專利名稱：植物油菜素類固醇敏感性－相關(guān)基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與植物油菜素類固醇敏感性有關(guān)的新基因，由該基因編碼的蛋白質(zhì)，及其生產(chǎn)和用途。
背景技術(shù)：
近年來，植物分子生物學(xué)研究取得顯著進展，分析多種生理現(xiàn)象必需進行此類研究。人工修飾草的類型，尤其是控制伸長生長所導(dǎo)致的矮態(tài)可以防止植物因過多施肥導(dǎo)致的過度生長所致的倒伏。防止倒伏可在“綠色革命”時期的墨西哥小麥和國際水稻研究中心開發(fā)的超級水稻(IR-8)中得以證明。此外，當(dāng)進行高密度栽培，如水稻栽培時，人們希望通過形成直立的葉以使每個植株所接受的陽光量增加，從而增加產(chǎn)量。另外，這些修飾是很重要的育種目標(biāo)，因為它們可導(dǎo)致產(chǎn)量增加，還可增加植物生長維持的效率。然而，目前的育種方法不能人工修飾植物的形態(tài)學(xué)。
矮態(tài)是與控制正常伸長生長有關(guān)的基因突變所導(dǎo)致的異常生長。植物伸長生長是細胞分裂和細胞伸長累積的結(jié)果。細胞分裂和細胞伸長受多種因素所致的復(fù)雜效應(yīng)的控制，所述因素如包括溫度和光照的外源性環(huán)境因素，以及包括植物激素的內(nèi)源性環(huán)境因素。因此，據(jù)推測很多基因與矮態(tài)有關(guān)，所述基因如與植物激素生物合成和激素受體直接相關(guān)的基因，以及與控制這些基因的表達相關(guān)的基因(Sakamoto et al.(2000)Kagaku to Seibutsu，38131-139)。
幾乎所有的現(xiàn)代japonica水稻品種在營養(yǎng)階段都能長出15-16個植物繁殖單位，所述單位由葉，腋生芽和短的或伸長的節(jié)間部組成。在幼苗分生組織由營養(yǎng)階段進入繁殖期之后，繁殖分生組織長出約10個植物繁殖單位，所述單位由未發(fā)育的葉，伸長的節(jié)間部和發(fā)育成初生葉軸枝條的腋生芽組成。根據(jù)節(jié)間部的形態(tài)學(xué)，可將營養(yǎng)階段形成的植物繁殖單位分成三類(Suetsugu，Isao.(1968)Japan.J.Crop Sci.37，489-498)。第一類植物繁殖單位在幼年期長成并形成未分化的節(jié)和節(jié)間部。在苗端分生組織(SAM)由幼年期進入成年期之后，第二類植物繁殖單位的節(jié)片分化，其節(jié)間部的中央部分腐爛，從而產(chǎn)生氣隙。第三類植物繁殖單位由于自居間分生組織生長而含有長的伸長的節(jié)間部。
在營養(yǎng)發(fā)育階段，首先產(chǎn)生1型植物繁殖單位，接著依次產(chǎn)生2型和3型植物繁殖單位。在正常生長條件下，很多japonica品種中每種類型植物繁殖單位的數(shù)目為4-5，6-7和4-5。從1型到2型的轉(zhuǎn)變受嚴(yán)格調(diào)節(jié)。根據(jù)品種的不同，連續(xù)長出4-5個1型植物繁殖單位之后，SAM長出2型植物繁殖單位。然而，從2型到3型的轉(zhuǎn)變并不取決于長出的2型植物繁殖單位的數(shù)目。SAM長出15-16個植物繁殖單位，并且從營養(yǎng)階段進入繁殖期，然后3型植物繁殖單位開始長出，其最上方的4或5個節(jié)間部開始伸長。如果通過異常的生長條件來改變轉(zhuǎn)變的時機，2型植物繁殖單位的數(shù)目總會受影響，但具有伸長的節(jié)間部的3型植物繁殖單位的數(shù)目不會改變(Suetsugu，isao.(1968)Japan.J.Crop Sci.37，489-498)。這表明在水稻中，SAM由營養(yǎng)階段至繁殖期的轉(zhuǎn)變會誘使節(jié)間部伸長，在擬南芥中也是如此。
然而，水稻和擬南芥之間有著重要的差別。水稻伸長的節(jié)間部源自營養(yǎng)階段的SAM，而擬南芥伸長的節(jié)間部源自繁殖期的SAM。在水稻中，最上方的4或5個節(jié)間部由營養(yǎng)階段的SAM發(fā)育而來，起初與較下方的2型節(jié)間部沒有區(qū)別。當(dāng)SAM進入繁殖期時，由于節(jié)間部長出居間分生組織而分化成3型節(jié)間部。這種SAM相變與長出居間分生組織之間的同步性導(dǎo)致以下可能性當(dāng)SAM相變發(fā)生時，來自SAM的信號可將這些過程與最上方的4或5個植物繁殖單位相聯(lián)系。
因其在農(nóng)學(xué)上的重要性，已收集和鑒定了多種水稻矮小型突變體。根據(jù)其上部4至5個節(jié)間部的伸長模式，可將這些矮小型突變體分成6組(
圖1；根據(jù)Takeda，K.(1974)Bull.Fac.Agr.Hirosaki Univ.22，19-30重新繪制。在水稻中，從上至下計數(shù)每個節(jié)間部以使緊靠圓錐花序下方的最上方的節(jié)間部為第一個節(jié)間部)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在dn-型突變體中，每個節(jié)間部的長度幾乎均一地降低，導(dǎo)致類似于野生型植物的伸長模式。與之形成對照的是，dm-型突變體顯示出第二個節(jié)間部的特異性縮短。在sh-和d6-型突變體中也觀察到類似的特定節(jié)間部的縮短，其中分別只有最上方的第一個節(jié)間部或最上方以下的節(jié)間部縮短。由于這些具有特異性縮短的節(jié)間部的突變體，如dm-，d6-和sh-型突變體可能在感知來自SAM的信號方面存在缺陷，它們應(yīng)該對研究節(jié)間部伸長的機制及其與SAM中的變化的關(guān)系特別有用。
油菜素類固醇(BR)是植物生長和發(fā)育所需的，能促進植物生長的天然產(chǎn)物。僅有幾篇論文報道了油菜素類固醇對水稻和其它禾本科植物生長和發(fā)育的生理學(xué)作用。生理學(xué)研究表明外源性油菜素類固醇單獨，或與植物生長素聯(lián)合可增強水稻葉片接合處的彎曲。因其對油菜素類固醇的高敏感性，葉片接合處已被用于油菜素類固醇的敏感性生物測定(Maeda，E.(1965)Physiol.Plant.18，813-827；Wada，K.et al.(1981)Plant and Cell Physiol.22，323-325；Takeno，K.and Pharis，R.P.(1982)Plant Cell Physiol.23，1275-1281)。用油菜素內(nèi)酯或其衍生物castasterone處理黃化小麥幼苗能刺激葉片打開(Wada，K.etal.(1985)Agric.Biol.Chem.49，2249-2251)。用低或高濃度油菜素類固醇處理分別能促進或抑制水稻根的生長(Radi，S.H.and Maeda，E.(1988)J.Crop Sci.57，191-198)。油菜素類固醇也可以促進水稻種子的萌發(fā)(Yamaguchi，T.et al.(1987)Stimulation of germination in aged rice seeds by pre-treatment withbrassinolide.InProceeding of the fourteenth annual plant growth regulatorsociety of America Meeting Honolulu.(Cooke AR)，pp.26-27)。
盡管這些結(jié)果僅顯示了外源性油菜素類固醇而非內(nèi)源性油菜素類固醇的作用，但它們卻暗示出內(nèi)源性油菜素類固醇對禾本科植物的生長和發(fā)育過程具有重要作用。
另一方面，關(guān)于油菜素類固醇是否能誘使禾本科植物的細胞伸長，文獻中也有一些明顯不同的說法。即油菜素內(nèi)酯處理不會誘使水稻葉鞘伸長(Yokota，T.and Takahashi，N.(1986)Chemistry，physiology and agriculturalapplication of brassinolide and related steroids.InPlant growth substances 1985.(Bopp M，Springer-Verlag，Berlin/Heidelberg/New York)pp.129-138)，但會誘使玉米胚芽鞘和中胚軸伸長(He，R.-Y.et al.(1991)Effects of brassinolide ongrowth and chilling resistance of maize seedlings.InBrassinosteroids-Chemistry，Bioactivity and Applications ACS symposium series 474.(Cutler HGC，Yokota T，Adam G，American Chemical Society，Washington DC)，pp.220-230)。
正如顯示出具有異常器官發(fā)育的嚴(yán)重矮小型油菜素類固醇合成突變體或?qū)τ筒怂仡惞檀疾幻舾械耐蛔凅w所證實的那樣，油菜素內(nèi)酯在雙子葉植物中的功能是已知的。
然而，對內(nèi)源性油菜素類固醇在單子葉植物，如水稻或其它禾本科植物中的功能卻知之甚少。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供來自植物，優(yōu)選來自單子葉植物的與油菜素類固醇敏感性有關(guān)的新基因。本發(fā)明的另一個目的是通過控制基因表達來修飾植物的油菜素類固醇敏感性。對植物油菜素類固醇敏感性的修飾導(dǎo)致植物形態(tài)學(xué)的改變。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案提供了具有直立葉的植物，由于該植物對油菜素類固醇敏感性降低，導(dǎo)致節(jié)間部伸長受到抑制，從而使所述植物變得矮小。
通過用誘變劑處理，本發(fā)明人分離出新的水稻矮小型突變品系d61(d61-1和d61-2)，與野生型植物相比，它們顯示出較低的油菜素類固醇敏感性并具有較短的節(jié)間部。
連鎖分析表明d61基因座和與擬南芥BRI1同源的基因區(qū)域緊密連鎖。本發(fā)明人通過篩選水稻基因組DNA文庫分離出與擬南芥BRI1基因同源的基因(OsBRI1)。對d61-1和d61-2突變體的OsBRI1基因的核苷酸序列分析表明在每個d61等位基因的不同位點，存在導(dǎo)致氨基酸取代的單個核苷酸取代。
此外，為了進一步證實OsBRI1基因?qū)?yīng)于d61基因座，將OsBRI1基因?qū)雂61突變體。結(jié)果，OsBRI1基因與d61表型互補，導(dǎo)致突變品系具有野生型表型。因此，可以證實缺失OsBRI1基因的功能可導(dǎo)致產(chǎn)生d61突變體。對植物的表型分析揭示出OsBRI1基因在水稻的多個生長和發(fā)育過程中發(fā)揮作用，所述過程包括由形成居間分生組織和誘使節(jié)間部細胞縱向伸長而導(dǎo)致的節(jié)間部伸長，葉片接合處的彎曲和黑暗中的暗形態(tài)發(fā)生。
此外，當(dāng)產(chǎn)生具有OsBRI1反義核苷酸的轉(zhuǎn)基因水稻植物時，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物在幼苗生長過程中產(chǎn)生直立的葉。所有轉(zhuǎn)基因植物顯示出不同水平的矮化表型。被具有顯性失活表型的OSBRI1轉(zhuǎn)化的植物顯示出相同的結(jié)果。
鑒于上述發(fā)現(xiàn)提出本發(fā)明，本發(fā)明涉及一種與植物油菜素類固醇敏感性相關(guān)的新基因，由該基因編碼的蛋白質(zhì)，其生產(chǎn)和用途。另外，本發(fā)明涉及通過控制基因表達產(chǎn)生經(jīng)修飾的植物。
更具體地，本發(fā)明提供了(1)DNA，其編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
(2)(1)中的DNA，其中DNA是cDNA或基因組DNA；(3)(1)中的DNA，其中DNA含有SEQ ID NO1或3的核苷酸序列的編碼區(qū)；(4)DNA，其編碼與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有55％或更高同源性，且與含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)功能等同的蛋白質(zhì)，所述DNA選自(a)DNA，其編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)中的一個或多個氨基酸被取代，缺失，添加和/或插入；和(b)在嚴(yán)緊條件下與含有SEQ ID NO1或3的核苷酸序列的DNA雜交的DNA；(5)(4)中的DNA，其中DNA編碼具有下述功能的蛋白質(zhì)，所述功能選自增加植物中油菜素類固醇敏感性的功能，誘使植物莖的節(jié)間部細胞伸長的功能，將微管定位于與植物莖節(jié)間部伸長的方向垂直的功能，抑制植物頸部的節(jié)間部伸長的功能，和增加植物葉片彎曲度的功能；(6)(4)或(5)中的DNA，其中DNA得自單子葉植物；(7)(6)中的DNA，其中DNA得自禾本科植物；(8)DNA，其編碼與(1)至(7)中任一項的DNA的轉(zhuǎn)錄物互補的反義RNA；(9)DNA，其編碼具有核酶活性的RNA，所述核酶可特異性裂解(1)至(7)中任一項的DNA的轉(zhuǎn)錄物；(10)DNA，其編碼當(dāng)在植物細胞中表達時，因共-抑制而能阻抑(1)至(7)中任一項的DNA表達的RNA，所述DNA與(1)至(7)中任一項的DNA具有90％或更高的同源性；(11)DNA，其編碼相對于(1)至(7)中任一項的DNA所編碼的蛋白質(zhì)而言具有顯性失活表型的蛋白質(zhì)；(12)含有(1)至(7)中任一項的DNA的載體；(13)轉(zhuǎn)化細胞，其含有(1)至(7)中任一項的DNA或(12)中的載體；(14)由(1)至(7)中任一項的DNA編碼的蛋白質(zhì)；(15)生產(chǎn)(14)中的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括培養(yǎng)(13)中的轉(zhuǎn)化細胞，從轉(zhuǎn)化細胞或其培養(yǎng)物上清液中回收表達的蛋白質(zhì)的步驟；(16)含有(8)至(11)中任一項的DNA的載體；(17)轉(zhuǎn)化的植物細胞，其含有(1)至(11)中任一項的DNA或(12)或(16)中的載體；(18)含有(17)中的轉(zhuǎn)化植物細胞的轉(zhuǎn)化植物；(19)轉(zhuǎn)化植物，其為(18)中的轉(zhuǎn)化植物的子代或克?。?20)(18)或(19)中的轉(zhuǎn)基因植物的繁殖材料；和(21)與(14)中的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。
本發(fā)明提供了編碼水稻OsBRI1蛋白的DNA。OsBRI1 cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO1，由該DNA編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于SEQ IDNO2，OsBRI1基因組DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO3(SEQ ID NO3的基因組DNA由一個外顯子組成，其中不含內(nèi)含子)。
本發(fā)明的基因?qū)е庐a(chǎn)生水稻矮小型突變體(d61)，與野生型相比，該突變體具有短的節(jié)間部和降低的油菜素類固醇敏感性。因此，可以通過控制OsBRI1基因的表達來修飾植物形態(tài)學(xué)。
本發(fā)明對植物形態(tài)學(xué)的優(yōu)選修飾包括通過抑制本發(fā)明DNA的表達而使植物呈現(xiàn)矮態(tài)。植物的矮態(tài)在農(nóng)業(yè)和園藝中具有重大價值。例如，降低植物的高度可以使植物倒伏的傾向性降低，從而可以增加種子的重量。另外，通過降低植物的高度并使每株植物的外形更加緊湊，可以使單位面積種植的植物個體數(shù)目增加。在生產(chǎn)諸如水稻，玉米，小麥之類的作物時，所述植物修飾的價值尤為突出。通過矮化植物的高度或莖的長度也可以生產(chǎn)具有新的美學(xué)價值的觀賞植物。通過使其矮化還可以生產(chǎn)出具有新的商業(yè)價值的蔬菜或水果，例如“一口即可吃掉的”蔬菜或水果。除了對工業(yè)化植物有用以外，矮態(tài)對實驗植物也很重要，因為矮小型植物不僅更易于管理，也有助于通過縮短栽培間距而更有效地利用實驗場地。
可以考慮通過在植物中表達本發(fā)明的DNA來增加對油菜素類固醇敏感性低的植物中的油菜素類固醇敏感性。籍此，可通過培養(yǎng)較高的植物來增加整個植物的產(chǎn)量。因此，這對增加所有飼料作物的產(chǎn)量特別有用。
編碼本發(fā)明的OsBRI1蛋白的DNA包括基因組DNA，cDNA和化學(xué)合成的DNA?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備基因組DNA和cDNA。更具體地，可按照例如下述方法制備基因組DNA(1)從植物細胞或組織中提取基因組DNA；(2)構(gòu)建基因組文庫(利用載體，例如質(zhì)粒，噬菌體，粘粒，BAC，PAC等)；(3)平鋪文庫；和(4)使用根據(jù)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA(例如SEQ ID NO1或3)制備的探針進行菌落雜交或噬斑雜交?；蛘?，可以通過PCR制備基因組DNA，所述PCR使用了特異于編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA(例如SEQ ID NO1或3)的引物。另一方面，例如，可以按照下述方法制備cDNA(1)根據(jù)提取自植物細胞或組織的mRNA合成cDNA；(2)通過將合成的cDNA插入載體，例如入ZAP來制備cDNA文庫；(3)平鋪cDNA文庫；和(4)按上述進行菌落雜交或噬斑雜交。或者，也可以通過PCR制備cDNA。
本發(fā)明包括DNA，其編碼功能等同于SEQ ID NO2的OsBRI1蛋白的蛋白質(zhì)。在本文中，術(shù)語“功能等同于OsBRI1蛋白”指的是目的蛋白質(zhì)具有與SEQ ID NO2的OsBRI1蛋白相同的功能，例如增加植物中油菜素類固醇敏感性的功能，誘使植物莖的節(jié)間部伸長的功能，將微管定位于與植物莖節(jié)間部細胞伸長的方向垂直的功能，抑制植物頸部的節(jié)間部伸長的功能，和/或增加植物葉片彎曲度的功能。所述DNA優(yōu)選得自單子葉植物，更優(yōu)選得自禾本科植物，最優(yōu)選得自水稻。
所述DNA的例子包括編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列，但其中取代，缺失，添加和/或插入了一個或多個氨基酸的突變體，衍生物，等位基因，變體和同系物的DNA。
本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的制備編碼含有經(jīng)改變之氨基酸的蛋白質(zhì)的DNA的方法包括例如定點誘變(Kramer，W.and Fritz，H.-J.(1987)“Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplexDNA.”Methods in Enzymology，154350-367)。實際上，核苷酸序列的突變也可造成蛋白質(zhì)氨基酸序列的突變。本發(fā)明的DNA也包括下述DNA，其編碼具有天然OsBRI1蛋白(SEQ ID NO2)的氨基酸序列，但其中的一個或多個氨基酸被取代，缺失，和/或添加的蛋白質(zhì)，只要它們編碼功能等同于天然OsBRI1蛋白的蛋白質(zhì)即可。另外，本發(fā)明的DNA還包括不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氨基酸序列發(fā)生改變的核苷酸序列突變體(簡并突變體)。目的DNA核苷酸突變的數(shù)目在氨基酸水平上一般相當(dāng)于100或更少個殘基，優(yōu)選為50或更少個殘基，更優(yōu)選為20或更少個殘基，更優(yōu)選為10或更少個殘基(例如5或更少個殘基，或3或更少個殘基)。
例如，通過對植物(其中DNA的表達被抑制)進行“葉片接合試驗”，并將結(jié)果與野生型植物的相應(yīng)結(jié)果進行比較，可以評價某種DNA能否實際編碼具有增加植物葉片彎曲度之功能的蛋白質(zhì)(參見實施例4)。試驗結(jié)果也可以成為評價植物對油菜素類固醇的敏感性的指標(biāo)。為了評價DNA能否編碼具有誘使植物莖的節(jié)間部伸長之功能，將微管定位于與植物莖節(jié)間部細胞伸長的方向垂直之功能，或抑制植物頸部的節(jié)間部伸長之功能的蛋白質(zhì)，可以觀察DNA表達受抑制的植物節(jié)間部細胞的形態(tài)學(xué)，并與野生型的形態(tài)學(xué)進行比較(參見實施例2和3)。
可通過例如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法生產(chǎn)編碼功能等同于SEQID NO2所述OsBRI1蛋白之蛋白質(zhì)的DNA，所述方法包括使用雜交技術(shù)的方法(Southern，E.M.(1975)Journal of Molecular Biology，98，503)；和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)(Saiki，R.K.et al.(1985)Science，230，1350-1354；Saiki，R.K.et al.(1988)Science，239，487-491)。即使用OsBRI1基因(SEQ ID NO1或3)或其部分作為探針，與基因特異性雜交的寡核苷酸作為引物，從水稻和其它植物中分離出與OsBRI1基因具有高度同源性的DNA對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是常規(guī)技術(shù)。本發(fā)明的DNA包括這種編碼功能等同于OsBRI1蛋白的蛋白質(zhì)，可通過雜交技術(shù)或PCR技術(shù)得到的DNA。
優(yōu)選在嚴(yán)緊條件下進行雜交反應(yīng)以便分離這種DNA。本發(fā)明的嚴(yán)緊雜交條件包括如下條件6M尿素，0.4％SDS和0.5×SSC；以及能與所述條件產(chǎn)生類似嚴(yán)緊度的條件。當(dāng)在具有較高嚴(yán)緊度，例如6M尿素，0.4％SDS和0.1×SSC的條件下進行雜交時，有望能有效分離到具有較高同源性的DNA。在這種條件下分離到的DNA有望能編碼與OsBRI1蛋白(SEQ ID NO2)具有高度氨基酸水平同源性的蛋白質(zhì)。在本文中，“高度同源性”指的是全長氨基酸之間的同一性至少為55％或更高，更優(yōu)選為70％或更高，最優(yōu)選為90％或更高(例如95％或更高)。
根據(jù)Karlin和Altschul所述的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905873-5877，1993)，可以測定一個氨基酸序列或核苷酸序列與另一個氨基酸序列或核苷酸序列之間的同源性程度。根據(jù)此算法開發(fā)出程序BLASTN和BLASTX(Altschul et al.J.Mol.Biol.215403-410，1990)。為了根據(jù)基于BLAST的BLASTN分析核苷酸序列，將參數(shù)設(shè)置為例如分值＝100和字長＝12。另一方面，用于根據(jù)基于BLAST的BLASTX分析氨基酸序列的參數(shù)包括例如分值＝50和字長＝3。當(dāng)使用BLAST和帶缺口的BLAST程序時，使用每個程序的缺省參數(shù)。所述分析所用的特定技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(http//www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
本發(fā)明的DNA可被用于例如制備重組蛋白質(zhì)，通過按上文所述控制其表達來生產(chǎn)具有經(jīng)改變之表型的轉(zhuǎn)化植物等。
通?？赏ㄟ^將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA插入適當(dāng)表達載體，將所述載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)募毎?，培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞，純化表達的蛋白質(zhì)來制備重組蛋白質(zhì)。可將重組蛋白質(zhì)表達成與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白以易于純化，例如，表達成與大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白(New England Biolabs，USA，載體pMAL系列)的融合蛋白，與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)(Amersham Pharmacia Biotech，載體pGEX系列)的融合蛋白，或用組氨酸(Novagen，pET系列)標(biāo)記。對宿主細胞沒有限制，只要所述細胞適于表達重組蛋白質(zhì)即可。除了上述大腸桿菌以外，還可以利用酵母或多種動物，植物或昆蟲細胞?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法將載體導(dǎo)入宿主細胞。例如，可以使用利用鈣離子的轉(zhuǎn)化方法(Mandel，M.and Higa，A.(1970)Journal of Molecular Biology，53，158-162；Hanahan，D.(1983)Journal of Molecular Biology，166，557-580)將載體導(dǎo)入大腸桿菌。可通過已知方法從宿主細胞或其培養(yǎng)物上清液中純化和回收宿主細胞中表達的重組蛋白質(zhì)。當(dāng)將重組蛋白質(zhì)表達成與麥芽糖結(jié)合蛋白或其它配對物的融合蛋白時，可通過親和層析容易地純化重組蛋白質(zhì)。
可以使用所得的蛋白質(zhì)制備與該蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。例如，通過用本發(fā)明的純化蛋白質(zhì)或其部分免疫接種免疫動物，如兔，過一段時間之后收集血液并除去血塊，即可制備出多克隆抗體。通過使骨髓瘤細胞與被上述蛋白質(zhì)或其部分免疫之動物的抗體-形成細胞融合，分離表達所需抗體的單克隆細胞(雜交瘤)，并從細胞中回收抗體即可制備單克隆抗體?？梢允褂盟每贵w純化或檢測本發(fā)明的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明包括與本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。
為了生產(chǎn)出能表達本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)化植物，將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA插入適當(dāng)載體；然后將載體導(dǎo)入植物細胞；最后，再生所得的轉(zhuǎn)化植物細胞。
另一方面，可使用阻抑編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA表達的DNA產(chǎn)生本發(fā)明DNA的表達受到抑制的轉(zhuǎn)化植物其中將DNA插入適當(dāng)載體，將載體導(dǎo)入植物細胞，然后，再生所得的轉(zhuǎn)化植物細胞。術(shù)語“阻抑編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA表達”包括抑制基因轉(zhuǎn)錄以及抑制其翻譯成蛋白質(zhì)。不僅包括完全不能表達DNA，還包括表達量的降低。
通過利用反義技術(shù)的方法可以阻抑植物中特定內(nèi)源性基因的表達，所述方法是本領(lǐng)域公知的。Ecker等通過使用瞬時基因表達法，首次在植物細胞中闡明通過電穿孔導(dǎo)入的反義RNA的反義效應(yīng)(J.R.Ecker and R.W.Davis(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835372)。隨后，據(jù)報道通過表達反義RNA降低了煙草和矮牽牛花中的靶基因表達(A.R.van der Krol et al.(1988)Nature 333866)。目前，反義技術(shù)作為阻抑靶基因表達的一種手段已在植物中建立。
反義核酸阻抑靶基因表達需要多個因素。它們包括通過形成三鏈體抑制轉(zhuǎn)錄起始；通過在RNA聚合酶已形成局部開環(huán)結(jié)構(gòu)的位點形成雜交體以抑制轉(zhuǎn)錄；通過與正被合成的RNA形成雜交體以抑制轉(zhuǎn)錄；通過在內(nèi)含子與外顯子之間的連接處形成雜交體以抑制剪接；通過在剪接體形成位點形成雜交體以抑制剪接；通過與mRNA形成雜交體以抑制mRNA從細胞核轉(zhuǎn)座至細胞質(zhì)；通過在加帽位點或poly A添加位點形成雜交體以抑制剪接；通過在翻譯起始因子的結(jié)合位點形成雜交體以抑制翻譯起始；通過在起始密碼子附近的核糖體結(jié)合位點形成雜交體以抑制翻譯；通過在已翻譯的區(qū)域或mRNA的多核糖體結(jié)合位點形成雜交體以抑制肽鏈延伸；和通過在核酸與蛋白質(zhì)之間相互作用的位點形成雜交體以抑制基因表達。這些因素通過抑制轉(zhuǎn)錄，剪接或翻譯過程來阻抑靶基因表達(Hirashima and Inoue，“Shin SeikagakuJikken Koza(New Biochemistry Experimentation Lectures)2，Kakusan(NucleicAcids)IV，Idenshi No Fukusei To Hatsugen(Replication and Expression ofGenes)”，Nihon Seikagakukai Hen(The Japanese Biochemical Society)，TokyoKagaku Dozin，pp.319-347，(1993))。
本發(fā)明的反義序列可通過上述任一種機制阻抑靶基因表達。在一個實施方案中，如果將反義序列設(shè)計成與基因的mRNA的5’末端附近的非翻譯區(qū)互補，即可有效抑制基因的翻譯。也可以使用與編碼區(qū)或3’方向的非翻譯區(qū)互補的序列。因此，本發(fā)明中所用的反義DNA包括具有基因的非翻譯區(qū)的反義序列和翻譯區(qū)的反義序列的DNA。所用反義DNA被連接于適當(dāng)啟動子的下游，優(yōu)選在3’方向連接含有轉(zhuǎn)錄終止信號的序列。通過已知方法將如此制備的DNA轉(zhuǎn)染至所需植物。優(yōu)選反義DNA的序列是與待轉(zhuǎn)化的植物的內(nèi)源性基因或其部分互補的序列，但不必精確互補，只要它能有效抑制基因表達即可。轉(zhuǎn)錄的RNA與轉(zhuǎn)錄的靶基因產(chǎn)物優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％互補。使用上述檢索可測定序列的互補性。
為了利用反義序列有效抑制靶基因的表達，反義DNA的長度應(yīng)該至少為15個核苷酸，優(yōu)選為至少100個核苷酸，更優(yōu)選為至少500個核苷酸。所用反義DNA一般短于5kb，優(yōu)選短于2.5kb。
也可以使用編碼核酶的DNA阻抑內(nèi)源性基因的表達。核酶是具有催化活性的RNA分子。有很多種具有多種活性的核酶。對于作為RNA裂解酶的核酶的研究使得人們能設(shè)計出位點-特異性裂解RNA的核酶。盡管一些I組內(nèi)含子型核酶或RNaseP中包含的M1RNA由400或更多個核苷酸組成，其它屬于錘頭狀或發(fā)夾狀的核酶卻具有約40個核苷酸的活性結(jié)構(gòu)域(MakotoKoizumi and Eiko Ohtsuka，(1990)Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Nucleic acid，Protein，and Enzyme)，352191)。
錘頭狀核酶的自-裂解結(jié)構(gòu)域在序列G13U14C15的C15的3’方向進行裂解。據(jù)認為在U14和第九位的A之間形成核苷酸對對于核酶活性而言是至關(guān)重要的。另外，已證實當(dāng)?shù)?5位的核苷酸是A或U而不是C時，也會發(fā)生裂解(M.Koizumi et al.，(1988)FEBS Lett.228225)。如果將核酶的底物結(jié)合位點設(shè)計成與相鄰于靶位點的RNA序列互補，即可產(chǎn)生限制性酶-樣的可裂解RNA的核酶，該核酶可識別靶RNA中的序列UC，UU或UA(M.Koizumi et al.，(1988)FEBS Lett.239285；Makoto Koizumi and Eiko Ohtsuka，(1990)Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Protein，Nucleic acid，and Enzyme)，352191；M.Koizumi et al.，(1989)Nucleic Acids Res.177059)。例如，在OsBRI1基因的編碼區(qū)(SEQ ID NO1或3)，有多個可用作核酶靶的位點。
發(fā)夾狀核酶也可用于本發(fā)明。例如，在煙草環(huán)斑病毒衛(wèi)星RNA的負鏈中可以發(fā)現(xiàn)發(fā)夾狀核酶(J.M.Buzayan，Nature 323349(1986))。另外還證實了該核酶可靶-特異性地裂解RNA(Y.Kikuchi and N.Sasaki，(1992)NucleicAcids Res.196751；Yo Kikuchi，(1992)Kagaku To Seibutsu(Chemistry andBiology)30112)。
將經(jīng)設(shè)計可裂解靶的核酶與啟動子(如花椰菜花葉病毒35S啟動子)和轉(zhuǎn)錄終止序列融合，使其能在植物細胞中被轉(zhuǎn)錄。然而，如果在被轉(zhuǎn)錄的RNA的5’末端或3’末端添加額外序列，核酶活性可能會喪失。在這種情況下，可以在核酶部分的5’或3’方向再放置一種順式起作用以進行整理的整理核酶，以從含有核酶的經(jīng)轉(zhuǎn)錄RNA上精確切下核酶部分(K.Taira et al.(1990)Protein Eng.3733；A.M.Dzaianott and J.J.Bujarski(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864823；C.A.Grosshands and R.T.Cech(1991)Nucleic Acids Res.193875；K.Taira et al.(1991)Nucleic Acid Res.195125)。通過將這些結(jié)構(gòu)單位串聯(lián)排列以獲得更大效果，可以裂解靶基因內(nèi)的多個位點(N.Yuyama et al.(1992)Biochem.Biophys.Res.Commun.1861271)。通過使用這些核酶，可以特異性裂解本發(fā)明的靶基因的轉(zhuǎn)錄物，從而阻抑所述基因的表達。
通過用具有與靶基因序列相同或類似序列的DNA轉(zhuǎn)化以進行共-抑制，也可以阻抑內(nèi)源性基因的表達?！肮?抑制”指的是當(dāng)通過轉(zhuǎn)化將具有與靶內(nèi)源性基因序列相同或類似序列的基因?qū)胫参飼r，導(dǎo)入的外源性基因和靶內(nèi)源性基因的表達同時受抑制的現(xiàn)象。盡管仍不清楚共-抑制的詳細機理，但在植物中經(jīng)常能觀察到共-抑制現(xiàn)象(Curr.Biol.(1996)7R793(1997)，Curr.Biol.6810)。例如，如果希望得到OsBRI1基因受到共-阻抑的植物體，可用經(jīng)設(shè)計能表達OsBRI1基因的載體DNA或具有類似序列的DNA轉(zhuǎn)化所述植物，以在所得的植物中選擇出具有OsBRI1突變體特征的植物，例如，節(jié)間部伸長受抑制的植物。用于共-抑制的基因不必與靶基因完全相同，但應(yīng)該具有至少70％或更高的序列同一性，優(yōu)選80％或更高的序列同一性，更優(yōu)選90％或更高(例如95％或更高)的序列同一性。通過上述檢索可測定序列同一性。
另外，通過用具有靶基因顯性失活表型的基因轉(zhuǎn)化植物，也可以阻抑本發(fā)明的內(nèi)源性基因表達。在本文中，“編碼具有顯性失活表型之蛋白質(zhì)的DNA”指的是當(dāng)DNA表達時，其所編碼的蛋白質(zhì)能消除或降低由植物固有的本發(fā)明內(nèi)源性基因所編碼蛋白質(zhì)的活性的DNA。優(yōu)選所述DNA是編碼缺乏本發(fā)明蛋白質(zhì)的N-末端區(qū)域但含有其激酶區(qū)域的肽(例如含有SEQ ID NO2的氨基酸的739至1035殘基的肽，或等同于該肽的另一種蛋白質(zhì)的肽)的DNA?？砂瓷衔乃?，通過目的DNA是否能消除或削弱增強植物中的油菜素類固醇敏感性的功能，誘使植物莖的節(jié)間部伸長的功能，將微管定位于與植物莖節(jié)間部細胞伸長的方向垂直的功能，抑制植物頸部的節(jié)間部伸長的功能，和/或增加植物葉片彎曲度的功能，來測定目的DNA是否具有消除或增強本發(fā)明內(nèi)源性基因之活性的功能。
對用于轉(zhuǎn)化植物細胞的載體沒有限制，只要該載體能在植物細胞中表達插入的基因即可。例如，可以使用含有能在植物細胞中組成型表達基因的啟動子(例如花椰菜花葉病毒35S啟動子)和可被外源性刺激物誘導(dǎo)的啟動子。本文所用術(shù)語“植物細胞”包括多種形式的植物細胞，如經(jīng)培養(yǎng)的細胞懸浮物，原生質(zhì)體，葉片和愈傷組織。
可通過已知方法將載體導(dǎo)入植物細胞，所述方法如聚乙二醇法，電穿孔，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移和顆粒轟擊。可根據(jù)植物細胞的類型，通過已知方法由轉(zhuǎn)化的植物細胞再生植物(Toki et al.，(1995)Plant Physiol.1001503-1507)。例如，水稻植物的轉(zhuǎn)化和再生方法包括(1)使用聚乙二醇將基因?qū)朐|(zhì)體并再生植物體(適于indica水稻品種)(Datta，S.K.(1995)in“Gene Transfer ToPlants”，Potrykus I and Spangenberg Eds.，pp66-74)；(2)使用電脈沖將基因?qū)朐|(zhì)體并再生植物體(適于japonica水稻品種)(Toki et al(1992)PlantPhysiol.100，1503-1507)；(3)通過顆粒轟擊將基因直接導(dǎo)入細胞并再生植物體(Christou et al.(1991)Bio/Technology，9957-962)；(4)使用農(nóng)桿菌導(dǎo)入基因并再生植物體等。這些方法已在本領(lǐng)域中建立，并廣泛應(yīng)用于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域。所述方法適用于本發(fā)明。
一旦獲得已將本發(fā)明的DNA導(dǎo)入基因組的轉(zhuǎn)化植物，即可通過有性或無性繁殖由上述植物體獲得后代?；蛘?，可由得自植物，及其后代或其克隆的繁殖材料(例如種子，果實，谷穗，塊莖，小塊莖，tubs，愈傷組織，原生質(zhì)體等)大量產(chǎn)生植物。被本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)化的植物細胞，包括這些細胞的植物體，植物的后代和克隆，以及得自植物，其后代和克隆的繁殖材料都包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明的植物優(yōu)選為單子葉植物，更優(yōu)選為禾本科植物，最優(yōu)選為水稻。本發(fā)明的植物的表型不同于野生型表型。在本發(fā)明產(chǎn)生的植物中，有所改變的表型包括植物的油菜素類固醇敏感性，植物生長(如植物莖節(jié)間部細胞的伸長和谷穗節(jié)間部的伸長)，葉的彎曲，和將微管定位于與植物莖節(jié)間部細胞伸長的方向垂直。
附圖簡述圖1是野生型水稻和多種矮小型突變體和野生型水稻植物的節(jié)間部伸長模式的示意圖。示意圖中顯示出每個節(jié)間部與莖相比較的相對長度。野生型以N表示。
圖2是顯示d61突變體表型的照片。
(A)總體形態(tài)學(xué)。(左邊)野生型植物；(中間)d61-1突變體(弱等位基因)；(右邊)d61-2突變體(強等位基因)。
(B)節(jié)間部的伸長模式。野生型植物(左邊)顯示出N-型伸長模式，而d61-1(中間)和d61-2(右邊)突變體分別顯示出典型的dn-和d6-型模式。
(C)圓錐花序結(jié)構(gòu)。野生型植物(左邊)具有短的圓錐花序，而d61-1(中間)和d61-2(右邊)突變體具有較長的圓錐花序。
(D)d61直立的葉。野生型植物(左邊)的葉在白色箭頭所示的葉片接合處彎曲，而d61-1(中間)和d61-2(右邊)突變體的葉更加直立。
(E)d61的葉鞘。d61-1(中間)和d61-2(右邊)突變體的葉鞘短于野生型植物(左邊)的葉鞘。
圖3是顯示野生型和d61-2水稻植物已完全長好的節(jié)間部之結(jié)構(gòu)的顯微照片，其中(A)野生型水稻第一節(jié)間部的縱向切片；(B)野生型水稻第二節(jié)間部的縱向切片；(C)野生型水稻第三節(jié)間部的縱向切片；(D)野生型水稻第四節(jié)間部的縱向切片；(E)d61-2水稻植物第一節(jié)間部的縱向切片；(F)d61-2水稻植物第二節(jié)間部的縱向切片；(G)d61-2水稻植物第三節(jié)間部的縱向切片；和(H)d61-2水稻植物第四節(jié)間部的縱向切片；標(biāo)尺分別為100μm。
圖4是顯示野生型和d61-2植物第一節(jié)間部內(nèi)伸長的細胞中的微管方向的照片和圖，由野生型(A和C)和d61-2(B和D)植物第一節(jié)間部的節(jié)間薄壁組織細胞中微管排布的免疫熒光圖像(A和B)或圖示(C和D)組成。標(biāo)尺為50μm。
圖5是顯示野生型，D61-1和d61-2幼苗對油菜素內(nèi)酯的反應(yīng)的照片。
在存在或缺乏1μM油菜素內(nèi)酯(BL)時，在瓊脂平板上萌發(fā)種子。萌發(fā)1天后觀察幼苗。BL處理誘使野生型植物異常生長，而突變體幼苗不受其影響。
圖6是顯示油菜素內(nèi)酯對野生型，D61-1和d61-2植物黃化葉片傾斜程度的影響的照片。
圖中顯示出野生型(A組)的葉反應(yīng)最大，突變體植物d61-1(B組)和d61-2(C組)的葉反應(yīng)減弱。
圖7是顯示野生型和d61-2水稻植物中油菜素類固醇及其生物合成前體的量的圖。
圖中顯示出突變體(上圖)和野生型(下圖)植物中每種化合物的量(ng/g鮮重)。ND表示未檢測。
圖8是顯示d61在黑暗中的去-黃化表型的照片。
(A)野生型左邊在黑暗中生長2周的幼苗右邊在光照下生長2周的幼苗野生型(A)和兩種赤霉素缺陷型水稻突變體d18(D)和d35(E)在黑暗中顯示出節(jié)間部伸長。
(B)d61-1突變體左邊在黑暗中生長2周的幼苗右邊在光照下生長2周的幼苗白色箭頭表示在每組右邊的黑暗條件下的節(jié)間部伸長。在光照條件下(每組的左邊)未觀察到伸長。
(C)d61-2突變體左邊在黑暗中生長2周的幼苗右邊在光照下生長2周的幼苗甚至在黑暗的條件下，在d61突變體，d61-1(B)和d61-2(C)中也未觀察到節(jié)間部伸長。本發(fā)明人剝下在黑暗中生長的植物的葉鞘。
(D)d18突變體左邊在黑暗中生長2周的幼苗右邊在光照下生長2周的幼苗(E)d35突變體左邊在黑暗中生長2周的幼苗右邊在光照下生長2周的幼苗圖9是顯示d61基因座和OsBRI1之間強連鎖的圖和照片。
(A)是表示d61基因座在染色體1長臂上的作圖位置的圖。
(B)是顯示檢測d61基因座和OsBRI1之間的連鎖的DNA雜交分析之結(jié)果的照片。當(dāng)用EcoRI消化基因組DNA時，在Japonica親本T65(泳道T，12.5kb)和Indica親本Kasarath(泳道K，17.5kb)之間觀察到OsBRI1的RFLP。具有正常表型的植物(WT)是雜合的(12.517.5kb)，或是Indica等位基因為純合的(17.5kb)，而具有突變表型的植物(突變體)總是Japonica等位基因為純合的(12.5kb)。
圖10顯示了OsBRI1和擬南芥BRI1推定氨基酸序列的比較。涂黑部分為相同的堿基。下劃線區(qū)域*1，*2，*3和*4表示推定的信號肽，亮氨酸拉鏈基元，半胱氨酸對的N和C側(cè)。
圖11是圖10的延續(xù)。
圖12是顯示OsBRI1在多個器官中的表達模式的照片。
將得自野生型植物多個器官的總RNA(10μg)上樣于每個泳道。
OsBRI1的器官特異性表達(A)葉片(泳道1)，葉鞘(泳道2)，已長好的花(泳道3)，葉軸(泳道4)，苗端(泳道5)，根(泳道6)和種子(泳道7)。
OsBRI1在處于生長中的第一節(jié)間部中的區(qū)域特異性表達(B)處于生長中的節(jié)間部的節(jié)(泳道1)，分裂區(qū)帶(泳道2)，伸長區(qū)帶(泳道3)和已伸長的區(qū)帶(泳道4)。
OsBRI1在每個正在伸長的節(jié)間部中的差異表達(C)分別為第一至第四節(jié)間部的，正處于每個節(jié)間部的活躍伸長期的分裂和伸長區(qū)帶(泳道1-4)。OsBRI1在營養(yǎng)階段未伸長的莖中也能高水平地表達(泳道5)。
OsBRI1依賴于光和依賴于油菜素內(nèi)酯的表達(D)在存在(泳道2和4)或缺乏(泳道1和3)1μM油菜素內(nèi)酯時，在瓊脂平板上將水稻幼苗在光照下(泳道1和2)或黑暗中(泳道3和4)培養(yǎng)10天。
圖13是顯示表達OsBRI1反義鏈的轉(zhuǎn)基因水稻植物之表型的照片。
(A)與野生型植物(左邊)相比，具有中度(中間)和重度矮化表型(右邊)的OsBRI1反義植物的矮化表型。
(B)具有重度矮化表型的轉(zhuǎn)基因植物的近觀圖。標(biāo)尺為5cm。
(C)轉(zhuǎn)基因植物的裸稈節(jié)間部。從左至右分別顯示了具有正常的節(jié)間部伸長模式的野生型植物和具有dm，dm-d6和d6表型的轉(zhuǎn)基因植物。
(D)野生型(左邊)和具有輕度矮化表型(右邊)的轉(zhuǎn)基因植物的葉形態(tài)學(xué)，后者顯示出直立的葉。
(E)具有重度矮化表型的轉(zhuǎn)基因植物的異常葉形態(tài)學(xué)，顯示出缺乏長成的鞘器官。標(biāo)尺為10cm。
(F)野生型(左邊)和具有輕度(中間)和中度矮化表型(右邊)的轉(zhuǎn)基因植物的圓錐花序形態(tài)學(xué)。
圖14是顯示轉(zhuǎn)基因植物表型的照片，所述植物表達顯性失活的OsBRI1。圖中顯示了轉(zhuǎn)基因植物(左邊)和含有不含任何插入物之載體的對照植物(右邊)。
實施本發(fā)明的最佳方式下文將參照實施例具體闡明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于此。
將水稻(Oriza sativa)種子浸泡在蒸餾水中，于30℃讓其吸收水份48小時。用蒸餾水將種子清洗幾次，于30℃的暗室中將種子萌發(fā)8天。于30℃(白天)和24℃(夜晚)在大田或溫室中培養(yǎng)水稻植物。
鑒定水稻d61矮小型突變體通過用N-甲基-N-亞硝基脲(NMU)處理，分別獲得水稻矮小型突變體d61-1和d61-2(圖2A)。
攜有弱等位基因的d61突變體特異性地?zé)o法伸長第二節(jié)間部(dm-型)，而具有強等位基因的突變體不能伸長除最上方的節(jié)間部以外的所有節(jié)間部(d6-型)(Wu，X.et al.(1999)Bread.Sci.49，147-153)。
d61-2的稈比d61-1的要短得多。另外，d61-1顯示出典型的dm-型節(jié)間部伸長模式，而d61-2顯示出d6-型的節(jié)間部伸長模式(圖2B)。因此，起初將它們鑒定為兩種獨立的突變體。然而，雜交試驗表明它們是位于單個基因座上的等位基因。這是第一例顯示出不同的，特異性的節(jié)間部伸長抑制模式的單基因座水稻突變體。
多效作用以及特異性抑制節(jié)間部伸長的結(jié)果導(dǎo)致這些突變體具有其它異常的表型。例如，突變體的頸節(jié)間部長于野生型植物(圖2C)。由于這些植物的頸節(jié)間部長度與稈的長度呈負相關(guān)，因此，野生型植物具有最長的稈和最短的頸節(jié)間部，d61-1突變體具有中等長度的稈和頸節(jié)間部，d61-2具有最短的稈和最長的頸節(jié)間部。
這些突變體的另一個異常表型是直立的葉(圖2D)。在野生型植物中，葉片彎曲，偏離指向遠軸方向的葉鞘垂直軸。正如圖2D中的箭頭所示，葉片彎曲，偏離特定器官即葉片接合處的葉鞘。當(dāng)葉片和葉鞘完全伸長時，葉片接合處近軸方向的細胞開始伸長，導(dǎo)致葉片彎曲偏離葉鞘。然而，突變體的葉片并未明顯彎曲偏離葉鞘。在d61-1突變體中，一些葉仍顯示出輕微彎曲(圖2D，中間)，但在d61-2突變體中，幾乎所有的葉都完全直立(圖2D，右邊)。
也就是說，葉片的傾斜度與矮態(tài)的嚴(yán)重程度相關(guān)。葉片嚴(yán)重傾斜的持續(xù)性表明葉片近軸方向的表面細胞縱向伸長，導(dǎo)致葉片傾斜，持續(xù)地對油菜素類固醇信號作出反應(yīng)。
沒有或較少長出葉片接合處不是突變體的葉不彎曲的原因。實際上，甚至葉片接合處具有嚴(yán)重表型的d61-2突變體也能正常發(fā)育。與野生型植物相比，突變體顯示出較短的葉鞘(圖2E)。
觀察節(jié)間部的細胞形態(tài)學(xué)節(jié)間部伸長是由居間分生組織中的細胞分裂和伸長區(qū)帶中的細胞伸長引起的(Hoshikawa，K.(1989)Stem.InThe growing rice plant.(Nobunkyo)，pp.123-148)。因此，稈的矮化可能是其中一個或兩個過程的缺陷引起的。為了區(qū)分這些可能性，本發(fā)明人在顯微鏡下觀察了成年植物每個節(jié)間部的切片。
在FAA(福爾馬林∶冰醋酸∶70％乙醇，1∶1∶18)中固定取自不同階段的成長中的或已長好的稈，并在乙醇梯度系列中脫水。將樣品包埋于于45℃聚合化的Technovit 7100樹脂(Kurzer，德國)，切下3-5μm的切片，用ToluidineBlue染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察。
圖3顯示了野生型植物和d61-2突變體上面4個節(jié)間部的細胞形態(tài)學(xué)。在野生型植物中，所有節(jié)間部中的細胞縱向伸長，并以縱格排列較好地組織在一起(圖3A，3B，3C和3D)。在突變體植物的第一節(jié)間部也觀察到類似的縱向細胞排列，盡管細胞略短于野生型植物中的細胞(圖3E)。在突變體未伸長的節(jié)間部，如第二和第三節(jié)間部中，細胞排列是紊亂的，沒有明顯的有組織的細胞縱列(圖3F和3G)。節(jié)間部細胞排列紊亂表示未伸長的節(jié)間部中沒有長出突變體的居間分生組織，所述分生組織一般能產(chǎn)生縱向排列的伸長細胞。在第四節(jié)間部中，存在有組織的細胞排列，但細胞要比野生型植物的短很多(與圖3D和3H相比)。這表明這些節(jié)間部中確實長出了居間分生組織，但細胞不能伸長。
觀察微管排列據(jù)詳細描述，細胞伸長取決于微纖維的方向(Ledbetter，M.C.and Porter，K.R.(1963)J.Cell Biol.19，239-250；Green，P.B.(1962)Science.138，1404)。因此，本發(fā)明人通過免疫熒光顯微術(shù)檢查了野生型和d61-2突變體植物節(jié)間部細胞的微管排列情況。
對節(jié)間部薄壁組織中的微管進行免疫熒光染色。更具體地，于室溫下，用含有3.7％(w/v)低聚甲醛的微管-穩(wěn)定緩沖液(0.1M哌嗪-二乙醇磺酸，1mM MgCl2，5 mM乙二醇-雙(3-氨基甲基醚-N，N，N’，N’-四乙酸，0.2％(v/v)Triton X-100，1％(w/v)甘油，pH6.9)將節(jié)間部薄壁組織預(yù)固定45分鐘。用新刀片切割縱向切片，將切片收集于固定溶液中，在其中處理40分鐘，用不含低聚甲醛的固定溶液清洗。然后于37℃將切片與已用含有0.1％(v/v)Triton X-100的磷酸緩沖鹽水稀釋500倍的兔抗α-微管蛋白單克隆抗體保溫1小時。用不含抗血清的緩沖液將切片清洗3次，然后于4℃與已用含有0.1％(v/v)Triton X-100的磷酸緩沖鹽水稀釋50倍的，經(jīng)熒光素-異硫氰酸鹽-標(biāo)記的小鼠抗-兔IgG抗體保溫過夜。用相同的緩沖液清洗3次之后，將它們安放在抗衰減溶液(Fluoro Guard Antifade reagent，Bio-Rad)中，并在熒光顯微鏡下進行觀察。
結(jié)果，在野生型植物中，正在伸長的節(jié)間部的細胞中的微管以與伸長方向呈直角的方式整齊排列(圖4A)。然而，在d61-2突變體中，第一個正在伸長的節(jié)間部的細胞中的微管在每個細胞中以顯然為隨機的不同的方向排列(圖4B)。另外，相對于野生型植物而言，突變體中的微管顯得較細而且較不清楚。
另外，本發(fā)明人未能在突變體植物未伸長的節(jié)間部的細胞中觀察到任何有組織的微管排列。
實施例2的結(jié)果總括起來可以說明突變體中未伸長的節(jié)間部不能長出居間分生組織，細胞中的微管不能有組織地排列。在突變體中的確實能夠伸長(但比不上野生型植物)的節(jié)間部中，實際上長出了居間分生組織，但細胞中的微管不能較好地有組織地排列。
油菜素類固醇敏感性試驗d61突變體的矮小表型和直立的葉暗示D61基因產(chǎn)物參與油菜素類固醇生物合成或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的可能性。因此，本發(fā)明人進行了下列實驗。
首先，本發(fā)明人嘗試恢復(fù)d61突變體的矮態(tài)，但通過使用油菜素內(nèi)酯無法達至到此目的。
接著，在含或不含1μM油菜素內(nèi)酯的瓊脂平板上萌發(fā)野生型和突變體植物的種子。在萌發(fā)1天后觀察整個幼苗的特征。
結(jié)果表明當(dāng)在含有油菜素內(nèi)酯的平板上萌發(fā)野生型植物時，野生型植物的胚芽鞘異常伸長，導(dǎo)致外形扭曲，營養(yǎng)葉長勢較差，不能突破胚芽鞘(圖5)。另外，根的伸長受到抑制，因此根不直，但是以波浪形長出。野生型植物在缺乏油菜素內(nèi)酯時能正常生長，胚芽鞘伸長終止于萌發(fā)早期，然后營養(yǎng)葉伸長以擺脫胚芽鞘的束縛。根正常生長，不具有任何波浪形(圖5)。與野生型植物形成對照的是，在不含油菜素類固醇的平板上，甚至在存在油菜素類固醇的平板上，突變體仍能顯示出與野生型植物一樣好的正常生長模式。這些結(jié)果表明與野生型植物相比，突變體植物對油菜素內(nèi)酯較不敏感。
本發(fā)明人使用更加量化的方法進一步檢測了突變體對油菜素內(nèi)酯的敏感性。
眾所周知，水稻葉片和葉鞘之間的彎曲度對油菜素內(nèi)酯或其相關(guān)化合物的濃度敏感。即使不知道內(nèi)源性油菜素類固醇在包括水稻的單子葉植物中的生物學(xué)功能，水稻葉的這一不尋常特征仍可作為油菜素類固醇定量生物測定(已知為葉片接合處試驗(Wada，K et al.(1981)Plant and Cell Physiol.22，323-325))的基礎(chǔ)。如果突變體對油菜素類固醇較不敏感，突變體植物葉片和葉鞘之間的彎曲度將低于野生型植物葉片和葉鞘之間的彎曲度。
分別用10-3和10-3μg/ml油菜素類固醇檢測野生型T65植物(突變體的背景品系)，d61-1突變體和d61-2突變體第一片葉的葉片接合。
結(jié)果，在缺乏外源性油菜素內(nèi)酯時，野生型T65植物的葉片以幾乎與葉鞘軸呈直角的方式彎曲，在存在增加濃度的油菜素內(nèi)酯時，甚至變得更加彎曲(圖6A)。當(dāng)將突變體用于試驗時，與野生型植物一樣，油菜素內(nèi)酯濃度較高時，彎曲程度增加。然而，在相同條件下，突變體葉彎曲的絕對程度要比野生型植物的低很多(圖6B和C)。這一點在d61-2突變體中特別明顯，其中對照葉幾乎是直的，用10-2μg/ml油菜素內(nèi)酯處理過的葉以與葉鞘軸呈小于直角的角度彎曲。葉片接合處試驗的結(jié)果進一步證實突變體對油菜素類固醇的敏感性比野生型植物的要低。
定量分析d61-2突變體中的油菜素類固醇實施例4闡明了突變體對油菜素類固醇的敏感性降低。即突變體可合成較高濃度的油菜素類固醇以補償所述降低。因此，本發(fā)明人使用具有內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的GC-SIM測定了d61-2突變體和野生型植物中的油菜素類固醇濃度。
在16小時白天和8小時夜晚的溫室中培養(yǎng)野生型和d61-2植物。收集2月齡植物的枝條，立即凍干。用250ml MeOH-CHCl3(4∶1[v/v])將凍干的枝條(相當(dāng)于50g鮮重)提取2次，在其中加入經(jīng)deuterium-標(biāo)記的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(1ng/g鮮重)。真空蒸發(fā)溶劑之后，將提取物分配于CHCl3和H2O之間。對能溶解于CHCl3的級分進行硅膠層析(Wako-gel C-300；Wako；15g)。用各為150ml的含有2％甲醇的CHCl3和含有7％甲醇的CHCl3依次洗脫柱。通過Sephadex LH-20柱層析純化每個級分，其中柱體積為200ml，用甲醇-CHCl3(4∶1[v/v])洗脫柱。收集洗脫自0.6至0.8(Ve/Vt)的級分，作為油菜素類固醇級分。在用MeOH洗脫的ODS柱體柱(10×50mm[內(nèi)部直徑x柱長])上預(yù)純化之后，用65％乙腈作為溶劑，以8ml/min的流速對得自7％MeOH級分的洗脫物進行ODS-HPLC。在HPLC純化中，將7％甲醇洗脫物拆分為castasterone(保留時間為10至15分鐘)，香蒲甾醇(25至30分鐘)，6-deoxocastasterone(40至45分鐘)級分，2％甲醇洗脫物給出6-deoxotyphasterol級分(55至60分鐘)。通過GC-SIM衍生化和分析每個級分。由內(nèi)源性油菜素類固醇和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)中占優(yōu)勢的離子的峰面積比率計算出內(nèi)源性油菜素類固醇水平。
結(jié)果，在突變體或野生型植物的枝條中未檢測到油菜素類固醇，這表明油菜素內(nèi)酯是總油菜素類固醇集合物的小組分。然而，除了在野生型植物中未發(fā)現(xiàn)teasterone外，在兩種植物中檢測到所有其它油菜素類固醇。在突變體植物中，所檢測到的所有油菜素類固醇化合物的含量更高(圖7)。特別是，突變體中的castasterone比野生型中的高4倍。這些結(jié)果支持以下假說，即突變體對油菜素類固醇無敏感性。
d61突變體的去-黃化表型據(jù)報道，當(dāng)在黑暗中生長時，油菜素類固醇生物合成或油菜素類固醇信號傳導(dǎo)有缺陷的擬南芥突變體在完全黑暗中胚軸的伸長減緩，并出現(xiàn)子葉和初生葉孔(Kauschmann，A et al.(1996)Plant J.9，701.703；Szekeres，M.et al.(1996)Cell.85，171-182)。
這種黑暗中的去-黃化(DET)或組成型光形態(tài)發(fā)生(COP)表型是擬南芥油菜素類固醇-相關(guān)突變體的共有特征。在番茄矮小型(d)突變體中也可觀察到類似的DET或COP表型，所述突變體顯示出短胚軸，缺乏頂端的鉤和子葉展開(Bishop，G.J.et al.(1996)Plant Cell.8，959-969)。與之形成對照的是，豌豆油菜素類固醇-缺損突變體lkb未顯示出這種DET表型(Nomura，T.et al.(1997)Plant Physiol.93，572-577)。在黑暗中培養(yǎng)突變體以測定是否也能在單子葉植物中發(fā)現(xiàn)這種DET或COP表型，以及d61水稻突變體是否顯示出暗形態(tài)發(fā)生的特征。
結(jié)果，當(dāng)在黑暗中萌發(fā)野生型植物時，與在光照中生長的幼苗相比，它們顯示出不尋常的中胚軸和節(jié)間部伸長(圖8A)。甚至在黑暗中，突變體中也不會出現(xiàn)這種中胚軸和節(jié)間部伸長(圖8B和8C)。在黑暗中中胚軸和節(jié)間部不能伸長不是水稻矮小型突變體的共有特征。例如，當(dāng)在黑暗中生長時，赤霉素生物合成有缺陷的兩種其它矮小型突變體d18和d35顯示出伸長的中胚軸和節(jié)間部(分別為圖8D和8E)。
因此，可以想到中胚軸和節(jié)間部的伸長減緩是d61突變體的特殊特征，且d61突變體具有去-黃化表型。另外，還表明油菜素類固醇信號缺陷所致的去-黃化是雙子葉和單子葉植物共有的特征。由此可以想到油菜素類固醇信號對于雙子葉和單子葉植物的暗形態(tài)發(fā)生至關(guān)重要。
D61基因座的作圖和連鎖分析為了作圖D61基因座，本發(fā)明人將d61-2突變體與Indica水稻品種Kasarath(Oriza sativa L.cv.Kasarath)雜交。突變體表型與水稻基因組計劃(Tsukuba，日本)釋放的限制性片段多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記之間的連鎖分析揭示出D61基因座作圖于染色體1的長臂上，與RFLP標(biāo)記C1370緊密連鎖(圖9A)。
由于d61可被鑒定為對油菜素類固醇無敏感性或敏感性降低的突變體，本發(fā)明人還檢測了突變體表型與同擬南芥BRI1基因同源的水稻基因之間的連鎖。
擬南芥BRI1基因是唯一被分離的，參與油菜素類固醇信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因(Li，J.and Chory，J.(1997)Cell.90，929-938)。另外，本發(fā)明人進行了BLAST檢索以鑒定一個水稻EST克隆S1676，該克隆與擬南芥BRI1基因具有高同源性(Li，J.and Chory，J.(1997)Cell.90，929-938)。
使用ISOPLANT DNA分離試劑盒(Nippon GENE Co.，日本)從葉組織中分離水稻基因組DNA。用適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶?μg基因組DNA，并在堿性條件下轉(zhuǎn)移至Hybond N膜(Amersham)。使用部分cDNA片段(對應(yīng)于激酶結(jié)構(gòu)域中Ser740至Asp1116的區(qū)域)探測膜，所述片段與編碼OsBRI1的基因組DNA片段特異性雜交。除了在高嚴(yán)緊度(68℃)下與膜雜交之外，根據(jù)Church和Gilbert(1984)PNAS.81，1991-1995所述的方法進行所有步驟。
當(dāng)用EcoRI消化基因組DNA并用cDNA克隆探測基因組DNA時，能觀察到Japonica(12.5kb)和Indica(17.5kb)水稻之間的RFLP。所有具有突變體表型的F2植物的Japonica等位基因(12.5kb)為純合，而具有野生型表型的F2植物或者是Indica等位基因(17.5kb)為純合，或者為雜合，同時具有Japonica和Indica等位基因(12.5 17.5kb，圖9B)。這一結(jié)果表明D61基因座與同擬南芥BRI1同源的水稻基因的位置緊密連鎖。
鑒定d61基因上述連鎖分析強烈暗示d61突變是由擬南芥BRI1基因的水稻同系物的功能喪失引起的。為了檢測此可能性，本發(fā)明人用探針篩選水稻基因組DNA文庫，并分離出全長水稻BRI1同源基因(OsBRI1，Oryza sativa BRI1)。除了在較高嚴(yán)緊度(68℃)下與膜雜交之外，根據(jù)Church和Gilbert(1984)所述的方法進行所述篩選中的雜交。根據(jù)與Church和Gilbert所述相同的方法進行測序。
就其全長而言，OsBRI1基因的結(jié)構(gòu)與擬南芥BRI1基因十分相似(圖10和圖11)。推測的OsBRI1多肽含有幾個也存在于BRI1中的結(jié)構(gòu)域，有人曾討論過它的功能(Li，J.and Chory，J.(1997)Cell.90，929-938)。這些結(jié)構(gòu)域由推定的信號肽，兩個被保守地隔開的半胱氨酸對，富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)域組成。推測的OsBRI1多肽的N-末端具有疏水區(qū)段，據(jù)推測該區(qū)段可用作信號肽以將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運至質(zhì)膜。據(jù)Li和Chory推測，在BRI1蛋白中，信號肽之后有一個潛在的4-hepted兩親性亮氨酸拉鏈基元(Li，J.and Chory，J.(1997)Cell.90，929-938)，但OsBRI1在相應(yīng)的區(qū)域不具有這種典型的亮氨酸拉鏈基元。
推定的胞外結(jié)構(gòu)域(Met1至Leu670)的側(cè)翼是多對被保守地隔開的半胱氨酸，所述胞外結(jié)構(gòu)域由22個約24個氨基酸長的富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)拷貝串聯(lián)組成，具有12個潛在的N-糖基化位點(Asn-X-Ser/Thr)。LRR可能在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮作用(Kobe，B.and Deisenhofer，J.(1994)Trends Biochem.Science.19，415-421)。
與BRI1序列相比，OsBRI1缺乏三個對應(yīng)于擬南芥BRI1第三至第五重復(fù)序列的LRR結(jié)構(gòu)域。除了在其它LRR蛋白之間發(fā)現(xiàn)的共有殘基外，位于該缺失之前的兩個LRR較不保守，但在LRR共有殘基和非保守氨基酸中，兩種蛋白質(zhì)位于缺失之后的LRR的保守性較好。BRI1 LRR區(qū)域的不尋常特征是在第21和第22個LRR之間存在70個氨基酸長的島(Li，J.and Chory，J.(1997)Cell.90，929-938)。OsBRI1中也存在非常相似的特征，在對應(yīng)于BRI1中的島的位點，在第18和第19個LRR之間存在相同數(shù)目的氨基酸。LRR區(qū)域不尋常的氨基酸島對其功能一定是至關(guān)重要的，因為該島中氨基酸殘基的交換導(dǎo)致BRI1功能的喪失(Li，J.and Chory，J.(1997)Cell.90，929-938)。據(jù)認為該基元對于與油菜素類固醇的直接相互作用或維持油菜素類固醇-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)至關(guān)重要(Li，J.and Chory，J.(1997)Cell.90，929-938)。
OsBRI1的蛋白質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域具有真核蛋白質(zhì)激酶的所有11個保守的亞結(jié)構(gòu)域，在其適當(dāng)?shù)奈恢帽Ａ袅宋醋儺惖陌被釟埢?Hanks，S.K.and Quinn，A.M.(1991)Meth.Enzymol.200，38-62)。OsBRI1的蛋白質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域在整個區(qū)域內(nèi)與BRI1的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域高度相關(guān)(44％)。它也和高等植物中的其它受體-樣蛋白質(zhì)激酶的激酶結(jié)構(gòu)域相關(guān)，所述蛋白質(zhì)激酶如得自擬南芥的ERECTA(Torii，K.U.et al.(1996)Plant Cell.8，735-746)，CLV1(Clark，S.E.etal.(1997)Cell.3，575-585)和RLK5(Walker，J.C.(1993)Plant J.3，451-456)，和得自水稻的Xa21(Song et al.，1995)。OsBRI1和這些受體-樣蛋白質(zhì)激酶，尤其是Vib和VIII中的高度保守的結(jié)構(gòu)暗示OsBRI1是絲氨酸/蘇氨酸激酶，而不是酪氨酸激酶(Hanks，S.K.and Quinn，A.M.(1991)Meth.Enzymol.200，38-62)。
在d61-1和d61-2突變體中篩選OsBRI1基因本發(fā)明人還測定了d61-1和d61-2突變體中OsBRI1基因的完整序列，并將它們與野生型的相應(yīng)序列進行比較。本發(fā)明人在不同的位點鑒定出每個突變體等位基因中的單個核苷酸取代(表1)。d61-1中的基因組突變導(dǎo)致在OsBRI1和BRI1之間保守的激酶結(jié)構(gòu)域的亞結(jié)構(gòu)域IX中的殘基989由蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫惲涟彼?。d61-2中的基因組突變使得剛好位于不尋常的70個氨基酸長的間斷區(qū)域之前的第17個LRR中的殘基491由纈氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼?。d61突變體OsBRI1基因中的這些突變?yōu)镺sBRI1編碼D61基因座提供了強有力的證據(jù)。
表1等位基因 編碼序列突變位置的特征d61-1 C→TThr→Ile(989)d61-2 G→AVal→Met(491)[實施例10]通過導(dǎo)入OsBRI1基因?qū)61突變體進行分子互補分析為了進一步證實OsBRI1對應(yīng)于d61基因座，本發(fā)明人通過導(dǎo)入野生型OsBRI1基因?qū)61-1突變體進行互補分析。
更具體地，為了進一步證實導(dǎo)入包括其5’和3’側(cè)翼區(qū)的基因組OsBRI1克隆所致的d61表型互補性，將包括完整編碼區(qū)的10.5-kb限制性片斷克隆至潮霉素抗性雙元載體pBI101-Hm3(Sato，Y.et al.(1999)EMBO J.18，992-1002)的XbaI-SmaI位點。將pBI-cont用作對照載體。本發(fā)明人進行了水稻組織培養(yǎng)和根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
用不含水稻基因組DNA的對照載體轉(zhuǎn)化d61對稈長或葉的結(jié)構(gòu)沒有明顯效果。然而，當(dāng)導(dǎo)入含有完整野生型OsBRI1基因的10.5kb DNA片斷時，幾乎在所有對潮霉素具有抗性的植物中都能發(fā)現(xiàn)正常表型。這一結(jié)果進一步證實了d61突變體表型是由OsBRI1基因的功能喪失突變引起的。
OsBRI1的RNA雜交分析關(guān)于內(nèi)源性油菜素類固醇在單子葉植物中的功能一無所知。因此，本發(fā)明人通過RNA雜交分析在多個水稻器官中檢測了OsBRI1基因的表達模式。
按文獻所述，從多個水稻組織中分離RNA(Chomczynski，P.and Sacchi，N.Anal.Biochem.(1987)162156)。在1％瓊脂糖凝膠中電泳10μg總RNA，然后轉(zhuǎn)移至Hybond N膜(Amersham)，通過RNA凝膠印跡雜交進行分析。本發(fā)明人將部分cDNA片斷(對應(yīng)于激酶結(jié)構(gòu)域的Ser740至Asp1116)用作探針，該探針能與編碼OsBRI1的基因組DNA片斷特異性雜交。使用相同的探針和如上文所述的雜交條件進行DNA雜交分析。
結(jié)果，在得自營養(yǎng)苗端的RNA中檢測到單條強-雜交帶(圖12A)。帶的大小約為3.5kb，幾乎與最長的cDNA克隆大小相同。在得自花，葉軸，根和展開的葉鞘的RNA中也觀察到相同大小的較弱的雜交帶，而在得自展開的葉片的RNA中觀察不到或只能觀察到很弱的帶。因此，器官不同，OsBRI1的表達也明顯不同，這表明這些器官中的油菜素類固醇敏感性也有所不同。
本發(fā)明人還檢查了OsBRI1在正在伸長的稈中的表達(圖12B)。正在伸長的稈被分成四部分節(jié)和節(jié)間部的分裂，伸長和已伸長的區(qū)帶。結(jié)果，在得自分裂區(qū)帶的RNA中發(fā)現(xiàn)最強的雜交帶。得自伸長區(qū)帶的RNA也給出強信號。得自節(jié)的RNA僅給出弱信號，而得自已伸長的節(jié)間部的RNA未給出任何信號。這些結(jié)果表明正在伸長的稈的各部分對油菜素類固醇的敏感性也各不相同，最敏感的部分是細胞正在活躍分裂和伸長的分裂區(qū)帶和伸長區(qū)帶。
本發(fā)明人進一步檢查了OsBRI1在上面四個處于活躍伸長期的節(jié)間部的伸長區(qū)帶中的表達。在得自最上方(第一)和最下方(第四)節(jié)間部的伸長區(qū)帶的RNA中發(fā)現(xiàn)強雜交帶，而在第二和第三節(jié)間部發(fā)現(xiàn)相對較弱的帶(圖12C)。這一結(jié)果表明節(jié)間部對油菜素類固醇的敏感性各不相同，第二和第三節(jié)間部最不敏感。
據(jù)觀察節(jié)間部對油菜素類固醇的敏感性各不相同。這暗示著如果OsBRI1的量是油菜素類固醇信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的限制因素的話，那么與第二和第三節(jié)間部相比，第一和第四節(jié)間部對油菜素類固醇的敏感性較高。這一想法得到具有中度dm-d6型表型的突變體等位基因的支持。這些植物顯示出第二和第三節(jié)間部的特異性縮短，而第一和第四節(jié)間部卻有所伸長。這與以下事實是一致的，即第二和第三節(jié)間部具有較低的OsBRI1表達水平，對油菜素類固醇的敏感性較低，從而不能對油菜素類固醇信號作出反應(yīng)并伸長。假定第一和第四節(jié)間部中較高的OsBRI1表達水平使得這些節(jié)間部對油菜素類固醇信號作出反應(yīng)并伸長。第一和第四節(jié)間部中較高的OsBRI1表達水平能解釋dm-d6型不尋常的節(jié)間部伸長模式，但無法解釋d6或dm型的出現(xiàn)。除了第一節(jié)間部外所有節(jié)間部皆縮短的d6型可以說明與第四節(jié)間部相比，第一節(jié)間部暴露于較高水平的油菜素類固醇中。第一節(jié)間部伸長時機的選擇與花中花藥的發(fā)育相對應(yīng)，在很多植物的這些器官中已觀察到高水平的油菜素類固醇(Grove，M.et al.(1979)Nature，281，216-217；Plattner，D.et al.(1986)J.Natural Products.49，540-545；Ikekawa，N.et al.(1988)Chem.Pharm.Bull.36，405-407；Takatuto，S.et al.(1989b)Agric.Biol.Chem.53，2177-2180；Suzuki，Y.et al.(1986)Agric.Biol.Chem.50，3133-3138；Gamoh，K.et al.(1990)Anal.Chim.Acta.228，101-105)。高水平的油菜素類固醇似乎從花藥下移至較下方的器官，如第一節(jié)間部并誘使節(jié)間部伸長，第四節(jié)間部在花發(fā)育之前就已完成其伸長，在其活躍伸長時期不接受來自花的高水平油菜素類固醇信號。OsBRI1的油菜素類固醇水平和對油菜素類固醇的敏感性不能解釋在dm-型突變體中觀察到的第二節(jié)間部的特異性生長阻滯。因此，一些其它因素也必須參與?？瓷先サ诙?jié)間部的伸長似乎受幾個因素調(diào)節(jié)，因為存在幾個具有dm表型的矮小型突變體，包括d1，d2，d11和d61。
最近，有人分離出D1基因，發(fā)現(xiàn)它編碼與G蛋白的α亞單位(G-α)具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(Fujisawa，Y.et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96，7575-7580；Ashikari，M.et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96，10284-10289)。目前認為D1 G-α樣蛋白參與赤霉素(GA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，因為d1突變體等位基因?qū)钚訥A的敏感性低或無敏感性。有趣的是油菜素類固醇信號-相關(guān)蛋白OsBRI1的功能喪失突變體和GA信號-相關(guān)蛋白Gα的功能喪失突變體顯示出相同表型，即第二節(jié)間部的特異性生長阻滯。因此，在誘使第二節(jié)間部伸長時，第二節(jié)間部中可能存在油菜素類固醇和GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所共有的特定機制。
有趣的是，在節(jié)間部不伸長的營養(yǎng)階段的莖中也發(fā)現(xiàn)了高水平的OsBRI1表達，這說明稈中高水平的OsBRI1表達不必與節(jié)間部伸長相一致。
外源性油菜素內(nèi)酯和光照對OsBRI1 mRNA水平的影響本發(fā)明人還檢測了外源加入的油菜素內(nèi)酯和光照對OsBRI1 mRNA水平的影響。將萌發(fā)中的種子放在含或不含1μM油菜素內(nèi)酯的0.9％瓊脂平板上，在光照或黑暗中培養(yǎng)6天。
結(jié)果，在不含油菜素類固醇的平板上，黑暗中生長的幼苗中的OsBRI1表達水平高于光照下生長的幼苗(圖12D)。
這表明與在光照下生長的植物相比，黑暗中生長的水稻幼苗對油菜素類固醇的敏感性較高(Worley，J.F.and Mitchell，J.W.(1971)J.Amer.Soc.Hort.Sci.96，270-273)。在黑暗中生長的植物對油菜素類固醇的高敏感性可歸因于在光照下生長的植物的細胞對油菜素類固醇不反應(yīng)的情況下節(jié)間部細胞的伸長。
此外，在含有油菜素類固醇的平板上，在光照下和黑暗中生長的水稻幼苗都具有降低水平的OsBRI1表達。
與水稻形成對照的是，擬南芥在黑暗和光照下生長的幼苗中的BRI1表達水平改變很小(Li，J.and Chory，J.(1997)Cell.90，929-938)。引起水稻OsBRI1和擬南芥BRI1之間表達模式差異的原因仍是未知的。然而，差異可能與光反應(yīng)機制的差異有關(guān)，水稻是短日照植物，而擬南芥是長日照植物。
表達OsBRI1反義鏈的轉(zhuǎn)基因植物的表型分析上述d61突變體的表型分析和每個突變體中OsBRI1基因的單個核苷酸改變暗示著它們可能不是無效等位基因，可能保留了一些部分功能。為了進一步研究油菜素類固醇在水稻中的功能，本發(fā)明人嘗試通過在水稻Actin1基因啟動子(Zang，W.et al.(1991)Plant Cell.3，1155-1165)的控制之下過量表達OsBRI1轉(zhuǎn)錄物的反義鏈，以產(chǎn)生具有更嚴(yán)重表型的其它突變體。
為了構(gòu)建Actin1啟動子∷反義OsBRI1，通過用Act1啟動子(Zhang，W.etal.(1991)Plant Cell.3，1155-1165)取代潮霉素抗性雙元載體pBI35Snos(Sato，Y.et al.(1999)EMBO J.18，992-1002)中的35S啟動子，構(gòu)建含有Act1啟動子和NOS終止子的啟動子-終止子盒(pBIActlnos)，其中所述載體的HindIII和XbaI位點之間含有35S啟動子和NOS終止子。將編碼完整OsBRI1編碼區(qū)的cDNA克隆導(dǎo)入pBIActlnos的XbaI和SmaI位點之間。將不含插入物的載體pBI-cont用作對照載體。
為了降低OsBRI1表達，將OsBRI1-反義cDNA導(dǎo)入水稻品種Nipponbare。本發(fā)明人進行了水稻組織培養(yǎng)和根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
幾乎所有所得的轉(zhuǎn)基因植物(90％或更多，20個中的18個)在幼苗生長早期都產(chǎn)生了直立的葉(圖13D)。所有轉(zhuǎn)化體(20個中的20個)都顯示出不同程度的矮小表型(圖13A)。在具有最弱表型的植物中，每個節(jié)間部的長度部分和均一地降低，導(dǎo)致伸長模式類似于野生型植物的伸長模式(圖13C)(dn-型突變體)。具有中度表型的植物具有典型的dm-型(第二節(jié)間部特異性縮短，圖13C)或d6-型(第二至第四節(jié)間部特異性縮短，圖13C)突變體或混合dm-和d6-型表型(第二和第三節(jié)間部特異性縮短，圖13C)的節(jié)間部伸長模式。具有嚴(yán)重表型的植物僅形成異常的葉，所述葉不具備已長好的鞘器官，節(jié)間部并不伸長(圖13E)。甚至在培養(yǎng)1年或更長時間之后，這些類型的植物仍低于15-cm，而且不能產(chǎn)生種子(圖13B)。其它表型可遺傳至下一代，并與潮霉素抗性一起共分離。異常表型和潮霉素抗性之間的共分離，以及反義植物的中度表型與d61突變體的中度表型之間的相似性表明轉(zhuǎn)基因植物中的反義鏈能夠抑制OsBRI1的功能。
表達顯性失活OsBRI1的轉(zhuǎn)基因植物的表型產(chǎn)生含有OsBRI1基因的激酶區(qū)域的轉(zhuǎn)基因水稻，以分析水稻油菜素類固醇受體的功能，所述基因處于水稻肌動蛋白1基因啟動子(Zhang，W.et al.，(1991)Plant Cell，31155-1165)的控制之下。即按下述構(gòu)建質(zhì)粒，使得只有油菜素類固醇受體的羧基端激酶結(jié)構(gòu)域可被表達，而從第一位的甲硫氨酸至第738位甘氨酸的氨基末端區(qū)域不能被表達。本發(fā)明人使用了一對引物，即5’-GGCTCTAGACAGCCATGGCGAGCAAGCGG CGGAGGCTG-3’/SEQ IDNO4(5’-引物其包括TCTAGA作為XhoI位點，添加CAGCC以增加翻譯效率，以ATG作為起始密碼子，一個額外的編碼丙氨酸的GCG和編碼第739位絲氨酸的AGC，后面緊接著編碼野生型序列第740位殘基之后的氨基酸，即賴氨酸，精氨酸，精氨酸和亮氨酸的其它核苷酸)和5’-AGATCTACTCCTATAGGTA-3’/SEQ ID NO5(3’-引物其包括AGATCT作為XbaI位點，其后為3’-非翻譯區(qū))。使用這兩個引物擴增油菜素類固醇受體的激酶區(qū)域。然后用XbaI消化擴增的片段，插入pBI載體的XbaI-SmaI位點之間。將不含插入物的載體pBI-cont用作對照。
使用水稻品種Nipponbare產(chǎn)生表達激酶結(jié)構(gòu)域以控制OsBRI1表達的轉(zhuǎn)基因植物。進行水稻組織培養(yǎng)和根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
結(jié)果，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物(90％或更多，25/27個)在幼苗生長早期形成了直立的葉(圖14)。節(jié)間部之間的長度部分和等同縮短。通過與潮霉素抗性活性共-分離將表型遺傳至后代。異常表型和潮霉素抗性之間的共-分離以及顯性失活植物和d61突變體中度表型之間的相似性說明激酶部分的部分cDNA在轉(zhuǎn)基因植物中具有活性，并且能抑制OsBRI1功能。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供了具有增加水稻油菜素類固醇敏感性之功能的基因和蛋白質(zhì)。該基因參與植物節(jié)間部細胞的伸長和葉的傾斜。因此，通過控制此基因可產(chǎn)生表型被修飾的植物。例如，通過抑制本發(fā)明基因的表達，可產(chǎn)生能抗倒伏并能在單位面積中種植更多個體的矮小型植物，這對生產(chǎn)作物產(chǎn)物效果顯著。還可通過抑制本發(fā)明DNA的表達，使所述植物的高度或稈的長度矮化，產(chǎn)生具有新的美學(xué)價值的觀賞植物。另一方面，通過在植物中導(dǎo)入并表達本發(fā)明的DNA，可以增加植物的油菜素類固醇敏感性，導(dǎo)致植物高度增加，整個植物的產(chǎn)量提高。這對增加動物飼料用植物的產(chǎn)量尤其有用。
序列表<110> 獨立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所(National Institute of AgrobiologicalSciences)<120> 植物油菜素類固醇敏感性-相關(guān)基因及其用途<130> MOA-A0001P<140><141><150> JP 2000-101276<151> 2000-03-31<160> 5<170> PatentIn Ver.2.1<210> 1<211> 3710<212> DNA<213> 稻(Oryza sativa)<220><221> CDS<222> (1)..(3363)<400> 1atg gat tcc ttg tgg gca gcg ata gcg gca ctg ttt gtg gcg gcg gcg 48Met Asp Ser Leu Trp Ala Ala Ile Ala Ala Leu Phe Val Ala Ala Ala1 5 10 15gtg gtg gtg agg ggg gcg gcg gcg gcc gac gac gcc cag ctg ctc gag 96Val Val Val Arg Gly Ala Ala Ala Ala Asp Asp Ala Gln Leu Leu Glu20 25 30gag ttc agg cag gcg gtg ccg aac cag gcg gcg ctc aag ggg tgg agc 144Glu Phe Arg Gln Ala Val Pro Asn Gln Ala Ala Leu Lys Gly Trp Ser35 40 45ggc ggc gac ggc gcg tgc agg ttc ccg ggg gcc ggg tgc cgg aac ggg 192Gly Gly Asp Gly Ala Cys Arg Phe Pro Gly Ala Gly Cys Arg Asn Gly50 55 60agg ctc acg tcg ctg tcg ctc gcc ggc gtg ccg ctc aat gcc gag ttc 240Arg Leu Thr Ser Leu Ser Leu Ala Gly Val Pro Leu Asn Ala Glu Phe65 70 75 80cgc gcc gtc gcg gcc 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權(quán)利要求
1.DNA，其編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的DNA，其中所述DNA是cDNA或基因組DNA。
3.權(quán)利要求1的DNA，其中所述DNA含有SEQ ID NO1或3的核苷酸序列編碼區(qū)。
4.DNA，其編碼與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有55％或更高同源性，且與含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)功能等同的蛋白質(zhì)，所述DNA選自(a)DNA，其編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)中的一個或多個氨基酸被取代，缺失，添加和/或插入；和(b)在嚴(yán)緊條件下與含有SEQ ID NO1或3的核苷酸序列的DNA雜交的DNA。
5.權(quán)利要求4中的DNA，其中DNA編碼具有下述功能的蛋白質(zhì)，所述功能選自增加植物中油菜素類固醇敏感性的功能，誘使植物莖的節(jié)間部細胞伸長的功能，將微管定位于與植物莖節(jié)間部伸長的方向垂直的功能，抑制植物頸部的節(jié)間部伸長的功能，和增加植物葉片彎曲度的功能。
6.權(quán)利要求4或5中的DNA，其中DNA得自單子葉植物。
7.權(quán)利要求6中的DNA，其中DNA得自禾本科植物。
8.DNA，其編碼與權(quán)利要求1至7中任一項的DNA的轉(zhuǎn)錄物互補的反義RNA。
9.DNA，其編碼具有核酶活性的RNA，所述核酶可特異性裂解權(quán)利要求1至7中任一項的DNA的轉(zhuǎn)錄物。
10.DNA，其編碼當(dāng)在植物細胞中表達時，因共-抑制而能阻抑權(quán)利要求1至7中任一項的DNA表達的RNA，所述DNA與權(quán)利要求1至7中任一項的DNA具有90％或更高的同源性。
11.DNA，其編碼相對于權(quán)利要求1至7中任一項的DNA所編碼的蛋白質(zhì)而言具有顯性失活表型的蛋白質(zhì)。
12.含有權(quán)利要求1至7中任一項的DNA的載體。
13.轉(zhuǎn)化細胞，其含有權(quán)利要求1至7中任一項的DNA或權(quán)利要求12中的載體。
14.由權(quán)利要求1至7中任一項的DNA編碼的蛋白質(zhì)。
15.生產(chǎn)權(quán)利要求14中的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求13中的轉(zhuǎn)化細胞，從轉(zhuǎn)化細胞或其培養(yǎng)物上清液中回收表達的蛋白質(zhì)的步驟。
16.含有權(quán)利要求8至11中任一項的DNA的載體。
17.轉(zhuǎn)化的植物細胞，其含有權(quán)利要求1至11中任一項的DNA或權(quán)利要求12或16中的載體。
18.含有權(quán)利要求17中的轉(zhuǎn)化植物細胞的轉(zhuǎn)化植物。
19.轉(zhuǎn)化植物，其為權(quán)利要求18中的轉(zhuǎn)化植物的子代或克隆。
20.權(quán)利要求18或19中的轉(zhuǎn)基因植物的繁殖材料。
21.與權(quán)利要求14中的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。
全文摘要
本發(fā)明人成功生產(chǎn)出水稻矮小型突變體d61，并分離出對應(yīng)于d61基因座中的區(qū)域的OsBRI1基因。發(fā)現(xiàn)OsBRI1可增加植物的油菜素類固醇敏感性。另外，本發(fā)明人還證明了OsBRI1在水稻生長和發(fā)育過程中的功能，例如，通過誘使節(jié)間部細胞伸長導(dǎo)致節(jié)間部伸長，以及使葉片接合處傾斜。通過導(dǎo)入反義核苷酸或顯性失活的OsBRI1，本發(fā)明人生產(chǎn)出表型被修飾的轉(zhuǎn)基因水稻植物。
文檔編號C12N15/29GK1430671SQ01809828
公開日2003年7月16日 申請日期2001年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月31日
發(fā)明者田中宥司, 萱野曉明, 松岡信 申請人:獨立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所