將序列與這些已知的預(yù)苯酸脫氫酶基因進(jìn)行同源性比較，可發(fā)現(xiàn)其它的例子，如來自Termotoga maitima(AAD35430)或幽門螺旋體(Heliobacter pylori)26695(存取號AAD08422)的潛在預(yù)苯酸脫氫酶基因。
在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用了預(yù)苯酸脫氫酶基因，導(dǎo)入的是這樣的核酸，其編碼的蛋白質(zhì)包含集胞藻屬spec PCC 6803預(yù)苯酸脫氫酶的氨基酸序列，或包含通過氨基酸的替換、插入或刪除衍生于該序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上與集胞藻屬spec PCC 6803預(yù)苯酸脫氫酶的序列具有至少30％的同源性，優(yōu)選地至少50％的同源性，更優(yōu)選地至少70％的同源性，尤其優(yōu)選地至少90％的同源性，且其具有預(yù)苯酸脫氫酶的酶特性。
因此，在氨基酸水平上與集胞藻屬spec PCC 6803預(yù)苯酸脫氫酶的序列具至少30％同源性的蛋白質(zhì)應(yīng)理解為這樣的蛋白質(zhì)，將其序列與集胞藻屬spec PCC 6803預(yù)苯酸脫氫酶的序列優(yōu)選地使用上述程序算法，用上面設(shè)置的參數(shù)進(jìn)行序列比較，顯示出具有至少30％的同源性。
圖1以舉例的方式示出了從赤蘚糖-4-磷酸至生育酚的生物合成示意圖。由于預(yù)苯酸脫氫酶基因增加的額外表達(dá)，野生型的莽草酸路徑被遺傳改變，且朝向羥基苯丙酮酸的代謝物流量增加。對于羥基苯丙酮酸，現(xiàn)在可得到較大量的，其進(jìn)一步朝向生育酚反應(yīng)。提高的羥基苯丙酮酸含量導(dǎo)致向維生素E和/或維生素K的轉(zhuǎn)化提高。提高的羥基苯丙酮酸含量優(yōu)選地導(dǎo)致增加的維生素E含量。
但根據(jù)需要，將本發(fā)明代謝路徑的橋接與莽草酸路徑過表達(dá)的其它酶結(jié)合是有利的，目的在于達(dá)到使朝向形成目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品的代謝物流量增大。
在本發(fā)明方法的一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，將方法A和B結(jié)合使用。
在本發(fā)明方法變體的一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，將編碼預(yù)苯酸脫氫酶的核酸與編碼分支酸變位酶的核酸組合導(dǎo)入植物。
例如，這種組合可通過導(dǎo)入兩種核酸而實(shí)現(xiàn)，其中兩種核酸分別編碼具分支酸變位酶活性的酶和具預(yù)苯酸脫氫酶活性的酶。對于這種實(shí)施方案，需要將兩種不同的核酸導(dǎo)入植物，其中每一種核酸編碼這些酶之一。
在本發(fā)明方法的一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種組合是通過將一種編碼分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的核酸導(dǎo)入植物而實(shí)現(xiàn)的。
分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶基因編碼的蛋白質(zhì)具有分支酸變位酶和預(yù)苯酸脫氫酶兩者的酶特性。因此導(dǎo)入一種核酸過表達(dá)酶活性，或?qū)朊富钚?，其受到減輕的翻譯后調(diào)節(jié)(分支酸變位酶)且酶特性(預(yù)苯酸脫氫酶)被新導(dǎo)入。
分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶理解為具有將分支酸轉(zhuǎn)化為4-羥基苯丙酮酸的酶活性的酶。
在本發(fā)明方法變體的一個(gè)進(jìn)一步尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，將這樣的核酸導(dǎo)入，其編碼的蛋白質(zhì)包含氨基酸序列SEQ ID No.2，或包含通過氨基酸的替換、插入或刪除衍生于該序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ ID No.2具有至少30％的同源性，優(yōu)選地至少50％的同源性，更優(yōu)選地至少70％的同源性，尤其優(yōu)選地至少90％的同源性，且其具有分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的酶特性。
具有氨基酸序列SEQ ID No.2的蛋白質(zhì)構(gòu)成了大腸桿菌K12分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶(tyrA)。
因此，在氨基酸水平上與序列SEQ ID No.2具有至少30％同源性的蛋白質(zhì)應(yīng)理解為這樣的蛋白質(zhì)，將其序列與序列SEQ ID No.2優(yōu)選地使用上述程序算法，用上面設(shè)置的參數(shù)進(jìn)行序列對比，結(jié)果為具有至少30％的同源性。
本說明書中所提及的所有核酸例如可為RNA、DNA或cDNA序列。
可如上所述根據(jù)遺傳密碼通過反向翻譯多肽序列獲得合適的核酸序列。
為此目的優(yōu)選使用的密碼子為那些根據(jù)生物體特異的密碼子使用而頻繁使用的密碼子。通過參考計(jì)算機(jī)對所研究生物體的其它已知基因的估定易于確定密碼子使用。
例如，如果該蛋白質(zhì)欲在植物中表達(dá)，通常有利地使用植物的密碼子使用來進(jìn)行反向翻譯。
進(jìn)一步優(yōu)選的分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶或編碼它們的核酸尤其為細(xì)菌來源的核酸，如來自草生歐文氏菌(Erwinia herbicola)的分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶基因(存取號X60420；其蛋白質(zhì)也可通過刪除5’末端的109 Bp區(qū)域而轉(zhuǎn)換為單功能的預(yù)苯酸脫氫酶，然后例如如上所述用作預(yù)苯酸脫氫酶)或來自支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)的分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶基因(存取號AAF01289)，或易于從數(shù)據(jù)庫中對多種基因組序列已知的生物體通過將其氨基酸序列或其對應(yīng)的反向翻譯的核酸序列與SEQ ID No.2或上述其它序列如來自揚(yáng)氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)的潛在分支酸變位酶一預(yù)預(yù)苯酸脫氫酶基因(存取號Q58029)進(jìn)行同源性比較而鑒定。
尤其優(yōu)選使用的核酸編碼細(xì)菌分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶。
尤其優(yōu)選使用的核酸具有序列SEQ ID No.1。這種核酸構(gòu)成了原核大腸桿菌K12基因組DNA，其編碼具序列SEQ ID No.2的分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶，也稱為tyrA基因。
圖1以舉例的方式示出了從赤蘚糖-4-磷酸至生育酚的生物合成示意圖。由于分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶基因增加的表達(dá)，野生型的莽草酸路徑被遺傳改變，且朝向形成羥基苯丙酮酸的代謝物流量增加。對于羥基苯丙酮酸，現(xiàn)在可得到較大量的，其進(jìn)一步朝向生育酚反應(yīng)。提高的羥基苯丙酮酸含量導(dǎo)致向維生素E和/或維生素K的轉(zhuǎn)化提高。提高的羥基苯丙酮酸含量優(yōu)選地導(dǎo)致增加的維生素E含量。
在本發(fā)明的用于產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的方法中，優(yōu)選地在培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因生物體的步驟后，收獲該生物體并從生物體分離精細(xì)化學(xué)品。
生物體用適于生物體的已知方式收獲。在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中通過發(fā)酵培養(yǎng)的微生物(如細(xì)菌、蘚類植物、酵母和真菌)或植物細(xì)胞可例如通過離心、傾析或過濾而分離。以已知方式在營養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)植物并收獲。
從收獲的生物量中以已知方式分離精細(xì)化學(xué)品，例如通過提取，并且如果合適的話，采用進(jìn)一步的化學(xué)或物理的純化方法，如沉淀法、結(jié)晶法、熱分離法(如精餾法)或物理分離法如層析法。
例如，優(yōu)選地從含油植物中通過化學(xué)轉(zhuǎn)化和蒸餾從植物油或從蒸汽蒸餾物(除臭劑冷凝物)中分離維生素E，其中所述蒸汽蒸餾物在植物油的除臭過程中獲得。
從除臭劑冷凝物分離維生素E的其它方法例如在DE 31 26 110 A1，EP 171 009 A2，GB 2 145 079，EP 333 472 A2和WO 94/05650中進(jìn)行了描述。
優(yōu)選地通過用包含上述核酸尤其是包含編碼分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的核酸的核酸構(gòu)建體或用上述核酸構(gòu)建體，尤其是編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽和胞質(zhì)分支酸變位酶的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化起始生物體(尤其是植物)來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體(尤其是植物)。
將編碼核酸序列或編碼核酸構(gòu)建體功能性連接至一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)信號的這些核酸構(gòu)建體以下也稱為表達(dá)盒，其中所述一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)信號確保在生物體尤其是在植物中的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
因此，本發(fā)明還涉及這樣的核酸構(gòu)建體，其充當(dāng)表達(dá)盒角色并包含與一個(gè)或多個(gè)確保在生物體尤其是在植物中轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)信號功能性連接的上述核酸，尤其是編碼分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的核酸，或上述核酸構(gòu)建體，尤其是編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽和胞質(zhì)分支酸變位酶的核酸構(gòu)建體。
表達(dá)盒優(yōu)選地包含確保在質(zhì)體中定位的編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸。
表達(dá)盒包含調(diào)節(jié)信號，也稱為調(diào)節(jié)核酸序列，其支配編碼序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，表達(dá)盒包含上游序列(即在編碼序列的5’末端、啟動子)和下游序列(即在3’末端、聚腺苷酸化信號)，且如果合適的話，還包含其它可操作地與插入的編碼序列連接的調(diào)節(jié)元件，其中所述編碼序列至少為上述基因之一?？刹僮鞯剡B接應(yīng)理解為啟動子、編碼序列、終止子的依次排列，且如果合適的話，還有以這種方式排列的其它調(diào)節(jié)元件，其中當(dāng)表達(dá)編碼序列時(shí)，每一調(diào)節(jié)元件可行使其預(yù)期功能。
下文以舉例的方式描述了優(yōu)選的核酸構(gòu)建體、植物表達(dá)盒和產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法。
優(yōu)選的用于可操作連接的序列為(但不限于)確保在質(zhì)外體、液泡、質(zhì)體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)、核、油質(zhì)體或其它區(qū)室中進(jìn)行亞細(xì)胞定位的靶向序列以及翻譯增強(qiáng)子如煙草花葉病毒5’前導(dǎo)序列(Gallie等，核酸研究(Nucl.Acids Res.)15(1987)，8693-8711)。
合適的表達(dá)盒啟動子原則上為任一可支配外源基因在植物中表達(dá)的啟動子。優(yōu)選地使用植物啟動子或來自植物病毒的啟動子。尤其優(yōu)選花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子(Franck等，細(xì)胞(Cell)21(1980)，285-294)。如所知的那樣，該啟動子包含多個(gè)轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子的識別序列，它們總體上導(dǎo)致了插入基因的永久性和組成型表達(dá)(Benfey等，EMBO J.8(1989)，2195-2202)。
表達(dá)盒也可包含化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，這種啟動子可使植物中外源tyrA基因及時(shí)地在特定點(diǎn)表達(dá)。可使用的此類啟動子的實(shí)例尤其為PRP1啟動子(Ward等，植物分子生物學(xué)(Plant.Mol.Biol.)22(1993)，361-366)、水楊酸誘導(dǎo)的啟動子(WO 95/19443)、苯磺酰胺誘導(dǎo)的啟動子(EP-A 388186)、四環(huán)素誘導(dǎo)的啟動子(Gatz等，(1992)植物雜志(Plant J.)2，397-404)、脫落酸誘導(dǎo)的啟動子(EP-A 335528)或乙醇-或環(huán)己酮-誘導(dǎo)的啟動子(WO93/21334)。
進(jìn)一步地，優(yōu)選的啟動子尤其為那些確保在以下組織或植物器官中表達(dá)的啟動子，其中例如精細(xì)化學(xué)品尤其是維生素E或其前體的生物合成在該組織或植物器官中進(jìn)行。必須提及的啟動子尤其是那些確保在葉中特異性表達(dá)的啟動子?？商峒暗膯幼訛轳R鈴薯胞質(zhì)FBPase啟動子或馬鈴薯ST-LSI啟動子(Stockhaus等，EMBO J.8(1989)，2445-245)。
在轉(zhuǎn)基因煙草植物的種子中，在種子特異的啟動子協(xié)助下外源蛋白質(zhì)可占總可溶種子蛋白質(zhì)0.67％的穩(wěn)定表達(dá)(Fiedler和Conrad，生物/技術(shù)(Bio/Technology)10(1995)，1090-1094)。因此表達(dá)盒可包含例如種子特異的啟動子(優(yōu)選菜豆蛋白啟動子(US 5504200)、USP啟動子(Baumlein，H.等，分子普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)(1991)225(3)，459-467)、LEB4啟動子(Fiedler和Conrad，1995)、蔗糖結(jié)合蛋白啟動子(Zitat))、LEB4信號肽、欲表達(dá)基因和ER滯留信號。
使用如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約(1989)；T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合實(shí)驗(yàn)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約(1984)以及Ausubel，F(xiàn).M.等，分子生物學(xué)最新方法，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience(1987)中所述的常規(guī)重組和克隆技術(shù)，通過例如將合適的啟動子與合適的上述核酸序列尤其是編碼分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的核酸序列并與聚腺苷酸化信號融合來產(chǎn)生表達(dá)盒，且優(yōu)選地在啟動子和核酸序列之間插入核酸，且該核酸編碼葉綠體特異的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
如上所述用于分支酸變位酶的、確保其靶向質(zhì)體的插入序列是尤其優(yōu)選的。
也可使用其核酸序列編碼融合蛋白的表達(dá)盒，尤其是編碼分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶融合蛋白的表達(dá)盒，融合蛋白的一部分為支配多肽轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。優(yōu)選葉綠體特異的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其在蛋白質(zhì)尤其是分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶已轉(zhuǎn)運(yùn)至葉綠體后被從蛋白質(zhì)部分尤其是分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶和/或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶部分酶切下來。尤其優(yōu)選來自煙草(Nicotiana tabacum)質(zhì)體轉(zhuǎn)酮醇酶的轉(zhuǎn)運(yùn)肽或其它轉(zhuǎn)運(yùn)肽(如核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞單位轉(zhuǎn)運(yùn)肽，或鐵氧還蛋白NADP氧化還原酶轉(zhuǎn)運(yùn)肽和異戊二烯焦磷酸酯異構(gòu)酶-2轉(zhuǎn)運(yùn)肽)或它們的功能等同物。
質(zhì)體分支酸變位酶的轉(zhuǎn)運(yùn)肽或其編碼核酸尤其優(yōu)選地應(yīng)用于上述胞質(zhì)分支酸變位酶或編碼胞質(zhì)分支酸變位酶的核酸。
本發(fā)明另一尤其優(yōu)選使用的核酸為在三個(gè)閱讀框中的煙草質(zhì)體轉(zhuǎn)酮醇酶的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的三個(gè)盒的DNA序列，它們?yōu)樵贜coI切割位點(diǎn)處具有ATG密碼子的KpnI/BamHI片段pTP09KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGATCC_BamHIpTP10KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTGGATCC_BamHIpTP11KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGGATCC_BamHI質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的另一實(shí)例為擬南芥菜質(zhì)體異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶-2(IPP-2)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
本發(fā)明的核酸，尤其是編碼分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的核酸，可合成獲得或天然獲得，或可包含合成核酸和天然核酸的組成或可由多種生物體的多個(gè)異源基因片段組成。
如上所述優(yōu)選的為合成的核苷酸序列，其中的密碼子是為植物所優(yōu)選的。為植物所優(yōu)選的密碼子可從在大多數(shù)感興趣的植物種類中具最高蛋白質(zhì)頻率的密碼子來確定。
當(dāng)制備表達(dá)盒時(shí)，可按順序操作多個(gè)DNA片段，以獲得便于以正確的方向讀出并具有正確閱讀框的核苷酸序列。為進(jìn)行DNA片段相互間的連接，可將銜接子或接頭加至片段上。
可方便地將包含一個(gè)或多個(gè)限制性位點(diǎn)的接頭或多接頭以轉(zhuǎn)錄方向提供給啟動子和終止子區(qū)域，用于該序列插入。通常，接頭具1至10個(gè)，在大多數(shù)情況下為1至8個(gè)，優(yōu)選地具2至6個(gè)限制性位點(diǎn)。通常在調(diào)節(jié)區(qū)域的接頭大小為小于100bp，通常小于60bp，但至少為5bp。啟動子可為宿主植物自身的或同源的啟動子，或?yàn)橥庠吹幕虍愒磫幼?。按轉(zhuǎn)錄的5’-3’方向，表達(dá)盒優(yōu)選地包含啟動子、編碼核酸序列或核酸構(gòu)建體，以及轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。不同的終止區(qū)域可如所希望的那樣相互交換。
而且，可進(jìn)行提供合適限制性切割位點(diǎn)或去除過量DNA或限制性切割位點(diǎn)的操作。體外誘變、引物修補(bǔ)、限制或連接可用于插入、刪除或替換，并適用于如堿基轉(zhuǎn)換或顛換。
可提供片段的互補(bǔ)末端用于連接，可進(jìn)行適當(dāng)?shù)牟僮魅缦拗啤⑼馇谢蛱钇酵怀龆诵纬善侥┒恕?br>
優(yōu)選的聚腺苷酸化信號為植物聚腺苷酸化信號，優(yōu)選那些基本上對應(yīng)于根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA的聚腺苷酸化信號，尤其是Ti質(zhì)粒pTiACH5的T-DNA基因3(章魚堿合酶)的聚腺苷酸化信號(Gielen等，EMBO J.3(1984)，835往后)或其功能等同物。
本發(fā)明還涉及上述核酸尤其是編碼分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的核酸，或上述核酸構(gòu)建體，或蛋白質(zhì)的用途，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
優(yōu)選地，這些轉(zhuǎn)基因植物中精細(xì)化學(xué)品尤其是泛醌、維生素E和/或維生素K，優(yōu)選地維生素E的含量較野生型相比提高了。
已知具高維生素E含量的植物對非生物應(yīng)力的抗性增加。非生物應(yīng)力理解為如低溫、霜、干旱、高溫和鹽。
本發(fā)明因此還涉及上述核酸的用途，用于產(chǎn)生對非生物應(yīng)力的抗性高于野生型的轉(zhuǎn)基因植物。
上述蛋白質(zhì)和核酸可用于在轉(zhuǎn)基因生物體中產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品，優(yōu)選地在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生維生素E、維生素K和/或泛醌，尤其是用來產(chǎn)生維生素E。
將外源基因轉(zhuǎn)移入生物體的基因組尤其是植物的基因組稱為轉(zhuǎn)化。在植物中，尤其是由植物組織或植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化和再生植物的公知方法可用于瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
用于轉(zhuǎn)化植物的合適方法為通過聚乙二醇誘導(dǎo)DNA攝入的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、使用基因槍的生物彈射擊法-所謂的粒子轟擊法、電穿孔法、在含DNA的溶液中培育干燥胚、顯微注射法和上述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。上述方法例如在S.D.Kung和R.Wu編輯，Academic Press(1993)出版的轉(zhuǎn)基因植物(Transgenic Plants)一書的第1卷，設(shè)計(jì)和應(yīng)用(Engineering andUtilization)中的B.Jenes等，基因轉(zhuǎn)移技術(shù)(Techniques for GeneTransfer)，128-143，以及在Potrykus，植物生理學(xué)和植物分子生物學(xué)年鑒(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.)42(1991)，205-225中進(jìn)行了描述。
優(yōu)選地將欲表達(dá)的構(gòu)建體克隆入適用于轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌的載體，如pBin19(Bevan等，核酸研究12(1984)，8711)。
因此，本發(fā)明還涉及包含上述核酸、核酸構(gòu)建體或表達(dá)盒的載體。
用表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌可使用已知的方式轉(zhuǎn)化植物，如將劃破的葉或葉部分置于農(nóng)桿菌溶液，并接下來在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)它們。
表達(dá)盒不僅可用于轉(zhuǎn)化植物，也可用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌尤其是藍(lán)細(xì)菌、蘚類植物、酵母、絲狀真菌和藻類。
至于遺傳改變的植物(以下也稱為轉(zhuǎn)基因植物)的優(yōu)選產(chǎn)生方法，優(yōu)選地將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)尤其是分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的融合表達(dá)盒克隆入如適于轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌的pBin19載體。
用此載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌接下來可使用已知的方式轉(zhuǎn)化植物，尤其是轉(zhuǎn)化培育植物，如將劃破的葉或葉部分置于農(nóng)桿菌溶液，并接下來在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)它們。
用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的方法是已知的，如F.F.White“在高等植物中用作基因轉(zhuǎn)移的載體(Vectors for Gene Transfer in Higher Plants)”一文中所述的方法(參見S.D.Kung和R.Wu編輯，Academic Press(1993)出版的轉(zhuǎn)基因植物一書的第1卷，設(shè)計(jì)和應(yīng)用，15-38頁)?？捎霉绞綇膭澠频娜~或葉部分的轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生包含了整合入表達(dá)盒的用于表達(dá)本發(fā)明基因尤其是編碼分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的核酸的轉(zhuǎn)基因植物。
為了用編碼分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的核酸轉(zhuǎn)化宿主植物，將表達(dá)盒作為插入部分摻入重組載體，其中重組載體的載體DNA包含其它功能調(diào)節(jié)信號如包含用于復(fù)制或整合的序列。合適的載體尤其在“植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)中的方法(Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology)”(CRC Press)，第6/7章，71-119頁(1993)中進(jìn)行了描述。
例如可將植物表達(dá)盒摻入具35S啟動子的轉(zhuǎn)化載體pBin-19的衍生物中(Bevan，M.，核酸研究，128711-8721(1984))。圖2示出了具種子特異性豆球蛋白B4啟動子的轉(zhuǎn)化載體pBin-19的衍生物。
使用上述引用的重組和克隆技術(shù)，可將表達(dá)盒克隆入使得它們復(fù)制的合適載體中，例如在大腸桿菌中合適克隆載體的實(shí)例為pBR332、pUC系列、M13mp系列和pACYC184。在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中均可復(fù)制的雙元載體尤其適用。
本發(fā)明因此涉及上述核酸的用途，尤其是涉及編碼分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的核酸的用途，涉及上述核酸構(gòu)建體的用途，尤其涉及用于產(chǎn)生遺傳改變植物的表達(dá)盒或用于轉(zhuǎn)化植物、植物細(xì)胞、植物組織或植物部分的表達(dá)盒的用途。優(yōu)選的使用目的是增加植物或植物部分的精細(xì)化學(xué)品含量，尤其是維生素E、維生素K或泛醌的含量，優(yōu)選地增加維生素E的含量。
根據(jù)對啟動子的選擇，表達(dá)可特異地發(fā)生在植物的葉、種子、花瓣或其它部分中。
因此，本發(fā)明還涉及通過將上述核酸或上述核酸構(gòu)建體導(dǎo)入起始生物體基因組用來產(chǎn)生遺傳改變的生物體的方法。
本發(fā)明優(yōu)選地涉及轉(zhuǎn)化植物的方法，其包括將含有編碼分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的核酸序列的表達(dá)盒導(dǎo)入植物細(xì)胞或植物原生質(zhì)體，并再生它們以產(chǎn)生完整的植物。
本發(fā)明還涉及遺傳改變的生物體，涉及改變野生型莽草酸路徑的代謝物流量的遺傳改變并涉及野生型的精細(xì)化學(xué)品含量改變的生物體的精細(xì)化學(xué)品含量。
如上所述，優(yōu)選的遺傳改變生物體的精細(xì)化學(xué)品尤其是維生素E、維生素K和泛醌，優(yōu)選地維生素E的含量較野生型的含量升高。
遺傳改變的生物體根據(jù)本本發(fā)明理解為尤其是其中進(jìn)行了遺傳改變的生物體，當(dāng)起始生物體包含所討論的核酸時(shí)，該遺傳改變使得相對于野生型而言，編碼分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的核酸的基因表達(dá)提高，或當(dāng)起始生物體不包含所討論的核酸時(shí)，該遺傳改變使得相對于野生型而言，引起了野生型進(jìn)行編碼分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的核酸的基因表達(dá)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如上所述將光合活性生物體如藍(lán)細(xì)菌、蘚類植物、藻類或植物，尤其優(yōu)選地植物用作起始生物體，并因此也作為遺傳改變的生物體，作為用于產(chǎn)生其精細(xì)化學(xué)品含量較野生型升高的生物體。
此類轉(zhuǎn)基因植物、它們的增殖物質(zhì)以及它們的植物細(xì)胞、植物組織或植物部分是本發(fā)明的進(jìn)一步的對象。
用于本發(fā)明目的的植物尤其為單子葉植物和雙子葉植物。
優(yōu)選的植物為萬壽菊、向日葵、擬南芥屬(Arabidopsis)、煙草、紅胡椒、大豆、番茄、茄子、紅胡椒(bell pepper)、胡蘿卜、馬鈴薯、玉米、saladings和甘藍(lán)、谷物、苜蓿、燕麥、大麥、裸麥、小麥、黑小麥、高梁和小米、稻子、苜蓿、亞麻、棉花、大麻、十字花科如油料種子油菜或蕓苔、sugarbeet、甘蔗、堅(jiān)果和葡萄藤類或木材類如白楊或紫杉。
尤其優(yōu)選的植物為擬南芥菜、萬壽菊(Tagetes erecta)、歐洲油菜(Brassica napus)、煙草、蕓苔、馬鈴薯和其它油料作物如大豆。
遺傳改變的生物體，尤其是植物可如上所述用于產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品，尤其是用于產(chǎn)生維生素E、維生素K和泛醌。
根據(jù)本發(fā)明的遺傳改變植物可如直接或在以公知的方式加工后用作食品或飼料，該遺傳改變的植物可為人或動物消費(fèi)，且其具有增高的精細(xì)化學(xué)品含量，尤其是增高的維生素E、泛醌和/或維生素K，優(yōu)選地維生素E含量。
增高的精細(xì)化學(xué)品含量是指為了本發(fā)明目的，這些化合物在植物中的生物合成與未被遺傳改變的植物中至少一代植物相比，前者具有人工獲得的提高的生物合成的能力。
增高的維生素E含量通常是指總生育酚含量的增高。但增高的維生素E含量也理解為尤其是指上述8種具生育酚活性的化合物的含量改變。
例如，將分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶基因?qū)胫参锪钊顺泽@地導(dǎo)致生育三烯酸含量的明確增高。
當(dāng)維生素E含量增高時(shí)，生育酚含量或生育三烯酸含量均可增高。優(yōu)選地升高生育酚含量。但在某些情況下，也優(yōu)選地升高生育三烯酸含量。
例如，維生素E的生物合成位點(diǎn)在植物中尤其為葉組織，因此本發(fā)明核酸尤其是編碼分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的核酸的葉特異性表達(dá)是有意義的。但這不構(gòu)成限制，因?yàn)楸磉_(dá)也可以組織特異性方式在植物的所有其它部分尤其是含脂肪的種子中進(jìn)行。
一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案因此涉及本發(fā)明核酸尤其是編碼分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的核酸的種子特異性表達(dá)。
此外，外源的分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶基因的組成型表達(dá)是有利的。另一方面，也希望進(jìn)行誘導(dǎo)型表達(dá)。
可例如在體外通過枝條分生組織增殖測定重組表達(dá)的分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶基因的表達(dá)效率。另外，可在溫室實(shí)驗(yàn)中對被測試植物測試分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶基因性質(zhì)和表達(dá)水平的改變以及它們對維生素E生物合成的影響。
本發(fā)明現(xiàn)在通過下面的實(shí)施例闡述，但不限于這些實(shí)施例一般實(shí)驗(yàn)條件重組DNA的序列分析用Licor激光熒光DNA測序儀(可從MWG Biotech，Ebersbach得到)，使用Sanger法對重組DNA分子進(jìn)行測序(Sanger等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)74(1977)，5463-5467)。
實(shí)施例1-編碼大腸桿菌K12分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的tyrA基因的克隆從大腸桿菌K12用正義特異性引物(tyrA5’SEQ ID No.10)和反義特異性引物(tyrA3’SEQ ID No.9)通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增編碼tyrA基因的DNA。
PCR條件如下在50μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行PCR，其中所述反應(yīng)混合物中包含- 2μl大腸桿菌K12細(xì)胞懸液- 0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP
-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol tyrA5’-40pmol tyrA3’-15μl 3.3×rTth DNA聚合酶XL緩沖液(PE AppliedBiosystems)-5U rTth DNA聚合酶XL(PE Applied Biosystems)在下列循環(huán)條件下進(jìn)行PCR步驟194℃5分鐘(變性)步驟294℃3秒步驟355℃1分鐘(退火)步驟472℃2分鐘(延伸)步驟2至4重復(fù)30次步驟572℃10分鐘(后延伸)步驟64℃(等候)用標(biāo)準(zhǔn)方法將擴(kuò)增子克隆入PCR克隆載體pGEM-T(Promega)。所產(chǎn)生的擴(kuò)增子通過用M13F(-40)引物進(jìn)行測序鑒定。
實(shí)施例2-產(chǎn)生包含編碼大腸桿菌K12分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的tyrA基因的表達(dá)盒產(chǎn)生在組成型CaMV(花椰菜花葉病毒)35S啟動子(Franck等，細(xì)胞(Cell)21285-294，1980)控制下表達(dá)大腸桿菌K12分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥菜植物。所產(chǎn)生的用于組成型表達(dá)大腸桿菌K12分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的質(zhì)?；A(chǔ)為pBinAR-TkTp-10(RalfBadur，博士論文，University of Gttingen，1998)。該載體為pBinAR的衍生物(Hfgen和Willmitzer，植物科學(xué)(Plant Sci.)66221-230，1990)，其包含CaMV(花椰菜花葉病毒)35S啟動子(Franck等，1980)、章魚堿合酶基因的終止信號(Gielen等，EMBO J.3835-846，1984)和編碼煙草質(zhì)體轉(zhuǎn)酮醇酶的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列。將大腸桿菌K12分支酸變位酶預(yù)苯酸脫氫酶以正確的閱讀框克隆入該載體，產(chǎn)生分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶與質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的翻譯融合。它可使轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)運(yùn)入質(zhì)體。
為構(gòu)建該質(zhì)粒，用側(cè)翼的SmaI或SalI限制性切割位點(diǎn)將tyrA基因從質(zhì)粒pGEM-T/tyrA分離。用標(biāo)準(zhǔn)方法將該片段連接入SmaI/SalI切割的pBinAR-TkTp-10(見圖2)。該質(zhì)粒(pBinAR-TkTp-10/tyrA)用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥菜(A.thaliana)植物。
在圖2中的片段A(529 bp)包含CaMV 35S啟動子(花椰菜花葉病毒的核苷酸6909至7437)，片段B(245bp)編碼煙草轉(zhuǎn)酮醇酶的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，片段C(1232Bp)編碼大腸桿菌K12 tyrA基因，且片段D(219Bp)編碼章魚堿合酶基因的終止信號。
實(shí)施例3-產(chǎn)生用于表達(dá)位于種子特異的啟動子控制下的大腸桿菌K12分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的核酸構(gòu)建體為了構(gòu)建嵌合的DNA構(gòu)建體，用來產(chǎn)生表達(dá)位于種子特異的啟動子控制下的大腸桿菌K12分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的轉(zhuǎn)基因擬南芥菜、煙草和歐洲油菜植物核酸構(gòu)建體，使用了載體pPTVkanLeP-IPP-TP-9。
該載體為pGPTVkan的衍生物(D.Becker，E.Kemper，J.Schell，R.Masterson.植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)201195-1197，1992)，其uidA基因已刪除。取而代之的是，載體pPTVkanLeP-IPP-TP-9包含豆球蛋白B4基因的種子特異的啟動子(Kafatos等，核酸研究，14(6)2707-2720，1986)、編碼擬南芥菜質(zhì)體特異的異戊二烯焦磷酸酯異構(gòu)酶-2(IPP-2)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列(Badur，未公開發(fā)表)以及根瘤農(nóng)桿菌胭脂堿合酶的終止信號(Depicker等，分子應(yīng)用遺傳學(xué)雜志(J.Mol.Appl.Genet.)1，561-73，1982)。
將編碼大腸桿菌K12 tyrA的核酸片段以用T4聚合酶補(bǔ)平的具鈍末端的SmaI/SalI片段克隆入載體pPTVkanLeP-IPP-TP-9(圖3)，產(chǎn)生具IPP-2轉(zhuǎn)運(yùn)肽的翻譯融合。這樣確保了分支酸變位酶-預(yù)預(yù)苯酸脫氫酶輸入質(zhì)體。該質(zhì)粒(pPTVkanLeP-IPP-TP-9/TyrA)用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因煙草、擬南芥菜和歐洲油菜植物。
在圖3中，片段A(2700bp)包含蠶豆(Vicia faba)豆球蛋白B4基因的啟動子，片段B(206bp)編碼擬南芥菜異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶-2的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，片段C(1234bp)編碼大腸桿菌K12tyrA基因，且片段D(272 bp)編碼胭脂堿合酶基因的終止信號。
實(shí)施例4-產(chǎn)生表達(dá)tyrA基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥菜植物基于改良真空滲入法用根瘤農(nóng)桿菌菌株(GV3101[pMP90])轉(zhuǎn)化野生型擬南芥菜植物(哥倫比亞)(Steve Clough和Andrew Bent.植物浸入用于擬南芥菜的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的簡化方法(Floral dipa simplified methodfor of Agrobacterium mediated transformation of A.thaliana)，植物雜志(Plant J)16(6)735-43，1998；Bechtold，N.Ellis，J.和Pelltier，G.，見通過滲透成熟擬南芥菜植物進(jìn)行植物農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(PlantaAgrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsisthaliana plants)一書中，CRAcad Sci Paris，1993，1144(2)204-212)。所用的根瘤農(nóng)桿菌細(xì)胞事先用質(zhì)粒pBinAR-TkTp-10/tyrA和pPTVkanLeP-IPP-TP-9/tyrA轉(zhuǎn)化(圖2和3)。
原代轉(zhuǎn)化的種子基于它們對抗生素的抗性進(jìn)行選擇。將對抗生素具抗性的幼苗種植入土壤中，并將充分發(fā)育的植物用于生物化學(xué)分析。
實(shí)施例5-產(chǎn)生表達(dá)tyrA基因的轉(zhuǎn)基因歐洲油菜植物大體按照Bade，J.B.和Damm，B.的方法(見植物的基因轉(zhuǎn)移(GeneTransfer to Plants)，Potrykus，I.和Spangenberg，G.編輯，Springer LabManual，Springer Verlag，1995，30-38)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因油料種子油菜植物，其中所述方法也指出了所用培養(yǎng)基和緩沖液的組成。
用根瘤農(nóng)桿菌菌株GV3101[pMP90]進(jìn)行轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒pPTVkanLeP-IPP-TP-9/tyrA用于轉(zhuǎn)化(圖3)。用70％乙醇(v/v)將歐洲油菜var.Westar的種子進(jìn)行表面滅菌，于水中在55℃洗10分鐘，在1％強(qiáng)度的次氯酸鹽溶液(25％v/v Teepol，0.1％v/v吐溫20)中孵育20分鐘，并用無菌水洗6次，每次20分鐘。在濾紙上干燥種子3天，并在含15ml發(fā)芽培養(yǎng)基的玻璃燒瓶中對10-15粒種子發(fā)芽。從一些幼苗(約10cm)去除根和頂端，并將剩下的下胚軸截成約6mm長的部分。這樣獲得的約600個(gè)外植體在50ml基本培養(yǎng)基中洗30分鐘，并轉(zhuǎn)移入300ml燒瓶中。加入100ml愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，于100轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)培養(yǎng)物24小時(shí)。
將農(nóng)桿菌菌株29℃于補(bǔ)充了卡那霉素(20mg/l)的Luria肉湯培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)物，并取2ml，在50ml不含卡那霉素的Luria肉湯培養(yǎng)基中29℃培養(yǎng)4小時(shí)，直至OD600達(dá)到0.4-0.5。以2000轉(zhuǎn)/分沉淀培養(yǎng)物25分鐘后，將細(xì)胞沉淀重懸于25ml基本培養(yǎng)基。通過加入更多的基本培養(yǎng)基，將溶液的細(xì)菌濃度調(diào)節(jié)至OD600為0.3。
用無菌吸頭將愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基從油料種子外植體移除，加入50ml農(nóng)桿菌溶液，小心地混合該反應(yīng)物并孵育20分鐘。去除農(nóng)桿菌懸液，用50ml愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基洗油料種子外植體1分鐘，并接下來加入100ml愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。定軌搖床上以100轉(zhuǎn)/分共培養(yǎng)24小時(shí)。通過移去愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基停止共培養(yǎng)，并在100轉(zhuǎn)/分下，用25ml洗滌培養(yǎng)基洗外植體兩次，每次1分鐘，然后用100ml洗滌培養(yǎng)基洗外植體兩次，共60分鐘。將洗滌培養(yǎng)基和外植體一起轉(zhuǎn)移入15cm培養(yǎng)皿，并用無菌吸頭移去培養(yǎng)基。
至于再生，每次將20至30個(gè)外植體轉(zhuǎn)移入含25ml補(bǔ)充有卡那霉素的枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基的90mm培養(yǎng)皿中。該培養(yǎng)皿用兩層Leukopor密封并在25℃和2000勒下孵育，且光周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗。每隔12天，將發(fā)育的愈傷組織轉(zhuǎn)移至含枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基的新培養(yǎng)皿中。再生完整植物的所有進(jìn)一步的步驟如Bade，J.B和Damm，B.(見植物基因轉(zhuǎn)移，Potrykus，I.和Spangenberg，G.編輯，Springer Lab Manual，Springer Verlag，1995，30-38)所述進(jìn)行。
實(shí)施例6-產(chǎn)生表達(dá)tyrA基因的轉(zhuǎn)基因煙草植物將10ml補(bǔ)充有抗生素的YEB培養(yǎng)基(5g/l牛肉膏，1g/l酵母提取物，5g/l蛋白胨，5g/l蔗糖和2mM MgSO4)與根瘤農(nóng)桿菌菌落培養(yǎng)，并于28℃過夜培養(yǎng)。用臺式離心機(jī)于4℃3500轉(zhuǎn)/分沉淀細(xì)胞20分鐘，然后在無菌條件下重懸于無抗生素的新鮮YEB培養(yǎng)基中。細(xì)胞懸液用于轉(zhuǎn)化。
通過植物繁殖獲得無菌培養(yǎng)的野生型植物。為此目的，只截去植物的頂端，并轉(zhuǎn)移至在無菌保存廣口瓶中的新鮮的2MS培養(yǎng)基中。至于植物的其它部分，去除葉子的上表面毛和葉子的中央脈。使用剃刀片將葉分成約1cm2大小部分。將農(nóng)桿菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移入小的培養(yǎng)皿(直徑2cm)。葉部分簡短地抽撥自該溶液，并將葉的底面以接觸培養(yǎng)基的方式置于培養(yǎng)皿(直徑9cm)中的2MS培養(yǎng)基上。在暗處于25℃放置2天后，將外植體轉(zhuǎn)移至具愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的平板中并在環(huán)境受控的箱子中于28℃保溫。每7-10天更換培養(yǎng)基。一旦形成愈傷組織，就將外植體轉(zhuǎn)移入無菌保存廣口瓶中的補(bǔ)充有凱福隆(claforan)的枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基(0.6％BiTec瓊脂(w/v)，2.0mg/l玉米素核糖，0.02mg/l萘基乙酸，0.02mg/l赤霉酸，0.25g/ml凱福隆，1.6％葡萄糖(w/v)和50mg/l卡那霉素)上。約一個(gè)月后器官發(fā)生開始，并可截?cái)嘁研纬傻闹l。將枝條在補(bǔ)充有凱福隆和選擇標(biāo)記的2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。一旦發(fā)育出相當(dāng)多的根球，則可將植物裝盆于種子堆肥中。
實(shí)施例7-實(shí)施例4、5和6的轉(zhuǎn)基因植物的鑒定分析用上述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物(擬南芥菜、歐洲油菜和煙草)的葉和種子中生育酚和生育三烯酸的含量。為此目的，在溫室中培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物，并將表達(dá)大腸桿菌K12分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶基因的植物在Northern和Western水平上分析。用HPLC測定這些植物的葉和種子中生育酚的含量和生育三烯酸的含量。在所有情況下，將額外表達(dá)tyrA基因的轉(zhuǎn)基因植物與未轉(zhuǎn)化的植物相比，生育酚和/或生育三烯酸的含量上升。
表1A(幼葉)和1B(老葉)示出了在SNN野生型和過表達(dá)大腸桿菌Tyr A基因的植物中不同年齡的煙草葉中α-生育酚、γ-生育酚、α-生育三烯酸和總維生素E的含量[μg/g FW](數(shù)據(jù)顯示為MW+/-SD，n＝9)。表A幼葉
表B老葉
實(shí)施例8-克隆編碼在質(zhì)體中表達(dá)的擬南芥菜分支酸變位酶-1的基因的亞片段使用正義特異性引物(CM-1TP 5’SEQ ID No.11)和反義特異性引物(CM-1TP 3’SEQ ID No.12)從擬南芥菜通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增編碼分支酸變位酶-1的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列。
PCR條件如下在50μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行PCR，其中所述反應(yīng)混合物中包含-2μl擬南芥菜cDNA-0.2 mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP
- 1.5mM Mg(OAc)2- 5μg牛血清白蛋白- 40pmol CM-1TP 5’引物- 40pmol CM-1TP 3’引物- 15μl 3.3×rTth DNA聚合酶XL緩沖液(PE AppliedBiosystems)- 5U rTth DNA聚合酶XL(PE Applied Biosystems)在下列循環(huán)條件下進(jìn)行PCR步驟194℃5分鐘(變性)步驟294℃3秒步驟355℃1分鐘(退火)步驟472℃2分鐘(延伸)步驟2至4重復(fù)30次步驟572℃10分鐘(后延伸)步驟64℃(等候)用標(biāo)準(zhǔn)方法將擴(kuò)增子克隆入PCR克隆載體pCR-script(stratagene)。所產(chǎn)生的擴(kuò)增子通過用載體特異性引物進(jìn)行測序鑒定。
實(shí)施例9-克隆編碼在胞質(zhì)中表達(dá)的擬南芥菜分支酸變位酶-2的基因使用正義特異性引物(CM-2 5’SEQ ID No.13)和反義特異性引物(CM-2 3’SEQ ID No.14)從擬南芥菜通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增編碼分支酸變位酶-2的DNA。
PCR條件如下在50μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行PCR，其中所述反應(yīng)混合物中包含-2μl擬南芥菜cDNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol CM-2 5’引物
- 40pmol CM-2 3’引物- 15μl 3.3×rTth DNA聚合酶XL緩沖液(PE AppliedBiosystems)- 5U rTth DNA聚合酶XL(PE Applied Biosystems)在下列循環(huán)條件下進(jìn)行PCR步驟194℃5分鐘(變性)步驟294℃3秒步驟355℃1分鐘(退火)步驟472℃2分鐘(延伸)步驟2至4重復(fù)30次步驟572℃10分鐘(后延伸)步驟64℃(等候)用標(biāo)準(zhǔn)方法將擴(kuò)增子克隆入PCR克隆載體pGEM-T(Promega)。所產(chǎn)生的擴(kuò)增子通過用M13F(-40)引物進(jìn)行測序鑒定。
實(shí)施例10-產(chǎn)生由編碼分支酸變位酶-1(CM-1)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(TP)的DNA序列和編碼分支酸變位酶-2(CM-2)的DNA序列組成的嵌合構(gòu)建體CM-1-TP-CM-2為了產(chǎn)生嵌合基因CM-1-TP-CM-2，將質(zhì)粒pCR-Script/CM-1-TP用限制性酶NcoI/SalI消化。
將用限制性酶NcoI/SalI從質(zhì)粒pGEM-Teasy/CM-2分離的CM-2 DNA片段連接入該質(zhì)粒。該嵌合DNA構(gòu)建體(SEQ ID No.5)(pCR-Script/AtCM-1TP-AtCM-2，圖4)的翻譯導(dǎo)致融合蛋白質(zhì)的形成，其中所述融合蛋白質(zhì)中CM-1的轉(zhuǎn)運(yùn)肽與CM-2(SEQ ID No.6)融合。
實(shí)施例11-產(chǎn)生包含嵌合基因CM-1-TP-CM-2的植物表達(dá)盒產(chǎn)生了這樣的轉(zhuǎn)基因植物，其首先在組成型CaMV(花椰菜花葉病毒)35S啟動子(Franck等，細(xì)胞，21285-294，1980)控制下且接下來在Viciafaba豆球蛋白基因的種子特異性啟動子(Kafatos等，核酸研究，14(6)2707-2720，1986)控制下表達(dá)來自擬南芥菜的嵌合基因CM-1-TP-CM2。
產(chǎn)生用于嵌合基因CM-1TP-CM-2的組成型表達(dá)的質(zhì)?；A(chǔ)為載體pBinAR(Hfgen和Willmitzer，植物科學(xué)(Plant Sci.)66221-230，1990)。該載體包含CaMV(花椰菜花葉病毒)35S啟動子(Franck等，1980)和章魚堿合酶基因的終止信號(Gielen等，EMBO J.3835-846，1984)。為了產(chǎn)生該質(zhì)粒，用側(cè)翼限制性酶切位點(diǎn)KpnI/SalI將嵌合基因CM-1-TP-CM2從質(zhì)粒pCR-script/AtCM-1TP-AtCM-2分離出來(圖4)。使用標(biāo)準(zhǔn)方法將該片段連接AKpnI/SalI-切割的pBinAR。所得的質(zhì)粒(pBinAR/CM-1TP/CM-2，圖5)用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因擬南芥菜和煙草。
為了在植物中產(chǎn)生可使嵌合基因CM-1TP/CM-2進(jìn)行種子特異性表達(dá)的質(zhì)粒，使用了豆球蛋白B4基因的種子特異性啟動子(Kafatos等，核酸研究，14(6)2707-2720，1986)。從質(zhì)粒pGEMTeasy/lePNOS上通過在啟動子5’側(cè)翼的EcoRI切割位點(diǎn)和在啟動子3’側(cè)翼的KpnI切割位點(diǎn)，分離該豆球蛋白B4基因啟動子的2.7kb片段。質(zhì)粒pBinAR/CM-1TP/CM-2也用限制性酶EcoRI和KpnI處理。結(jié)果，CaMV 35S啟動子被從該質(zhì)粒切除(見圖5)。接下來將作為EcoRI/KpnI片段的豆球蛋白基因啟動子克隆入該載體，得到在該種子特異的啟動子控制下表達(dá)嵌合基因CM-1TP-CM-2的質(zhì)粒(見圖6)。該質(zhì)粒(pBinLeP/CM-1TP/CM-2)用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因擬南芥菜和煙草植物。
實(shí)施例12-產(chǎn)生表達(dá)嵌合基因CM-1-TP-CM-2的轉(zhuǎn)基因擬南芥菜植物類似于實(shí)施例4，用質(zhì)粒(pBinAR/AtCM-1TP/CM-2)和(pBinLeP/CM-1TP/CM-2)產(chǎn)生該植物。
實(shí)施例13-產(chǎn)生表達(dá)tyrA基因的轉(zhuǎn)基因歐洲油菜植物類似于實(shí)施例5，用質(zhì)粒(pBinAR/AtCM-1TP/CM-2)和(pBinLeP/CM-1TP/CM-2)產(chǎn)生該植物。
實(shí)施例14-產(chǎn)生表達(dá)tyrA基因的轉(zhuǎn)基因煙草植物類似于實(shí)施例6，用質(zhì)粒(pBinAR/AtCM-1TP/CM-2)和(pBinARleP/CM-1TP/CM-2)產(chǎn)生該植物。
實(shí)施例15-實(shí)施例12、13和14的轉(zhuǎn)基因植物的鑒定分析用上述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物(擬南芥菜，歐洲油菜和煙草)的葉和種子中生育酚和生育三烯酸的含量。為此目的，在溫室中培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物，并將表達(dá)編碼胞質(zhì)分支酸變位酶基因的植物在Northern和Western水平上分析。用HPLC測定這些植物的葉和種子中生育酚的含量和生育三烯酸的含量。在所有情況下，額外表達(dá)分支酸變位酶基因的轉(zhuǎn)基因植物與未轉(zhuǎn)化的植物相比，生育酚和/或生育三烯酸的含量上升。序列表<110>太陽基因兩合公司(SunGene GmbH & Co.KgaA)<120>通過遺傳改變莽草酸路徑來改變生物體中精細(xì)化學(xué)品含量<130>0817/780/2000<140><141><160>14<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>1238<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<220><221>CDS<222>(25)..(1143)<400>1cccgggtggc ttaagaggtt tatt atg gtt gct gaa ttg acc gca tta cgc51Met Val Ala Glu Leu Thr Ala Leu Arg1 5gat caa att gat gaa gtc gat aaa gcg ctg ctg aat tta tta gcg aag 99Asp Gln Ile Asp Glu Val Asp Lys Ala Leu Leu Asn Leu Leu Ala Lys10 15 20 25cgt ctg gaa ctg gtt gct gaa gtg ggc gag gtg aaa agc cgc ttt gga 147Arg Leu Glu Leu Val Ala Glu Val Gly Glu Val Lys Ser Arg Phe Gly30 35 40ctg cct att tat gtt ccg gag cgc gag gca tct atg ttg gcc tcg cgt 195Leu Pro Ile Tyr Val Pro Glu Arg Glu Ala Ser Met Leu Ala Ser Arg45 50 55cgt gca gag gcg gaa gct ctg ggt gta ccg cca gat ctg att gag gat 243Arg Ala Glu Ala Glu Ala Leu Gly Val Pro Pro Asp Leu Ile Glu Asp60 65 70gtt ttg cgt cgg gtg atg cgt gaa tct tac tcc agt gaa aac gac aaa291Val Leu Arg Arg Val Met Arg Glu Ser Tyr Ser Ser Glu Asn Asp Lys75 80 85gga ttt aaa aca ctt tgt ccg tca ctg cgt ccg gtg gtt atc gtc ggc339Gly Phe Lys Thr Leu Cys Pro Ser Leu Arg Pro Val Val Ile Val Gly90 95 100 105ggt ggc ggt cag atg gga cgc ctg ttc gag aag atg ctg acc ctc tcg387Gly Gly Gly Gln Met Gly Arg Leu Phe Glu Lys Met Leu Thr Leu Ser110 115 120ggt tat cag gtg cgg att ctg gag caa cat gac tgg gat cga gcg gct435Gly Tyr Gln Val Arg Ile Leu Glu Gln His Asp Trp Asp Arg Ala Ala125 130 135gat att gtt gcc gat gcc gga atg gtg att gtt agt gtg cca atc cac483Asp Ile Val Ala Asp Ala Gly Met Val Ile Val Ser Val Pro Ile His140 145 150gtt act gag caa gtt att ggc aaa tta ccg cct tta ccg aaa gat tgt531Val Thr Glu Gln Val Ile Gly Lys Leu Pro Pro Leu Pro Lys Asp Cys155 160 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A1a Leu Arg Asp Gln Ile Asp Glu Val Asp1 5 10 15Lys Ala Leu Leu Asn Leu Leu Ala Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Glu20 25 30Val Gly Glu Val Lys Ser Arg Phe Gly Leu Pro Ile Tyr Val Pro Glu35 40 45Arg Glu Ala Ser Met Leu Ala Ser Arg Arg Ala Glu Ala Glu Ala Leu50 55 60Gly Val Pro Pro Asp Leu Ile Glu Asp Val Leu Arg Arg Val Met Arg65 70 75 80Glu Ser Tyr Ser Ser Glu Asn Asp Lys Gly Phe Lys Thr Leu Cys Pro85 90 95Ser Leu Arg Pro Val Val Ile Val Gly Gly Gly Gly Gln Met Gly Arg100 105 110Leu Phe Glu Lys Met Leu Thr Leu Ser Gly Tyr Gln Val Arg Ile Leu115 120 125Glu Gln His Asp Trp Asp Arg Ala Ala Asp Ile Val Ala Asp Ala Gly130 135 140Met Val Ile Val Ser Val Pro Ile His Val Thr Glu Gln Val Ile Gly145 150 155 160Lys Leu Pro Pro Leu Pro Lys Asp Cys Ile Leu Val Asp Leu Ala Ser165 170 175Val Lys Asn Gly Pro Leu Gln Ala Met Leu Val Ala His Asp Gly Pro180 185 190Val Leu Gly Leu His Pro Met Phe Gly Pro Asp Ser Gly Ser Leu Ala195 200 205Lys Gln Val Val Val Trp Cys Asp Gly Arg Lys Pro Glu Ala Tyr Gln210 215 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1 5 10 15gta ctg agt ctt gac tta atc aga gaa tcg ttg att agg caa gaa gac156Val Leu Ser Leu Asp Leu Ile Arg Glu Ser Leu Ile Arg Gln Glu Asp20 25 30acc atc gtc ttc agc ttg atc gag aga gct aag ttt cca ctc aat tct204Thr Ile Val Phe Ser Leu Ile Glu Arg Ala Lys Phe Pro Leu Asn Ser35 40 45cct gct ttc gag gaa tct cgt tgt cta gat tct gga agt ttc tct tct252Pro Ala Phe Glu Glu Ser Arg Cys Leu Asp Ser Gly Ser Phe Ser Ser50 55 60ctc act gag ttt ttc gtc aga gag aca gaa atc atc caa gct aag gta300Leu Thr Glu Phe Phe Val Arg Glu Thr Glu Ile Ile Gln Ala Lys Val65 70 75gga aga tat gaa tac ccg gaa gag aat cct ttc ttc ctt gag aac att348Gly Arg Tyr Glu Tyr Pro Glu Glu Asn Pro Phe Phe Leu Glu Asn Ile80 85 90 95cct cac tcg gtt ttt cct acg cac aaa tat cca tcg gct ttg cac cct396Pro His Ser Val Phe Pro Thr His Lys Tyr Pro Ser Ala Leu His Pro100 105 110aag gct cta tct gtt aac att aac aaa caa atc tgg gat att tac ttt444Lys Ala Leu Ser Val Asn Ile Asn Lys Gln Ile Trp Asp Ile Tyr Phe115 120 125aaa gaa ttg ctt cct ttg ttt gtc aaa cct ggc gat gat ggc aac tat492Lys Glu Leu Leu Pro Leu Phe Val Lys Pro Gly Asp Asp Gly Asn Tyr130 135 140cca tca act gct gct agt gat ctc gcc tgt tta caa gct ctt tcg aga540Pro Ser Thr Ala Ala Ser Asp Leu Ala Cys Leu Gln Ala Leu Ser Arg145 150 155agg att cac tac ggt aaa ttt gta gct gag gtc aaa ttc aga gat gct588Arg Ile His Tyr Gly Lys Phe Val Ala Glu Val Lys Phe Arg Asp Ala160 165 170 175cca caa gat tac gag cct gcg att cgc gct cag gat aga gag gct ttg636Pro Gln Asp Tyr Glu Pro Ala Ile Arg Ala Gln Asp Arg Glu Ala Leu
180 185 190atg aag ctg ttg acg ttt gag aaa gta gaa gaa atg gtt aag aag aga 684Met Lys Leu Leu Thr Phe Glu Lys Val Glu Glu Met Val Lys Lys Arg195 200 205gtg cag aag aaa gca gaa acg ttt gga caa gaa gta aaa ttc aac tct 732Val Gln Lys Lys Ala Glu Thr Phe Gly Gln Glu Val Lys Phe Asn Ser210 215 220ggc tat ggc gat gag agt aag aag aag tat aaa gtg gat cca ttg ctt 780Gly Tyr Gly Asp Glu Ser Lys Lys Lys Tyr Lys Val Asp Pro Leu Leu225 230 235gcc tct cgc atc tac ggg gaa tgg ctt atc cct ctc act aag ctc gtt 828Ala Ser Arg Ile Tyr Gly Glu Trp Leu Ile Pro Leu Thr Lys Leu Val240 245 250 255gag gtt gag tat ctt cta cgt cgt ctc gat tgaatattat ttgtatccaa 878Glu Val Glu Tyr Leu Leu Arg Arg Leu Asp260 265atctggccct gttaaagtgg gccttaagtt tttaagtggg cctgttgata tttgtcagga 938tatgatagaa taattgaatg aagcaacaca gtcatcacta ttttaaattt tgtaagatat 998tttaagga 1006<210>4<211>265<212>PRT<213>擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)<400>4Met Ala Arg Val Phe Glu Ser Asp Ser Gly Ser Gly Cys Ser Asn Val1 5 10 15Leu Ser Leu Asp Leu Ile Arg 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1.通過培養(yǎng)生物體產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的方法，其中生物體的莽草酸路徑在野生型基礎(chǔ)上被遺傳改變。
2.如權(quán)利要求1中所述的方法，其中用至少一種選自方法A和B的方法進(jìn)行莽草酸路徑的遺傳改變，A和B具有下列含義A提高野生型莽草酸路徑的至少一種酶的活性；B將至少一種基因?qū)肷矬w，其中對該基因而言，在野生型中不存在其直向同源基因且其橋接野生型的莽草酸路徑的代謝路徑。
3.如權(quán)利要求2中所述的方法，其中在方法A中，莽草酸路徑的至少一種酶的活性通過過表達(dá)編碼具該酶活性的蛋白質(zhì)的核酸而增加。
4.如權(quán)利要求3中所述的方法，其中將編碼分支酸變位酶的核酸導(dǎo)入生物體。
5.如權(quán)利要求4中所述的方法，其中將編碼這樣的分支酸變位酶的核酸導(dǎo)入生物體，在生物體中該分支酸變位酶的活性受到減輕的翻譯后調(diào)節(jié)。
6.如權(quán)利要求5中所述的方法，其中將編碼這樣的分支酸變位酶的核酸導(dǎo)入生物體，在生物體中表達(dá)位點(diǎn)處該分支酸變位酶受到減輕的翻譯后調(diào)節(jié)。
7.如權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所用的生物體為植物。
8.如權(quán)利要求7中所述的方法，其中將胞質(zhì)分支酸變位酶導(dǎo)入植物的質(zhì)體。
9.如權(quán)利要求8中所述的方法，其中將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物，其中所述核酸構(gòu)建體包含編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸和包含編碼以下蛋白質(zhì)的核酸，該蛋白質(zhì)包含氨基酸序列SEQ ID No.4，或包含通過氨基酸的替換、插入或刪除衍生于該序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ IDNo.4具有至少30％的同源性，且其具有分支酸變位酶的酶特性。
10.如權(quán)利要求9中所述的方法，其中將編碼質(zhì)體分支酸變位酶的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸用作編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸。
11.如權(quán)利要求10中所述的方法，其中將核酸序列SEQ ID No.5的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物。
12.包含編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸和包含編碼以下蛋白質(zhì)的核酸的核酸構(gòu)建體，該蛋白質(zhì)包含氨基酸序列SEQ ID No.4，或包含通過氨基酸的替換、插入或刪除衍生于該序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ ID No.4具有至少30％的同源性，且其具有分支酸變位酶的酶特性。
13.如權(quán)利要求12中所述的核酸構(gòu)建體，其中將編碼質(zhì)體分支酸變位酶的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸用作編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸。
14.如權(quán)利要求13中所述的核酸構(gòu)建體，其包含核酸序列SEQ IDNo.5。
15.如權(quán)利要求2至11中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所用的生物體為植物，且其中當(dāng)進(jìn)行方法B時(shí)，將編碼預(yù)苯酸脫氫酶的核酸作為這樣的基因?qū)胫参?，該基因在野生型中不存在其直向同源基因?br>
16.如權(quán)利要求1至11和權(quán)利要求15中任意一項(xiàng)所述的方法，其中將編碼預(yù)苯酸脫氫酶的核酸與編碼分支酸變位酶的核酸聯(lián)合導(dǎo)入植物。
17.如權(quán)利要求16中所述的方法，其中將編碼分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的核酸導(dǎo)入植物。
18.如權(quán)利要求17中所述的方法，其中導(dǎo)入這樣的核酸，其編碼的蛋白質(zhì)包含氨基酸序列SEQ ID No.2，或包含通過氨基酸的替換、插入或刪除衍生于該序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ ID No.2具有至少30％的同源性，且其具有分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的酶特性。
19.如權(quán)利要求18中所述的方法，其中使用細(xì)菌來源的核酸。
20.如權(quán)利要求18或19中所述的方法，其中所用核酸包含SEQ ID No.1所示的序列。
21.核酸構(gòu)建體，其包含將如權(quán)利要求3至6、8以及15至17中任意一項(xiàng)所述的核酸功能性連接至確保在植物中轉(zhuǎn)錄和翻譯的一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)信號。
22.如權(quán)利要求21中所述的核酸構(gòu)建體，其還包含編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸。
23.如權(quán)利要求22中所述的核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求12的核酸構(gòu)建體。
24.如權(quán)利要求22中所述的核酸構(gòu)建體，其包含編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸和包含編碼以下蛋白質(zhì)的核酸，該蛋白質(zhì)包含氨基酸序列SEQ ID No.2，或包含通過氨基酸的替換、插入或刪除衍生于該序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ ID No.2具有至少30％的同源性，且其具有分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的酶特性。
25.如權(quán)利要求3至6、8和15至17中任意一項(xiàng)所述的核酸以及如權(quán)利要求12至14和21至24中任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體的用途，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
26.如權(quán)利要求25中所述的用途，其中轉(zhuǎn)基因植物的精細(xì)化學(xué)品含量較野生型的精細(xì)化學(xué)品含量相比，是增加的。
27.如權(quán)利要求25中所述的用途，其中轉(zhuǎn)基因植物對非生物應(yīng)力的抗性與野生型相比，是提高的。
28.遺傳改變的生物體，其中該遺傳改變改變了野生型莽草酸路徑的代謝物流量，且生物體的精細(xì)化學(xué)品含量與野生型相比被改變了。
29.如權(quán)利要求28所述的遺傳改變的生物體，其中當(dāng)起始生物體包含所討論的核酸時(shí)，該遺傳改變使得相對于野生型而言，編碼分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的核酸的基因表達(dá)提高，或，當(dāng)起始生物體不包含所討論的核酸時(shí)，該遺傳改變使得相對于野生型而言，引起了野生型進(jìn)行編碼分支酸變位酶、預(yù)苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶的核酸的基因表達(dá)。
30.如權(quán)利要求29所述的遺傳改變的生物體，其用如權(quán)利要求21至24中任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。
31.如權(quán)利要求29所述的遺傳改變的生物體，其包含如權(quán)利要求21至24中任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體。
32.如權(quán)利要求28至31中任意一項(xiàng)所述的遺傳改變的生物體，其中所用的生物體為植物。
33.產(chǎn)生如權(quán)利要求28至32中任意一項(xiàng)所述的遺傳改變的生物體的方法，其包括將至少一種如權(quán)利要求3至6、8和15至17中任意一項(xiàng)所述的核酸或至少一種如權(quán)利要求12至14和21至24中任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入起始生物體的基因組中。
34.如權(quán)利要求28至32中任意一項(xiàng)所述的遺傳改變的生物體的用途，用于產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品。
35.如權(quán)利要求28至32中任意一項(xiàng)所述的遺傳改變的生物體用作飼料和食品的用途，其用于生產(chǎn)加工食品。
36.如權(quán)利要求3至6、8和15至17中任意一項(xiàng)所述的核酸以及如權(quán)利要求12至14和21至24中任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體的用途，用于增加生物體中精細(xì)化學(xué)品的含量。
37.如權(quán)利要求3至6、8和15至17中任意一項(xiàng)所述的核酸以及如權(quán)利要求12至14和21至24中任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建體的用途，用于在生物體中產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)生物體尤其是植物產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品尤其是維生素E、維生素K和/或泛醌的方法，其中所述生物體尤其植物的莽草酸路徑在野生型基礎(chǔ)上被遺傳改變，本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因生物體自身。
文檔編號C12N9/90GK1439054SQ01811927
公開日2003年8月27日 申請日期2001年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月29日
發(fā)明者R·巴杜拉, M·蓋格爾, I·孔策, S·佐默 申請人:太陽基因兩合公司