含有抗病原菌特異抗體(IgY)的雞蛋及含有該IgY的酸乳和冰淇淋的生產(chǎn)方法

專利名稱：含有抗病原菌特異抗體(IgY)的雞蛋及含有該IgY的酸乳和冰淇淋的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了通過同時(shí)采用引起腸炎的大腸桿菌、引起胃炎的幽門螺桿菌和引起食物中毒的腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的抗原蛋白免疫雛雞以產(chǎn)生含有抗病原菌的特定抗體(IgY)的雞蛋防止胃炎、腹瀉和食物中毒的方法，還提供了以適當(dāng)比例混合如上所述的特異抗體的蛋白粉的組合物，該組合物是用四種抗原單獨(dú)免疫產(chǎn)生的，以及提供用牛奶加工的食物，如酸乳和冰淇淋，其中含有抗病原菌的特異抗體(IgY)。
另外，對于分離特異抗體蛋白粉的方法，分離蛋白和磷脂的方法尤其用蒸餾水以1∶1比例稀釋蛋黃，加入適當(dāng)量的硫酸銨，其使水溶性蛋白和磷脂分離，以及分離蛋黃和水溶性蛋白的方法用蒸餾水稀釋分離溶液，在一定溫度下放置，從而沉淀和純化蛋白。
背景技術(shù)：
根據(jù)有關(guān)腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的報(bào)道，一種腸致病性大腸桿菌寄居在人或動(dòng)物的腸道中，引起腹瀉和腹痛，它在成人和兒童中都是腸炎病原體。迄今，報(bào)道有5種腹瀉病原體；即腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸侵染性大腸桿菌(EIEC)、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)和腸粘附性大腸桿菌(EAEC)。Adam在1923年從兒童腹瀉病人中分離出大腸桿菌并且報(bào)道了它們是導(dǎo)致腸炎的病原體。在上世紀(jì)40年代中期，由大腸桿菌導(dǎo)致的腹瀉在英格蘭的托兒所經(jīng)常成批發(fā)生。由于Neter第一次將它們命名為腸病原性大腸桿菌，后來人們就將該組大腸桿菌稱為病原性大腸桿菌。
涉及大腸桿菌專利的現(xiàn)有技術(shù)概括如下。
Kim jungwoo等(1999)提交了專利，其目的是提供利用豬中產(chǎn)生的ETEC K88菌株，從蛋黃免疫球蛋白(IgY)中產(chǎn)生蛋黃抗體并有效分離的方法。同樣，Kim jungwoo等(1999)又提交了專利，其目的是提供利用豬中產(chǎn)生的ETEC K99菌株和K88菌株從蛋黃免疫球蛋白(IgY)中生產(chǎn)蛋黃抗體并有效分離的方法。另外，Kim jungwoo等(1999)提交了專利，其目的是利用豬中產(chǎn)生的ETEC987p菌株和K88菌株，從蛋黃免疫球蛋白(IgY)中產(chǎn)產(chǎn)蛋黃抗體并有效分離的方法。GodamaYoshikashi(1998)提交了專利，其利用從腸出血性大腸桿菌(EHEC)的全部和vero細(xì)胞毒素免疫的母雞中得到的蛋黃抗體(IgY)，預(yù)防和治療腸出血性大腸桿菌(EHEC)感染。另外，一些專利已經(jīng)概括如下，其涉及到預(yù)防幽門螺桿菌感染引起十二指腸炎的藥物。
利用抗原-抗體的反應(yīng)治療胃炎和十二指腸炎的工作仍在繼續(xù)，Coler等分離了免疫球蛋白治療來自哺乳動(dòng)物乳汁的幽門螺桿菌引起的胃炎和腸炎(1992)。Taiyo gakakusha通過用抗原化幽門螺桿菌抗原化和免疫產(chǎn)蛋的母雞來分離特定的抗體。利用的抗原是幽門螺桿菌菌株ATCC 43504、43506、43579和43629。近來，在動(dòng)物和哺乳動(dòng)物中常見的感染性疾病，如腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和腸致病性大腸桿菌正日益產(chǎn)生巨大的社會(huì)問題。發(fā)生頻率最高的是食物中毒，即可歸于細(xì)菌的食物中毒。引起食物中毒的主要病原體是沙門氏菌、霍亂弧菌或葡萄球菌，在人中，對腸細(xì)菌引起的食物中毒，沙門氏菌的發(fā)生頻率最高。因?yàn)樯抽T氏菌引起的食物中毒病人是總數(shù)的37.7％。沙門氏菌是食物中毒的主要原因，霍亂引起的食物中毒在夏天發(fā)生，而沙門氏菌引起的食物中毒常年都有報(bào)道。所以控制非常重要?？蓺w于沙門氏菌的食物中毒除了北美以外連續(xù)發(fā)生在南美和歐洲。而且病原體的發(fā)生和存在的比例在增高，這是因?yàn)榕５募w運(yùn)輸、環(huán)境污染和集體用餐如學(xué)校的自助食堂的情況多了起來。完全消除沙門氏菌是不可能的，因?yàn)樯抽T氏菌有2400種血清型，除了雞白痢沙門氏菌(Salmonella pullorum，Salmonella gallmarum)，都能在任何條件下感染一個(gè)以上的動(dòng)物，而沒有寄主限制。腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌已報(bào)道是食物中毒的主要原因(KFDA，the journal of epidermicoccurrence information，Kim，Hohoon(1997))。通常，感染的主要過程是在雞蛋外面感染上，但雞蛋里面感染可以是沙門氏菌的感染過程。特別對于腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌，有報(bào)道說，在雞蛋的感染中，感染是從卵巢轉(zhuǎn)移到蛋黃的，這樣可以看出雞蛋內(nèi)感染的重要性。所以，雞蛋感染的預(yù)防可能是阻止傳染過程預(yù)防可歸于沙門氏菌食物中毒的關(guān)鍵。
作為涉及沙門氏菌的現(xiàn)有技術(shù)，Song Kyungbin(2000)提交的專利是關(guān)于麥芽糖結(jié)合蛋白與腸炎沙門氏菌的ATFA亞基的融合蛋白在大腸桿菌的表達(dá)。本發(fā)明目的是用于制造診斷試劑盒，并開發(fā)針對雞的主要疾病沙門氏菌感染的疫苗。正如上文提到，各種方法如利用抗生素和天然資源已試圖用于阻止螺桿菌和沙門氏菌的生長，但藥效評估還沒有定論。正如食物中毒的問題每年都在上升，生產(chǎn)含有針對沙門氏菌的抗體和其他抗體可能是更有效的和根本的預(yù)防方法。通常，生產(chǎn)針對一些病原體的抗體和利用抗體進(jìn)行治療已知是最理想的治療方法。生產(chǎn)和分離每個(gè)病原體的特定抗體仍然有待在工業(yè)規(guī)模中解決。
作為涉及其他發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)，有一些發(fā)明涉及從含有一種特異免疫蛋白IgY的蛋黃中分離蛋白和磷脂的方法。蛋白占整個(gè)蛋黃的15-17％，含有主要種類α、β和γ-卵黃蛋白。IgG類的γ-卵黃蛋白是卵黃中存在的特異免疫蛋白(Poson等，1980)，通常已知是IgY。IgY是可以口服的特異免疫蛋白(McBee等，1979)。對于IgY的分離，第一步是除去蛋黃中的脂和脂蛋白。
對于除去脂和脂蛋白的方法，有通過超離心分離脂蛋白的方法(Bade，1984)、利用有機(jī)溶劑除去脂的方法(Polson等，1980)以及利用聚乙二醇(PEG)和葡聚糖硫酸鈉(SDS)(Hachida，1993)沉淀脂蛋白的方法。尤其是利用天然多糖“角叉藻聚糖”的方法，其已廣泛用作食物的增稠穩(wěn)定劑，并且強(qiáng)烈地激活雞蛋黃脂蛋白的凝結(jié)(Hansen等，1998)。
上述的現(xiàn)有技術(shù)盡管已經(jīng)用于分離來自蛋黃的水溶性蛋白和脂，但在工業(yè)規(guī)模上純化和分離大量產(chǎn)物有低效和高成本的限制。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明目的提供了生產(chǎn)含有抗致病菌特異抗體(IgY)的雞蛋的方法，即同時(shí)含有抗大腸桿菌IgY、抗幽門螺桿菌IgY、抗腸炎沙門氏菌IgY和鼠傷寒沙門氏菌IgY，并且提供用奶加工的食物，如酸乳和冰淇淋，其中含有抗病原菌特異抗體(IgY)的混合物。
另外，對于從蛋黃分離水溶性蛋白的方法，本發(fā)明允許利用非毒性硫酸銨和蒸餾水大規(guī)模地分離和純化，而不需要超離心和沉淀，這和現(xiàn)有技術(shù)有所不同。
為了實(shí)現(xiàn)上述的技術(shù)主題，本發(fā)明涉及(1)含有抗致病菌特異抗體(IgY)的雞蛋的生產(chǎn)方法，所述IgY包含抗大腸桿菌IgY、抗幽門螺桿菌IgY、抗腸炎沙門氏菌IgY和抗鼠傷寒沙門氏菌IgY，所述生產(chǎn)方法是注射1ml的經(jīng)氫氧化鋁以一定比例乳化的混合抗原蛋白首次免疫雛雞，所述混合抗原蛋白由大腸桿菌、幽門螺桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌組成；然后每次注射1ml的經(jīng)乳化佐劑ISA25乳化的各混合抗原蛋白繼續(xù)免疫雛雞兩次，兩次之間間隔一周；再每次用0.5ml經(jīng)乳化佐劑ISA25以相同比例乳化的混合抗原蛋白免疫已成熟的產(chǎn)蛋母雞兩次，兩次免疫間隔3個(gè)月?？偣裁庖?次。
詳細(xì)地說，含有抗混合致病菌特異抗體(IgY)的雞蛋的生產(chǎn)方法包括如下步驟給雛雞施用1ml的大腸桿菌、幽門螺桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的混合抗原蛋白，所述混合抗原蛋白以一定比例與氫氧化鋁乳化，其中含有大腸桿菌4.0×108/ml的滅活抗原0.15ml、腸炎沙門氏菌4.0×108/ml的滅活抗原0.10ml、鼠傷寒沙門氏菌4.0×108/ml的滅活抗原0.10ml和幽門螺桿菌4.0×108/ml的滅活抗原0.35ml，用0.3ml氫氧化鋁乳化。大腸桿菌∶腸炎沙門氏菌∶鼠傷寒沙門氏菌∶幽門螺桿菌∶乳化佐劑＝1.5∶1∶1∶3.5∶3；對第二次和第三次注射，施用1ml經(jīng)乳化佐劑ISA25以比例1∶1稀釋的混合抗原蛋白兩次，兩次免疫間隔一周；再每次用0.5ml的乳化混合抗原蛋白免疫已成熟的產(chǎn)蛋母雞兩次，兩次免疫間隔3個(gè)月，所述乳化混合抗原蛋白含有大腸桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.15ml、腸炎沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.10ml、鼠傷寒沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.10ml和幽門螺桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.35ml，并以相同比例用0.3ml氫氧化鋁乳化。總共免疫5次。
(2)含有抗混合致病菌特異抗體(IgY)的雞蛋的另一生產(chǎn)方法，其施用1ml的經(jīng)完全弗氏佐劑以一定比例乳化的混合抗原蛋白首次免疫雛雞，所述混合抗原蛋白由大腸桿菌、幽門螺桿菌、腸炎沙門氏菌和大鼠傷寒沙門氏菌組成；然后每次用1ml的經(jīng)不完全弗氏佐劑乳化的混合抗原蛋白兩次，兩次免疫間隔兩周；每次用0.5ml以相同比例乳化的混合抗原蛋白再免疫已成熟的產(chǎn)蛋母雞兩次，兩次免疫間隔3個(gè)月。總共免疫5次。
(3)含有抗病原菌特異抗體(IgY)的雞蛋的另一生產(chǎn)方法的不同點(diǎn)在于只用大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌免疫，而不是四種病原體，所采用的雞蛋生產(chǎn)方法與(1)和(2)相同。
(4)另一發(fā)明涉及特異免疫蛋白的分離方法包括下列步驟收集從同時(shí)含有抗病原菌特異抗體(IgY)的雞蛋中分離的35g蛋黃，放入250ml的瓶中，與35ml堿離子水(pH9)混合，5-10C放置24小時(shí)，加入18倍體積的堿離子水(pH10)(1260ml)，放置48小時(shí)，分離含有水溶性特異免疫蛋白的上清液，用超濾系統(tǒng)濃縮上清液，并冷凍干燥濃縮的上清液。
另一分離特異免疫蛋白的方法包括下列步驟用蒸餾水以一定比例稀釋從含有混合抗病原菌特異抗體(IgY)的雞蛋中分離的蛋黃，在蒸餾水和蛋黃的的稀釋液中加入硫酸銨，以分離水溶性特異免疫蛋白和磷脂，放置一段時(shí)間，在除去除上層脂后，稀釋收集的上清液，放置一段時(shí)間，然后分離/純化特異免疫蛋白，更優(yōu)選地，其中蛋黃和蒸餾水的稀釋比例是1∶1，或其中加入的硫酸銨量是3～10％，優(yōu)選5～6％。
(5)另一發(fā)明涉及抗病原體特異免疫蛋白粉的混合組合物，其制備方法是將從分別含有特異免疫蛋白的雞蛋中分離出的各個(gè)水溶性特異免疫蛋白(粗IgY)(大腸桿菌∶腸炎沙門氏菌∶鼠沙門氏菌∶幽門螺桿菌)混合。含有特異免疫蛋白的雞蛋的生產(chǎn)方法如下首次用1ml(108/ml)大腸桿菌、幽門螺桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的各個(gè)抗原蛋白，所述抗原蛋白分別與乳化佐劑以1∶1比例乳化；然后每次用1ml經(jīng)完全弗氏佐劑乳化的各抗原蛋白再免疫兩次，兩次免疫間隔兩周，這些乳化的各抗原蛋白含有大腸桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和完全弗氏佐劑0.5ml，腸炎沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和完全弗氏佐劑0.5ml，鼠傷寒沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和0.5ml完全弗氏佐劑，幽門螺桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和完全弗氏佐劑0.5ml，相應(yīng)的比例都是1∶1；每次用0.5ml的各乳化抗原蛋白免疫已成熟的產(chǎn)蛋母雞兩次，兩次免疫間隔3個(gè)月，所述抗原蛋白含有大腸桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和不完全弗氏佐劑0.5ml，腸炎沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和不完全弗氏佐劑0.5ml，鼠傷寒沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和不完全弗氏佐劑0.5ml，和幽門螺桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和不完全弗氏佐劑0.5ml，相應(yīng)比例都是1∶1。總共免疫5次。
另一發(fā)明涉及抗病原體特異免疫蛋白粉的混合組合物，其生產(chǎn)方法是將從分別含有特異免疫蛋白的雞蛋中分離的各個(gè)水溶性特異免疫蛋白(粗IgY)(大腸桿菌∶腸炎沙門氏菌∶鼠傷寒沙門氏菌∶幽門螺桿菌)混合。含有特異免疫蛋白的雞蛋的生產(chǎn)方法如下首次用1ml(108/ml)大腸桿菌、幽門螺桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的各抗原蛋白免疫不同雛雞，所述各抗原蛋白分別用乳化佐劑以1∶1比例乳化；然后再每次用1ml經(jīng)乳化佐劑ISA25乳化的各抗原蛋白繼續(xù)免疫兩次，兩次免疫間隔兩周，這些抗原蛋白包含大腸桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和乳化佐劑ISA25 0.5ml，腸炎沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和乳化佐劑ISA25 0.5ml，鼠傷寒沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和乳化佐劑ISA25 0.5ml，幽門螺桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和乳化佐劑ISA25 0.5ml，相應(yīng)比例都是1∶1；每次用0.5ml各種乳化抗原蛋白免疫已成熟的產(chǎn)蛋母雞兩次，兩次免疫間隔3個(gè)月，其含有大腸桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和乳化佐劑ISA25 0.5ml，腸炎沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和乳化佐劑ISA25 0.5ml，鼠傷寒沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和乳化佐劑ISA250.5ml，和幽門螺桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和乳化佐劑ISA250.5ml，相應(yīng)比例都為1∶1?？偣裁庖?次。
(6)另一方法涉及用牛奶加工的食物的生產(chǎn)，如酸乳、冰淇淋和食物添加劑，其同時(shí)含有由(1)、(2)、(3)和(4)中所述方法生產(chǎn)的抗病原菌特異抗體(IgY)以及含有(5)中所述的抗病原體特異免疫蛋白粉的混合組合物。
按照上面所述的方法，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是用奶加工的食物，如酸乳、冰淇淋和食物添加劑，其含有抗病原菌特異抗體(IgY)，通過攝食能有效地預(yù)防胃炎和腸炎。同樣，利用含有抗沙門氏菌IgY的雞蛋，可將滅菌減到最少，沙門氏菌的二次感染也可以預(yù)防。甚至在部分發(fā)生污染時(shí)，抗沙門氏菌IgY將能夠緩解食物中毒的問題。
對于另一發(fā)明有關(guān)特異免疫蛋白的分離方法的效果，IgY的效價(jià)的損失可降到最少，在大量生產(chǎn)中只需要小量的硫酸銨，這比現(xiàn)有技術(shù)利用有機(jī)溶劑和沉淀劑分離脂和水溶性蛋白更具優(yōu)勢。用蒸餾水稀釋并在4℃放置過夜后獲得97％的回收率，可以完全除去蛋黃的顏色，并且不需要利用超速離心而完全分離，這樣可以降低成本，本發(fā)明使之成為可能。
下文中，通過工作實(shí)施例、附圖和表格可以更詳細(xì)地?cái)⑹霰景l(fā)明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。
附圖的簡要說明

圖1a是在用含有大腸桿菌、幽門螺桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的混合物免疫后，抗幽門螺桿菌的特異IgY的效價(jià)的變化。
圖1b是在用含有大腸桿菌、幽門螺桿菌、腸炎沙門氏菌和大鼠傷寒沙門氏菌的混合物免疫后，抗沙門氏菌特異IgY的效價(jià)的變化。
圖1c是在用含有大腸桿菌、幽門螺桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的混合物免疫后，抗幽門螺桿菌特異IgY的平均效價(jià)。
圖1d是在用含有大腸桿菌、幽門螺桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的混合物免疫后，抗沙門氏菌特異IgY的平均效價(jià)。
圖1e是用含有大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的混合物免疫后，抗幽門螺桿菌特異IgY的效價(jià)的變化。
圖1f是用含有大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的混合物免疫后，抗大腸桿菌特異IgY的效價(jià)的變化。
圖1g是用含有大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的混合物免疫后，抗沙門氏菌特異IgY的平均效價(jià)。
圖1h是在用含有大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的混合物免疫后，抗大腸桿菌特異IgY的平均效價(jià)。
圖2a是從蛋黃中分離和純化水溶性性特異免疫蛋白的方法的圖解。
圖2b表示經(jīng)過硫酸銨處理蛋黃的水溶性特異免疫蛋白和脂蛋白的分離。
圖2c是硫酸銨處理后水溶性特異免疫蛋白IgY的效價(jià)的變化。
圖2d是按照稀釋系數(shù)稀釋的水溶性特異免疫蛋白IgY的效價(jià)變化。
圖2e是在勻漿后，按照稀釋系數(shù)稀釋的水溶性特異免疫蛋白IgY的效價(jià)的變化。
圖2f是通過濃縮和透析，水溶性特異免疫蛋白IgY的效價(jià)的變化。
圖2g是在產(chǎn)產(chǎn)蛋黃醬后，水溶性特異免疫蛋白IgY的效價(jià)的變化。
圖2h是在純化后利用PAGE分析的水溶性特異免疫蛋白IgY的純度。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式實(shí)施例11.分離腸致病性大腸桿菌和生產(chǎn)抗原a.分離和鑒定人的腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)用于本發(fā)明的病原性大腸桿菌是從人中分離的。用作抗原的腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)是從兒童的腹瀉物中分離的。大腸桿菌的分離過程如下。將兒童的腹瀉物在血清瓊脂平板上劃線。在37℃溫育18小時(shí)后，選擇表現(xiàn)出α-溶血的腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的菌落。在MacConkey瓊脂中選擇的菌落生長成粉紅色菌落，并且在EMB瓊脂中它生長成金屬綠色菌落，這是大腸桿菌的特征。b.檢測腸毒素生產(chǎn)能力通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測大腸桿菌的腸毒素生產(chǎn)能力。將特異于熱穩(wěn)定毒素(ST)的STa1基因和熱標(biāo)記毒素(LT)的LTh基因的引物用于多重PCR擴(kuò)增。
ST毒素的引物是有義引物CCCCTCTTTTAGTCAGTC反義引物CCAGCACAGGCAGGATTACA這些引物設(shè)計(jì)生成165bp的產(chǎn)物。
LT毒素的引物是有義引物CAGACTATCAGTCAGAGGTTG反義引物TTCATACTGATTGCCGCA這些引物設(shè)計(jì)生產(chǎn)417bp產(chǎn)物。
PCR條件如下預(yù)變性95℃，5分鐘，變性94℃1分鐘，退火56℃1分鐘，延伸72℃1分鐘，循環(huán)結(jié)束后再延伸72℃10分鐘。在2％的瓊脂凝膠上電泳檢測PCR產(chǎn)物。檢測了用于本發(fā)明分離的大腸桿菌生產(chǎn)毒素的情況，該大腸桿菌菌株命名為EB-E01。c.腸產(chǎn)毒素大腸桿菌(ETEC)抗原的生產(chǎn)在胰胨豆胨瓊脂上接種腸產(chǎn)毒素大腸桿菌(ETEC)，37℃培養(yǎng)箱中溫育18小時(shí)。選擇一個(gè)菌落，接種到5ml的胰胨豆胨培養(yǎng)液中，生長2小時(shí)。將培養(yǎng)物接種到大量的胰胨豆胨培養(yǎng)液中，在37℃不振搖溫育48小時(shí)。按總體積的6％在培養(yǎng)物中加入甲醛，并且在室溫下永生24小時(shí)。在4000rpm下離心永生的培養(yǎng)物20分鐘。用磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.2)洗滌回收的沉淀物3次。在PBS中懸浮回收的培養(yǎng)物，達(dá)到410nm處O.D.(Oculus Dexter)為1.2～1.3，備用。2.生產(chǎn)幽門螺桿菌抗原a)幽門螺桿菌從美國典型培養(yǎng)物保藏中心取得幽門螺桿菌(ATCC43504)。在胰胨豆胨瓊脂上培養(yǎng)該測試培養(yǎng)物；用含有10％羊血清的BBL進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每3到5星期傳代一次，在10％CO2的培養(yǎng)箱中于37℃下進(jìn)行溫育培養(yǎng)。通過顯微鏡方法和脲酶活性試驗(yàn)檢測測試培養(yǎng)物。b)檢測脲酶活性利用含有脲和酚紅的脲酶實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液進(jìn)行脲酶活性的檢測。通過在410nm處檢測脲培養(yǎng)液的混合物，培養(yǎng)基的O.D.和540nm處實(shí)驗(yàn)處理物的O.D.可以確定脲酶的活性。c)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)試驗(yàn)裸眼觀察培養(yǎng)3-5天的細(xì)菌的形態(tài)變化，在載玻片上將菌落劃線，用革蘭氏染色，并且在顯微鏡下(×1000)測定細(xì)菌的形態(tài)是否保持了曲線形態(tài)或者變化成球形。d)生產(chǎn)幽門螺桿菌抗原用細(xì)胞收集器回收培養(yǎng)的幽門螺桿菌，懸浮在鹽水中，通過在60℃的水浴加熱30分鐘永生化。在10,000×g離心15分鐘，回收培養(yǎng)物，懸浮和離心步驟重復(fù)3次以除去培養(yǎng)基。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)永生化細(xì)菌的數(shù)目。3.生產(chǎn)腸炎沙門氏菌抗原和鼠傷寒沙門氏菌抗原從韓國微生物保藏中心取得腸炎沙門氏菌No.12021(KCCM12021)，以及從韓國微生物保藏中心得到鼠傷寒沙門氏菌No.11863(KCCM 11863)。
在胰胨豆胨瓊脂上接種腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌，在37℃的培養(yǎng)箱中溫育18小時(shí)。選擇一個(gè)菌落，接種到大量的胰胨豆胨培養(yǎng)液中，在37℃不振搖溫育48小時(shí)。在培養(yǎng)基中加入甲醛，其量為總體積的0.2％，在室溫下永生化24小時(shí)。將永生化培養(yǎng)物在4000rpm離心20分鐘。用鹽水(pH7.2)洗滌回收的沉淀物3次。將收集的培養(yǎng)物儲(chǔ)藏在-70℃，待用。4.通過在雛雞中注射混合的4種抗原并且在產(chǎn)蛋的母雞中加強(qiáng)注射
a)在1兩周齡的雛雞中注射細(xì)菌，數(shù)目是108/ml。其中的比例為大腸桿菌∶腸炎沙門氏菌∶鼠傷寒沙門氏菌∶幽門螺桿菌∶乳化佐劑＝1.5∶1∶1∶3.5∶3。詳細(xì)地說，第一次注射采用混合抗原蛋白進(jìn)行，其含有大腸桿菌4.0×108/ml的滅活抗原0.15ml、腸炎沙門氏菌4.0×108/ml的滅活抗原0.10ml、鼠傷寒沙門氏菌4.0×108/ml的滅活抗原0.10ml，和幽門螺桿菌4.0×108/ml的滅活抗原0.35ml，用0.3ml的氫氧化鋁乳化。作為加強(qiáng)注射的第二次注射，混合抗原采用乳化佐劑ISA25乳化。對雛雞進(jìn)行兩次注射，兩次之間間隔兩周，每次1ml。用0.5ml的各個(gè)乳化混合抗原注射28周齡的產(chǎn)蛋母雞兩次，兩次之間間隔為3個(gè)月?？偣裁庖?次。
b)當(dāng)利用的乳化佐劑是ISA25時(shí)，在用含有2個(gè)以上的抗原的抗原混合物免疫的組中，抗沙門氏特異IgY和抗幽門螺桿菌特異IgY的平均效價(jià)比只用一個(gè)抗原免疫的對照組明顯地高(圖1a，1b，1c，1d)。
c)在12周齡的雛雞中注射的細(xì)菌數(shù)目是108/ml。其中的比例為大腸桿菌∶腸炎沙門氏菌∶鼠傷寒沙門氏菌∶幽門螺桿菌∶乳化佐劑＝1.5∶1∶1∶3.5∶3。詳細(xì)地說，第一次注射采用混合抗原蛋白，其含有大腸桿菌4.0×108/ml的滅活抗原0.15ml、腸炎沙門氏菌4.0×108/ml的滅活抗原0.10ml、鼠傷寒沙門氏菌4.0×108/ml的滅活抗原0.10ml和幽門螺桿菌4.0×108/ml的滅活抗原0.35ml，用0.3ml的完全弗氏佐劑乳化。作為加強(qiáng)注射的第二次注射，混合抗原采用不完全弗氏佐劑乳化。對雛雞進(jìn)行兩次注射，兩次之間間隔兩周，每次1ml。用0.5ml的各個(gè)乳化混合抗原注射28周齡產(chǎn)蛋母雞兩次，兩次之間間隔為3個(gè)月，總共免疫5次。結(jié)果是，從用乳化抗原的混合物免疫的母雞中產(chǎn)生了同時(shí)含有抗大腸桿菌IgY、抗幽門螺桿菌IgY、抗腸炎沙門氏菌IgY和抗鼠沙門氏菌IgY的雞蛋。5.通過給雛雞注射混合的3種抗原并在產(chǎn)蛋的母雞中加強(qiáng)注射進(jìn)行免疫給12周齡雛雞注射的抗原和乳化劑的比例是大腸桿菌∶腸炎沙門氏菌∶鼠傷寒沙門氏菌∶乳化劑＝3.5∶1.8∶1.7∶3。詳細(xì)地說，第一次注射采用1ml乳化混合抗原，其含有大腸桿菌4.0×108/ml的滅活抗原0.35ml、腸炎沙門氏菌4.0×108/ml的滅活抗原0.18ml和鼠傷寒沙門氏菌4.0×108/ml的滅活抗原0.17ml，用0.3ml氫氧化鋁乳化。對作為加強(qiáng)注射的第二次，混合抗原采用乳化佐劑ISA25乳化。對雛雞中進(jìn)行兩次注射，兩次之間間隔兩周，每次用1ml同樣比例的抗原混合物。然后，每次用0.5ml的各個(gè)乳化混合抗原蛋白注射已成熟的產(chǎn)蛋母雞兩次，兩次之間間隔3個(gè)月，所述乳化混合抗原含有大腸桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.35ml、腸炎沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.18ml，鼠傷寒沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.17ml，用0.3ml的乳化佐劑ISA25乳化。總共注射5次。結(jié)果是從用乳化的抗原混合物免疫的產(chǎn)蛋母雞中生產(chǎn)了同時(shí)含有抗大腸桿菌IgY、抗腸炎沙門氏菌IgY和抗鼠傷寒沙門氏菌IgY的雞蛋。
作為本發(fā)明的另一特征，給雛雞第一次注射是用1ml混合抗原蛋白在一個(gè)雞腿上進(jìn)行的，所述混合抗原蛋白含有大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌，用一定比例的完全弗氏佐劑乳化。對于作為加強(qiáng)注射的第二次，利用了與不完全弗氏佐劑乳化的混合抗原。對雛雞進(jìn)行兩次注射，兩次之間間隔兩周，每次1ml相同比例的抗原混合物。然后，用0.5ml各個(gè)的乳化混合抗原蛋白注射已成熟產(chǎn)蛋母雞兩次，兩次之間間隔為3個(gè)月?？偣沧⑸?次。結(jié)果是產(chǎn)生了同時(shí)含有抗大腸桿菌IgY、抗腸炎沙門氏菌IgY和抗鼠傷寒沙門氏菌IgY的雞蛋。
詳細(xì)地說抗原混合物的比例是大腸桿菌∶腸炎沙門氏菌∶鼠傷寒沙門氏菌∶完全弗氏佐劑＝3.5∶1.8∶1.7∶3。第一次注射采用混合抗原蛋白，其含有大腸桿菌4.0×108/ml的滅活抗原0.35ml、腸炎沙門氏菌4.0×108/ml的滅活抗原0.18ml，和鼠傷寒沙門氏菌4.0×108/ml的滅活抗原0.17ml，用完全弗氏佐劑0.3ml乳化。對作為加強(qiáng)注射的第二次，利用與不完全弗氏佐劑乳化的混合抗原。給雛雞1ml注射兩次，兩次之間間隔兩周。然后，在產(chǎn)蛋母雞的腿上注射0.5ml乳化混合抗原蛋白兩次，兩次之間間隔3個(gè)月，其含有大腸桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.35ml、腸炎沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.18ml和鼠傷寒沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.17ml，用完全弗氏佐劑0.3ml乳化?？偣沧⑸?次。然后，生產(chǎn)了同時(shí)含有抗大腸桿菌IgY，抗腸炎沙門氏菌IgY和抗鼠傷寒沙門氏菌IgY的雞蛋。
本發(fā)明的另一特征是水溶性抗菌特異免疫蛋白和含有抗混合細(xì)菌特異抗體(IgY)的特異免疫蛋白的生產(chǎn)方法，步驟如下。在某容器中加入如上生產(chǎn)的20g同時(shí)含有抗大腸桿菌IgY、抗腸炎沙門氏菌IgY和抗鼠傷寒沙門氏菌IgY的蛋黃，和同樣量的堿離子水(pH9)(20ml)攪拌并且在5～10℃放置24小時(shí)。加入18倍體積(720ml)的堿離子水(pH10)，放置48小時(shí)，分離水溶性蛋白。通過中空纖維柱方法在超濾系統(tǒng)中濃縮上清液，并且凍干。6.分離蛋黃、分離蛋黃粉末、分離免疫蛋白和檢測效價(jià)。a)分離蛋黃將根據(jù)上述方法生產(chǎn)的雞蛋黃分離出來，并收集在燒瓶或瓶中。b)分離蛋黃粉通過離心并且凍干分離的蛋黃產(chǎn)產(chǎn)蛋黃粉。c)分離免疫蛋白和測量效價(jià)分離免疫蛋白的方法如下，采用常用方法進(jìn)行效價(jià)的測量。
在250ml的瓶中收集35g沒有膜的蛋黃，攪拌加入35ml的堿離子水(pH9)。在5～10℃放置24小時(shí)后，加入堿離子水(pH10)，其量為18倍體積(1260ml)的蛋黃上清液和堿離子水(1∶1)，放置48小時(shí)分離。利用中空纖維柱方法，在超濾系統(tǒng)中濃縮上清液，并凍干。
如下測量上述過濾產(chǎn)生的水溶性蛋白中的特異抗體的含量。用三明治ELISA方法進(jìn)行特異抗體的含量測量。用緩沖溶液稀釋幽門螺桿菌，直到660nm處的O.D.為0.05。將稀釋的病原體包被到微量培養(yǎng)板，放置過夜。洗滌微量培養(yǎng)板，和過濾的水溶性蛋白溫育，再次洗滌，用1/10,000稀釋的兔抗雞IgG Ab-HRP溫育。將TMB用作HRP的底物，利用2N H2SO4終止反應(yīng)。測量在450nm處的吸光值(圖2a，2b，2c，2d)。7.生產(chǎn)含有四種抗體的酸乳a)提取水溶性的特異免疫蛋白如下進(jìn)行水溶性特異免疫蛋白的提取在250ml的瓶中收集35g無膜的蛋黃，并且攪拌加入35ml的堿離子水(pH9)。在5～10℃放置24小時(shí)后，加入堿離子水(pH10)，其量為18倍體積(1260ml)的蛋黃上清液和堿離子水，放置48小時(shí)分離。利用中空纖維柱方法，在超濾系統(tǒng)中濃縮上清液，并冷干。a)生產(chǎn)含有新鮮蛋黃的酸乳用幽門螺桿菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的抗原蛋白的混合抗原免疫生產(chǎn)的蛋黃生產(chǎn)酸乳(表3，4)。酸乳生產(chǎn)中的滅菌是嚴(yán)重問題。將銷售限制于短的時(shí)期中，因?yàn)闇缇^程只是在65℃下1分鐘，而這對病原體的滅菌是不合適的。在本發(fā)明中，通過開發(fā)含有抗沙門氏菌IgY的雞蛋解決滅菌問題，因?yàn)槠淠苡糜谒崛樯a(chǎn)而無需滅菌。b)生產(chǎn)含有已抽提的水溶性特異免疫蛋白的酸乳和冰淇淋將幽門螺桿菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌抗原蛋白的混合抗原免疫產(chǎn)生的蛋黃分離，并與水溶性蛋白(粗提IgY)混合。表1，2，3和4中給出了冰淇淋和酸乳的混合比例。
表1

表2

表3

表4

8.生產(chǎn)含有三種(大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌)抗體的酸乳a)提取水溶性特異免疫蛋白如下進(jìn)行水溶性特異免疫蛋白的提取。
在250ml的瓶中收集35g無膜的蛋黃，并且攪拌加入35ml的堿離子水(pH9)。在5～10℃放置24小時(shí)后，加入堿離子水(pH10)，其量為18倍體積(1260ml)的蛋黃上清液和堿離子水，放置48小時(shí)分離。利用中空纖維柱方法，在超濾系統(tǒng)中濃縮上清液，并冷干。b)生產(chǎn)含有新鮮的蛋黃酸乳通過利用大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的抗原蛋白的混合抗原免疫所生產(chǎn)的蛋黃用于生產(chǎn)酸乳(表7，8)。酸乳生產(chǎn)中的滅菌是嚴(yán)重問題。將銷售限制于短期，因?yàn)闇缇^程是在65℃進(jìn)行1分鐘，而這對于病原體滅菌是不合適的。在本發(fā)明中，通過開發(fā)含有抗沙門氏菌IgY的雞蛋解決了滅菌問題，因其能用于酸乳生產(chǎn)而無需滅菌。c)生產(chǎn)含有已抽提的水溶性特異免疫蛋白的酸乳和冰淇淋分離通過大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的抗原蛋白的混合抗原免疫產(chǎn)生的蛋黃并且與水溶性蛋白(粗提IgY)粉混合。表5，6，7和8中給出了生產(chǎn)冰淇淋和酸乳的混合比例。
表5

表6

表7

表8

實(shí)施例2實(shí)施例2涉及通過混合單獨(dú)制取的各個(gè)抗體而產(chǎn)生的特異免疫蛋白的混合物，和涉及含有從以相同方法生產(chǎn)的雞蛋中提取的特異免疫蛋白的酸乳和冰淇淋。1.分離和鑒定腸致病性大腸桿菌及抗原生產(chǎn)從人中分離用于本發(fā)明的腸致病性大腸桿菌。如實(shí)施例1所述進(jìn)行腸致病性大腸桿菌(ETEC)的分離和鑒定及抗體的生產(chǎn)。2.幽門螺桿菌抗原的生產(chǎn)如實(shí)施例1所述進(jìn)行幽門螺桿菌抗原的生產(chǎn)。3.腸炎沙門氏菌抗原和鼠傷寒沙門氏菌抗原的生產(chǎn)。
如實(shí)施例1所述進(jìn)行腸炎沙門氏菌抗原和鼠傷寒沙門氏菌抗原的生產(chǎn)。4.給雛雞分別注射4種抗原并且給產(chǎn)蛋的母雞加強(qiáng)注射進(jìn)行免疫a)用分別經(jīng)乳化佐劑以1∶1的比例乳化的大腸桿菌、幽門螺桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌各1ml(108/ml)免疫12周齡雛雞，其相應(yīng)含有大腸桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和氫氧化鋁0.5ml、腸炎沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和氫氧化鋁0.5ml、鼠傷寒沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和氫氧化鋁0.5ml和幽門螺桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和氫氧化鋁0.5ml，混合的比例都是1∶1。從第二個(gè)星期開始，施用1ml與乳化佐劑ISA25乳化的各個(gè)抗原蛋白，注射兩次，兩次之間間隔2星期。用0.5ml各個(gè)乳化抗原蛋白免疫已成熟的產(chǎn)蛋母雞，其相應(yīng)含有大腸桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和乳化佐劑ISA25 0.5ml、腸炎沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和乳化佐劑ISA25 0.5ml、鼠傷寒沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和乳化佐劑ISA25 0.5ml以及幽門螺桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和乳化佐劑ISA25 0.5ml，混合的比例都是1∶1，注射兩次，每次之間間隔3個(gè)月?？偣?次。四種抗原(大腸桿菌、幽門螺桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌)沒有混合，而是各自注射。
b)用乳化佐劑以1∶1的比例分別乳化的大腸桿菌、幽門螺桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌各1ml(108/ml)免疫12周齡的雛雞，其相應(yīng)含有大腸桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和完全弗氏佐劑0.5ml，腸炎沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和完全弗氏佐劑0.5ml、鼠傷寒沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和完全弗氏佐劑0.5ml，以及幽門螺桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和完全弗氏佐劑0.5ml，混合的比例是1∶1。從第二個(gè)星期開始，用1ml與不完全弗氏佐劑乳化的各個(gè)抗原蛋白免疫兩次，兩次之間間隔2星期。已成熟的產(chǎn)蛋母雞用0.5ml各個(gè)乳化抗原蛋白免疫，其相應(yīng)含有大腸桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和不完全弗氏佐劑0.5ml、腸炎沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和不完全弗氏佐劑0.5ml、鼠傷寒沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和不完全弗氏佐劑0.5ml以及幽門螺桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和不完全弗氏佐劑0.5ml，混合的比例是1∶1，免疫兩次，兩次之間間隔3個(gè)月。四種抗原(大腸桿菌、幽門螺桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌)沒有混合使用，而是分開注射的，總共注射5次。結(jié)果是從用乳化的單獨(dú)抗原免疫的產(chǎn)蛋母雞中產(chǎn)生了分別含有抗大腸桿菌的IgY、抗腸炎沙門氏菌IgY和抗鼠傷寒沙門氏菌IgY的雞蛋。5.分離蛋黃、分離蛋黃粉、分離免疫蛋白和測量效價(jià)按照實(shí)施例1進(jìn)行蛋黃的分離、蛋黃粉的分離、免疫蛋白的分離和效價(jià)的測量。6.生產(chǎn)含有混合免疫蛋白的酸乳和冰淇淋。
如上所述，將水溶性特異免疫蛋白粉(粗提IgY)、新鮮蛋黃、和干蛋黃用作食品添加劑，比例為1∶1∶1∶1，2∶1∶1∶1，3∶1∶1∶1，4∶1∶1∶1，和5∶1∶1∶1(幽門螺桿菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌)，表9，10，11和12給出了冰淇淋和酸乳的混合比例。
表9

表10

表11

表12

實(shí)施例3圖2a中給出了本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)方法。
詳細(xì)的說明如下。為了分離含有IgY、脂和脂蛋白的蛋黃，用同樣量的蒸餾水稀釋蛋黃。制備了10個(gè)稀釋蛋黃的處理物，在處理物中慢慢加入1％-10％的硫酸銨，攪拌直到完全溶解。10個(gè)處理物5℃溫育一天后，根據(jù)濃度差異分離上層和底層。在上層漂了一些脂和蛋白，在底層能看到可忽略的沉淀(圖2b)。
正如圖2c中可以看到的，在加入1％硫酸銨的處理物中，可看到無分離和少量的沉淀，這和加入2％硫酸銨的處理物相似。在加入3％硫酸銨的處理物中，在上層看到了脂層，并且觀察到了如1％處理物中的相似沉淀。在加入4％硫酸銨的處理物中，觀察到了較多一點(diǎn)的脂層和沉淀的分離。在加入5％-6％硫酸銨的處理物中，在上層形成了厚的脂層，并且看到了少量的沉淀。在加入7-9％硫酸銨的處理物中其結(jié)果非常好，但加入10％硫酸銨的處理物的結(jié)果沒有7-9％的處理物的好。換句話說，除去脂的最佳條件是加入5-6％硫酸銨。根據(jù)IgY效價(jià)，加入4％硫酸銨的處理物能給出IgY效價(jià)的最好結(jié)果，正如圖2c所見。加入5％硫酸銨的處理物中厚的脂層表明對除脂最好。從底部回收底層可以得到?jīng)]有脂的溶液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對于現(xiàn)有技術(shù)中常用的硫酸銨分離蛋白的方法(Mathews，1990)，所用的硫酸銨濃度越高，觀察到的蛋白沉淀越多，但還需要純化沉淀物。通常，為得到高純度的蛋白，在處理物中加入10-20％的硫酸銨，離心后丟棄沉淀，而可用的是加入20％的硫酸銨后沉淀的蛋白。
本發(fā)明利用了脂的飄浮特性和借助硫酸銨的凝結(jié)特性來分離蛋黃、脂蛋白和特異免疫蛋白的脂，這如果不利用許多溶劑和沉淀誘導(dǎo)劑是難以分離的。實(shí)施例4為了除去與脂分離的溶液中留下的蛋黃中的脂、水溶性蛋白和色素，進(jìn)行了如下的實(shí)驗(yàn)。
用蒸餾水以×6、×12、×18、×30、×42、×48和×60的系數(shù)稀釋7個(gè)處理物，并在5℃溫育一天。小心分離上清液，使其不帶沉淀物?！?的稀釋處理物中含有沉淀，蛋黃的黃色仍保留在上清液中，并且不久沉淀就與上清液混合了。在×12、×18和×30的稀釋處理物中，沉淀物不易和上清液混合。而×42、×48和×60的稀釋處理物中，含有沉淀，但容易和上清液混合。所以，沉淀適當(dāng)?shù)南♂屜禂?shù)是×12和×18，其沉淀很粘，以致于需要利用自來水才能沖去。同時(shí)，測量了上清液的IgY效價(jià)，稀釋液的IgY效價(jià)回收率對6和60倍系數(shù)分別是109％和110％，高于標(biāo)準(zhǔn)。所以，IgY效價(jià)在稀釋液中更高，增高是由于水溶性免疫蛋白的影響。其他稀釋的處理物的IgY效價(jià)大于100％，但×12和×18的稀釋處理物除外?？梢赃x擇稀釋系數(shù)18，因?yàn)檫@樣不會(huì)導(dǎo)致沉淀溶解，并且可以完全除去色素。
因?yàn)橛玫鞍酌附到獾鞍卓旌统杀镜停琈athews，1990和Stryer，1998年提出，為了破壞細(xì)胞，采用混合器和勻漿器有利于勻漿，所以，利用勻漿器破壞細(xì)胞和組織，并以×6、×12、×18、×30、×42，×48和×60的系數(shù)稀釋，在5℃溫育過夜，重復(fù)同樣實(shí)驗(yàn)。對于分離方法，沉淀和上清液都混合，一起出來，得到的數(shù)據(jù)表示在表14和圖2c中。由于根據(jù)IgY效價(jià)，沒有更好的勻漿方法，所以考慮到方法簡便和經(jīng)濟(jì)，決定不利用混合器或勻漿器。
表13

表14

Akida，1993利用了蒸餾水的稀釋方法，其中包括在稀釋后加入葡聚糖、黃原膠、PEG(聚乙二醇)、乙醇硫酸鈉作為沉淀誘導(dǎo)劑，然后離心分離，而本發(fā)明為了除去脂利用了少量的硫酸銨在上層中凝結(jié)一些脂和蛋白，這與利用硫酸銨分離蛋白的方法是相反的?，F(xiàn)有技術(shù)利用硫酸銨來沉淀，而本發(fā)明利用硫酸銨來飄浮和凝結(jié)，這兩者是不同的。在本發(fā)明中，利用5％硫酸銨、蛋黃和蒸餾水(1∶1)分離脂和蛋白，過程是首先借助重力差異凝結(jié)成團(tuán)，然后借助蒸餾水的稀釋凝結(jié)沉淀蛋黃色素和水溶性蛋白。本發(fā)明生產(chǎn)產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)為了生產(chǎn)含有高含量IgY的產(chǎn)物，將分離上清液稀釋×18倍，并且用帶有amicon-2000的中空濾器M.W 100K，HIP100-43的濃縮器濃縮。另外，用TOYO2號濾紙，2～3層過濾和濃縮一部分相同濃度的上清液，用10倍體積的蒸餾水稀釋濃縮的溶液，并透析濃縮。
圖2e給出了上述兩個(gè)方法產(chǎn)生并凍干的處理物中IgY的效價(jià)。生產(chǎn)步驟包括18倍稀釋、濃縮、10倍稀釋、濃縮和透析，所得產(chǎn)物的回收率是70.8％，比18倍稀釋和濃縮步驟產(chǎn)生的產(chǎn)物的回收率(53.8％)更高，并且因?yàn)榧兓^好，所以純度也比其他更高。產(chǎn)生的蛋黃醬的IgY的效價(jià)。
作為實(shí)驗(yàn)，利用pH3、pH5和pH7的條件從本發(fā)明產(chǎn)生的蛋黃中生產(chǎn)蛋黃醬。pH7時(shí)，IgY的回收率是92.3％，這是最好的回收率，在圖2g中表示，pH3和pH5的回收率分別是85.8％和85.3％。所以，可以得出結(jié)論由于利用本發(fā)明產(chǎn)生的蛋黃所生產(chǎn)的蛋黃醬，IgY的效價(jià)沒有損失。本發(fā)明產(chǎn)生的產(chǎn)物的純化實(shí)驗(yàn)上清液經(jīng)分離和凍干后是白色的，圖2h給出了SDS-PAGE對純化前后的凍干產(chǎn)物的純度比較。如圖8中看到的，在本發(fā)明中產(chǎn)生的產(chǎn)物比其他產(chǎn)品純得多。已有報(bào)道，不利用離心產(chǎn)量就低，不利用沉淀誘導(dǎo)劑難于純化，并且會(huì)導(dǎo)致分離上清液的IgY效價(jià)的降低。但是就產(chǎn)量和純度而言，本發(fā)明產(chǎn)生的產(chǎn)物是優(yōu)越的，這表明本發(fā)明對于節(jié)省生產(chǎn)成本和時(shí)間以及規(guī)模生產(chǎn)是有利的。
本發(fā)明不局限于上述的優(yōu)選實(shí)施方案和附圖的詳細(xì)說明。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)各種修改方案實(shí)施本發(fā)明，但修改應(yīng)該包括在所述的權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.含有抗混合細(xì)菌特異蛋白即同時(shí)含有抗大腸桿菌(E.coli)IgY、抗幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)IgY、抗腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)IgY和抗鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)IgY的雞蛋的生產(chǎn)方法，其包括如下步驟用1ml大腸桿菌、幽門螺桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的混合抗原蛋白首次免疫雛雞，所述混合抗原蛋白已用氫氧化鋁以一定比例乳化，然后每次用1ml經(jīng)乳化佐劑ISA25乳化的乳化混合抗原蛋白繼續(xù)免疫兩次，該兩次免疫間隔一周，和每次用0.5ml經(jīng)乳化佐劑ISA25以相同比例乳化的乳化混合抗原蛋白免疫已成熟的產(chǎn)蛋母雞兩次，該兩次免疫間隔3個(gè)月，結(jié)果總共免疫5次。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有抗混合細(xì)菌特異蛋白即同時(shí)含有抗大腸桿菌IgY、抗幽門螺桿菌IgY、抗腸炎沙門氏菌IgY和抗鼠傷寒沙門氏菌IgY的雞蛋的生產(chǎn)方法，其包括下列步驟給雛雞首次用1ml大腸桿菌、幽門螺桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的混合抗原蛋白，所述混合抗原蛋白已用氫氧化鋁以一定比例乳化，其包含大腸桿菌4.0×108/ml的滅活抗原0.15ml、腸炎沙門氏菌4.0×108/ml的滅活抗原0.10ml、鼠傷寒沙門氏菌4.0×108/ml的滅活抗原0.10ml和幽門螺桿菌4.0×108/ml的滅活抗原0.35ml，用氫氧化鋁0.3ml乳化，其中混合比例為大腸桿菌∶腸炎沙門氏菌∶鼠傷寒沙門氏菌∶幽門螺桿菌∶乳化佐劑＝1.5∶1∶1∶3.5∶3，對于第二和第三次注射免疫，每次用1ml經(jīng)乳化佐劑ISA25以1∶1比例稀釋的混合抗原蛋白，兩次注射間隔一周，和每次用0.5ml的乳化混合抗原蛋白免疫已成熟的產(chǎn)蛋母雞兩次，該兩次免疫間隔3個(gè)月，所述乳化混合抗原蛋白包含大腸桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.15ml、腸炎沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.10ml、鼠傷寒沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.10ml和幽門螺桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.35ml，用乳化佐劑ISA25 0.3ml以相同比例乳化，結(jié)果總共免疫5次。
3.含有抗混合細(xì)菌特異蛋白即同時(shí)含有抗大腸桿菌IgY、抗幽門螺桿菌IgY、抗腸炎沙門氏菌IgY和抗鼠傷寒沙門氏菌IgY的雞蛋的生產(chǎn)方法，其包括如下步驟通過用1ml大腸桿菌、幽門螺桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的混合抗原蛋白首次免疫雛雞，所述混合抗原蛋白已用完全弗氏佐劑以一定比例乳化，然后每次用1ml經(jīng)不完全弗氏佐劑乳化的混合抗原繼續(xù)免疫兩次，該兩次免疫間隔一周，再每次用0.5ml以相同比例乳化的乳化混合抗原蛋白免疫已成熟的產(chǎn)蛋母雞兩次，該兩次免疫間隔3個(gè)月，結(jié)果總共免疫5次。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含有抗混合細(xì)菌特異蛋白即同時(shí)含有抗大腸桿菌IgY、抗幽門螺桿菌IgY、抗腸炎沙門氏菌IgY和抗鼠傷寒沙門氏菌IgY的雞蛋的生產(chǎn)方法，其包括如下步驟給雛雞首次用1ml大腸桿菌、幽門螺桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的混合抗原蛋白，所述混合抗原蛋白已用完全弗氏佐劑以一定比例乳化，其包含大腸桿菌4.0×108/ml的滅活抗原0.15ml、腸炎沙門氏菌4.0×108/ml的滅活抗原0.10ml、鼠傷寒沙門氏菌4.0×108/ml的滅活抗原0.10ml和幽門螺桿菌4.0×108/ml的滅活抗原0.35ml，用不完全弗氏佐劑0.3ml乳化，其中混合比例為大腸桿菌腸炎沙門氏菌∶鼠傷寒沙門氏菌∶幽門螺桿菌∶乳化佐劑＝1.5∶1∶1∶3.5∶3，對于第二和第三次注射免疫，每次用1ml經(jīng)不完全弗氏佐劑以1∶1比例稀釋的混合抗原蛋白，兩次免疫間隔一周，和每次用0.5ml的乳化混合抗原蛋白免疫已成熟的產(chǎn)蛋母雞兩次，該兩次免疫間隔3個(gè)月，所述乳化混合抗原蛋白包含大腸桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.15ml、腸炎沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.10ml、鼠傷寒沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.10ml和幽門螺桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.35ml，用不完全弗氏佐劑0.3ml以相同比例乳化，結(jié)果總共免疫5次。
5.含有抗混合細(xì)菌特異蛋白即同時(shí)含有抗大腸桿菌IgY、抗腸炎沙門氏菌IgY和抗鼠傷寒沙門氏菌IgY的雞蛋的生產(chǎn)方法，其包括如下步驟通過用1ml大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的混合抗原蛋白首次免疫雛雞，所述混合抗原蛋白已用氫氧化鋁以一定比例乳化，然后每次用1ml經(jīng)乳化佐劑ISA25乳化的混合抗原繼續(xù)免疫兩次，該兩次免疫間隔一周，和每次用0.5ml經(jīng)乳化佐劑ISA25以相同比例乳化的乳化混合抗原蛋白免疫已成熟的產(chǎn)蛋母雞兩次，該兩次免疫間隔3個(gè)月，結(jié)果總共免疫5次。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雞蛋的生產(chǎn)方法，包括下列步驟給雛雞用1ml大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的混合抗原蛋白，所述混合抗原蛋白已用乳化劑以3.5∶1.8∶1.7∶3比例乳化，其包含大腸桿菌4.0×108/ml的滅活抗原0.35ml、腸炎沙門氏菌4.0×108/ml的滅活抗原0.18ml和鼠傷寒沙門氏菌4.0×108/ml的滅活抗原0.17ml，用氫氧化鋁0.3ml乳化，對于第二和第三次注射免疫，每次用1ml經(jīng)乳化佐劑ISA25以1∶1比例稀釋的混合抗原蛋白，兩次免疫間隔一周，和每次用0.5ml的乳化混合抗原蛋白免疫已成熟的產(chǎn)蛋母雞兩次，該兩次免疫間隔3個(gè)月，所述乳化混合抗原蛋白包含大腸桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.35ml、腸炎沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.18ml和鼠傷寒沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.17ml，并用乳化佐劑ISA250.3ml以相同比例乳化，結(jié)果總共免疫5次。
7.含有抗混合細(xì)菌特異蛋白即同時(shí)含有抗大腸桿菌IgY、抗腸炎沙門氏菌IgY和抗鼠傷寒沙門氏菌IgY的雞蛋的生產(chǎn)方法，其包括如下步驟通過用1ml大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的混合抗原蛋白首次免疫雛雞，所述混合抗原蛋白已用完全弗氏佐劑以一定比例乳化，然后每次用1ml經(jīng)不完全弗氏佐劑乳化的乳化混合抗原繼續(xù)免疫兩次，該兩次免疫間隔一周，和每次用0.5ml經(jīng)不完全弗氏佐劑以相同比例乳化的乳化混合抗原蛋白免疫已成熟的產(chǎn)蛋母雞兩次，該兩次免疫間隔3個(gè)月，結(jié)果總共免疫5次。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雞蛋的生產(chǎn)方法，其包括下列步驟給雛雞用1ml大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的混合抗原蛋白，所述混合抗原蛋白已用不完全弗氏佐劑以3.5∶1.8∶1.7∶3比例乳化，其包含大腸桿菌4.0×108/ml的滅活抗原0.35ml、腸炎沙門氏菌4.0×108/ml的滅活抗原0.18ml和鼠傷寒沙門氏菌4.0×108/ml的滅活抗原0.17ml，用完全弗氏佐劑0.3ml乳化，對于第二和第三次注射免疫，每次用1ml經(jīng)不完全弗氏佐劑以1∶1比例稀釋的混合抗原蛋白，兩次免疫間隔一周，和每次用0.5ml的乳化混合抗原蛋白免疫已成熟的產(chǎn)蛋母雞兩次，該兩次免疫間隔3個(gè)月，所述乳化混合抗原蛋白包含大腸桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.35ml、腸炎沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.18ml和鼠傷寒沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.17ml，并用不完全弗氏佐劑0.3ml以相同比例乳化，結(jié)果總共免疫5次。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8所述的方法生產(chǎn)的含有抗混合細(xì)菌特異免疫蛋白的雞蛋。
10.生產(chǎn)抗混合細(xì)菌特異免疫蛋白的方法，包括如下步驟將35g含有抗混合細(xì)菌特異免疫蛋白的雞蛋的蛋黃收集到250ml的瓶中，加入35ml堿離子水(pH9)攪拌，5～10℃溫育24小時(shí)，加入堿離子水(18倍體積的蛋黃上清液和堿離子水(1260ml))，溫育48小時(shí)后分離，通過中空纖維柱方法在超濾系統(tǒng)中濃縮上清液，然后凍干。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法生產(chǎn)的抗混合細(xì)菌特異免疫蛋白。
12.由水溶性特異免疫蛋白(粗提IgY)(大腸桿菌∶腸炎沙門氏菌∶鼠傷寒沙門氏菌∶幽門螺桿菌)組成的抗混合細(xì)菌特異免疫蛋白粉的混合組合物，所述水溶性特異免疫蛋白分別從含有特異免疫蛋白的雞蛋中分離，所述混合組合物的生產(chǎn)方法包括下列步驟通過用1ml大腸桿菌、幽門螺桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的各個(gè)抗原蛋白首次免疫雛雞，所述各個(gè)抗原蛋白分別已用乳化佐劑以1∶1比例乳化，其相應(yīng)包含大腸桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和完全弗氏佐劑0.5ml、腸炎沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和完全弗氏佐劑0.5ml、鼠傷寒沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和完全弗氏佐劑0.5ml以及幽門螺桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和完全弗氏佐劑0.5ml，然后每次用1ml經(jīng)不完全弗氏佐劑乳化的各個(gè)抗原蛋白繼續(xù)免疫兩次，該兩次免疫間隔二周，和每次用0.5ml的各個(gè)乳化抗原蛋白免疫已成熟的產(chǎn)蛋母雞兩次，該兩次免疫間隔3個(gè)月，所述各個(gè)乳化抗原蛋白相應(yīng)包含大腸桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和不完全弗氏佐劑0.5ml、腸炎沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和不完全弗氏佐劑0.5ml、鼠傷寒沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和不完全弗氏佐劑0.5ml以及幽門螺桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和不完全弗氏佐劑0.5ml，結(jié)果總共免疫5次。
13.由水溶性特異免疫蛋白(粗提IgY)(大腸桿菌∶腸炎沙門氏菌∶鼠傷寒沙門氏菌∶幽門螺桿菌)組成的抗混合細(xì)菌特異免疫蛋白粉的混合組合物，所述水溶性特異免疫蛋白分別從含有特異免疫蛋白的雞蛋中分離，所述混合組合物的生產(chǎn)方法包括下列步驟通過用1ml(108/ml)大腸桿菌、幽門螺桿菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的各個(gè)抗原蛋白免疫雛雞，所述抗原蛋白分別已用乳化佐劑以1∶1比例乳化，其相應(yīng)以1∶1比例包含大腸桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和硫酸鋁0.5ml、腸炎沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和硫酸鋁0.5ml、鼠傷寒沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和硫酸鋁0.5ml以及幽門螺桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和硫酸鋁0.5ml，每次用1ml相應(yīng)經(jīng)乳化佐劑ISA25以1∶1比例乳化的所述抗原蛋白免疫雛雞兩次，該兩次免疫間隔二周，和每次用0.5ml的各個(gè)乳化抗原蛋白免疫已成熟的產(chǎn)蛋母雞兩次，該兩次免疫間隔3個(gè)月，所述各個(gè)乳化抗原蛋白相應(yīng)包含大腸桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和乳化佐劑ISA25 0.5ml、腸炎沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和乳化佐劑ISA25 0.5ml、鼠傷寒沙門氏菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和乳化佐劑ISA25 0.5ml以及幽門螺桿菌2.0×108/ml的滅活抗原0.5ml和乳化佐劑ISA25 0.5ml。結(jié)果總共5次免疫。
14.用牛奶加工的食物，其含有權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)所述的抗混合細(xì)菌特異免疫蛋白。
15.食品添加劑，其含有權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)所述的抗混合細(xì)菌特異免疫蛋白。
16.分離含有IgY的水溶性蛋白的方法，其包括如下步驟用蒸餾水以一定比例稀釋從含有混合抗致病菌特異抗體(IgY)的雞蛋中分離的蛋黃，第一次在蛋黃稀釋液中加入硫酸銨，第二次加入蒸餾水，以便分離水溶性特異免疫蛋白和磷脂，放置一定時(shí)間，除去上層脂，再次稀釋收集的上清液，放置一定時(shí)間，從而分離/純化特異免疫蛋白。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的分離含有IgY的水溶性蛋白的方法，其中所述硫酸銨的量是3％-10％。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的分離含有IgY的水溶性蛋白的方法，其中所述第一次稀釋比例為1∶1。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的分離含有IgY的水溶性蛋白的方法，其中所述第二次稀釋比例為1∶12、1∶18、1∶30、1∶42、1∶48和1∶60。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過同時(shí)采用引起腸炎的大腸桿菌、引起胃炎的幽門螺桿菌以及引起食物中毒的腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的抗原蛋白免疫雛雞以生產(chǎn)含有抗病原菌特異抗體(IgY)的雞蛋來防止胃炎、腹瀉和食物中毒的方法。本發(fā)明也涉及含有如上所述特異IgY抗體的組合物，和含有抗病原體IgY的食物如酸乳和冰淇淋。另外，本發(fā)明提供了從蛋黃中分離含IgY蛋白粉的方法。具體地，該分離方法包括用水以1∶1比例稀釋蛋黃，加入適當(dāng)量的硫酸銨，其能使水溶性蛋白和磷脂分離。
文檔編號A23G9/52GK1411378SQ01806110
公開日2003年4月16日 申請日期2001年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月5日
發(fā)明者李南珩, 柳貞秀, 鄭光龍, 白磻石, 鮮于宣泳 申請人:雞蛋高新技術(shù)有限公司