專利名稱：一種用于篩選防治老年癡呆癥藥物的細(xì)胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及穩(wěn)定表達(dá)與老年癡呆癥有關(guān)的兩個(gè)關(guān)鍵基因的細(xì)胞，更具體地本發(fā)明提供了一種能夠用于篩選治療和預(yù)防老年癡呆癥藥物的細(xì)胞株。
目前AD病的藥物開發(fā)研究的一個(gè)方向是阻止Aβ的大量生成。Aβ是由β分泌酶和γ分泌酶剪切其前體蛋白APP而成。因此抑制其中任何一個(gè)分泌酶都可以減少Aβ的生成。最近國(guó)外的研究顯示，使用部分純化的酶和底物作無(wú)細(xì)胞測(cè)定(Li YM 2000；Seiffert D 2000)，或使用APP表達(dá)細(xì)胞株的篩選(Esler WP2000)，結(jié)果大多數(shù)獲得的抑制性小分子化合物為γ分泌酶抑制劑。使用無(wú)細(xì)胞測(cè)定系統(tǒng)僅獲得低效價(jià)小分子抑制劑(Marcinkeviciene J 2001)。上述報(bào)道的分泌酶抑制劑雖然能夠不同程度地減少Aβ的生成，但是尚無(wú)臨床試驗(yàn)的報(bào)告?？梢姲l(fā)展快速有效的篩選方法是盡快找到抗老年癡呆癥藥物的關(guān)鍵。使用無(wú)細(xì)胞測(cè)定系統(tǒng)需要純化所需分泌酶和底物，成本較高，而且對(duì)β分泌酶效果不佳。使用APP表達(dá)細(xì)胞株對(duì)β分泌酶抑制劑篩選也不成功。鑒于此，本發(fā)明人設(shè)想利用基因工程方法同時(shí)將β分泌酶及其底物APP基因轉(zhuǎn)入同一細(xì)胞，使該細(xì)胞同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)酶和底物，并能生成和釋放Aβ致病多肽到細(xì)胞培養(yǎng)液，并以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)微量測(cè)定Aβ，以便在細(xì)胞水平進(jìn)行低成本高效率藥物篩選。根據(jù)這一思路，本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究，終于完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的另一方面涉及β分泌酶及其底物APP兩種蛋白的表達(dá)，其氨基酸序列是由人β分泌酶和人APP序列衍生而來(lái)。
本發(fā)明的再一方面涉及β分泌酶及其底物APP基因，及其表達(dá)載體。
圖2是以pcDNA3.1zeo出發(fā)構(gòu)建的含有APP695基因的載體的示意圖。
圖3是表達(dá)BACE-Fc融合蛋白的B33細(xì)胞株的一個(gè)鑒定試驗(yàn)。
圖4是用B33細(xì)胞和ELISA測(cè)定Aβ釋放的方法篩選表達(dá)APP基因細(xì)胞株的一個(gè)代表試驗(yàn)。
圖5示出已知γ分泌酶抑制劑115對(duì)B33A110細(xì)胞釋放Aβ的抑制效果。
為建立同時(shí)表達(dá)β分泌酶和APP兩種蛋白的細(xì)胞株，需要選擇適當(dāng)?shù)摩路置诿负虯PP蛋白結(jié)構(gòu)。β分泌酶和APP在真核細(xì)胞中同源性較好，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，這兩種蛋白的序列在不同種屬哺乳動(dòng)物之間的區(qū)別更小。因此把兩種基因轉(zhuǎn)染不同種屬的細(xì)胞，或?qū)⒉煌瑏?lái)源的這兩種基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，仍然可以獲得表達(dá)并將APP加工成致病多肽Aβ及釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中。β分泌酶和APP已知有幾個(gè)同功酶，其功能類似。例如BACE基因有432個(gè)氨基酸(GeneBank登錄號(hào)XM052045)；457個(gè)氨基酸(XM052046)；476個(gè)氨基酸(XM052047)；501個(gè)氨基酸(XM052041)；同源BACE-IB(AF338816)；BACE-IC(AF338817)；518個(gè)氨基酸的BACE2(XM049780)等。本發(fā)明選用人β分泌酶BACE(Vassar R 1999)和人APP695兩個(gè)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。其中人β分泌酶BACE的蛋白編碼序列為MAQALPWLLLWMGAGVLPAHGTQHGIRLPLRSGIGGAPLGLRLPRETDEEPEEPGRRGSFVEMVDNLRGKSGQGYYVEMTVGSPPQTLNILVDTGSSNFAVGAAPHPFLHRYYQRQLSSTYRDLRKGVYVPYTQGKWEGELGTDLVSIPHGPNVTVRANIAAITESDKFFINGSNWEGILGLAYAEIARPDDSLEPFFDSLVKQTHVPNLFSLQLCGAGFPLNQSEVLASVGGSMIIGGIDHSLYTGSLWYTPIRREWYYEVIIVRVEINGQDLKMDCKEYNYDKSIVDSGTTNLRLPKKVFEAAVKSIKAASSTEKFPDGFWLGEQLVCWQAGTTPWNIFPVISLYLMGEVTNQSFRITILPQQYLRPVEDVATSQDDCYKFAISQSSTGTVMGAVIMEGFYVVFDRARKRIGFAVSACHVHDEFRIAAVEGPFVILDMEDCGYNIPQTDESTLMTIAYVMAAICALFMLPLCLMVCQWRCLRCLRQQHDDFADDISLLK為了便于檢測(cè)和蛋白純化，將BACE的C-末端標(biāo)記上人抗體Fc段可使細(xì)胞株篩選較為容易。本發(fā)明選用衍生于人的Fc多肽序列DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK如果選用其它Fc序列或其它標(biāo)記，例如6xHis，c-myc，F(xiàn)lag，或V5均可達(dá)到相同效果，使篩選，檢測(cè)和純化較為容易。在BACE和Fc之間，還需要加入2-4個(gè)較小的氨基酸，以使這兩部分蛋白空間結(jié)構(gòu)和功能不會(huì)改變。本發(fā)明選用的BACE-Fc全長(zhǎng)蛋白序列為MAQALPWLLLWMGAGVLPAHGTQHGIRLPLRSGLGGAPLGLRLPRETDEEPEEPGRRGSFVEMVDNLRGKSGQGYYVEMTVGSPPQTLNILVDTGSSNFAVGAAPHPFLHRYYQRQLSSTYRDLRKGVYVPYTQGKWEGELGTDLVSIPHGPNVTVRANIAAITESDKFFINGSNWEGILGLAYAEIARPDDSLEPFFDSLVKQTHVPNLFSLQLCGAGFPLNQSEVLASVGGSMIIGGIDHSLYTGSLWYTPIRREWYYEVIIVRVEINGQDLKMDCKEYNYDKSIVDSGTTNLRLPKKVFEAAVKSIKAASSTEKFPDGFWLGEQLVCWQAGTTPWNIFPVISLYLMGEVTNQSFRITILPQQYLRPVEDVATSQDDCYKFAISQSSTGTVMGAVIMEGFYVVFDRARKRIGFAVSACHVHDEFRTAAVEGPFVTLDMEDCGYNIPQTDESTLMTIAYVMAAICALFMLPLCLMVCQWRCLRCLRQQHDDFADDISLLK DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK其中黑體字AVT是BACE和Fc之間的連接肽。
本發(fā)明選用人APP695基因是因?yàn)锳PP695在大腦的表達(dá)較多。如果選用在外周表達(dá)較多的人APP770或APP751表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)β分泌酶和γ分泌酶的酶切位點(diǎn)不受影響，其釋放Aβ的效果相同(KOO EH 1994)。因此，只要選用APP蛋白中比β分泌酶和γ分泌酶的酶切位點(diǎn)稍寬的多肽區(qū)域進(jìn)行表達(dá)，均可以獲得β分泌酶和γ分泌酶的加工并釋放Aβ多肽。其核心區(qū)是以Aβ為核心向N-或C-端各延長(zhǎng)10個(gè)氨基酸左右的APP區(qū)域KTEEISEVKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVITLVMLK。將該核心區(qū)域向C-端延長(zhǎng)到APP蛋白的C-末端，也即APP的C-末端的110個(gè)氨基酸，也是一個(gè)比較實(shí)用的選擇。因此選用APP的氨基酸序列可以是與下述任何一種有70-80％同源性的多肽蛋白序列。
1.以Aβ為中心的核心區(qū)KTEEISEVKM TVIVITLVMLK2.APP的C-末端的110個(gè)氨基酸IKTEEISEVKM TVIVITLVMLKKKQYTSIHHGVVEVDAAVTPEERHLSKMQQNGYENPTYKFFEQMQN3.APP695的全長(zhǎng)蛋白編碼序列是MLPGLALLLLAAWTARALEVPTDGNAGLLAEPQIAMFCGRLNMHMNVQNGKWDSDPSGTKTCIDTKEGILQYCQEVYPELQITNVVEANQPVTIQNWCKRGRKQCKTHPHFVIPYRCLVGEFVSDALLVPDKCKFLHQERMDVCETHLHWHTVAKETCSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESDNVDSADAEEDDSDVWWGGADTDYADGSEDKVVEVAEEEEVAEVEEEEADDDEDDEDGDEVEEEAEEPYEEATERTTSIATTTTTTTESVEEVVRVPTTAASTPDAVDKYLETPGDENEHAHFQKAKERLEAKHRERMSQVMREWEEAERQAKNLPKADKKAVIQHFQEKVESLEQEAANERQQLVETHMARVEAMLNDRRRLALENYITALQAVPPRPRHVFNMLKKYVRAEQKDRQHTLKHFEHVRMVDPKKAAQIRSQVMTHLRVIYERMNQSLSLLYNVPAVAEEIQDEVDELLQKEQNYSDDVLANMISEPRISYGNDALMPSLTETKTTVELLPVNGEFSLDDLQPWHSFGADSVPANTENEVEPVDARPA ADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVKMDAEFRH TVIVITLVMLKKKQYTSIHHGVVEVDAAVTPEERHLSKMQQNGYENPTYKFFEQMQN其中黑體字區(qū)域是Aβ42所在區(qū)域。
為取得β分泌酶BACE和APP兩種蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的高效表達(dá)，需將編碼上述BACE和APP的DNA序列分別克隆進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體中。該載體需有動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的啟動(dòng)子在蛋白編碼區(qū)之前，需有一個(gè)聚合腺苷酸(PolyA tail)序列在蛋白編碼區(qū)之后。例如載體pcDNA3.1系列(Invitrogen公司，含有CMV啟動(dòng)子和BGH聚合腺苷酸)，pCI系列和pIRES2-EGFP系列(Promega公司和CLONTECH公司，含有CMV啟動(dòng)子和SV40聚合腺苷酸)等。這兩種表達(dá)載體需要攜帶不同的抗生素拮抗基因，以便使用藥物篩選高效表達(dá)細(xì)胞株。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體pGEN-IRES-GFP含Neomycin拮抗基因；pcDNA3.1zeo含Zeocin拮抗基因。
本發(fā)明所說(shuō)β分泌酶BACE-Fc編碼區(qū)的兩端含有EcoRI內(nèi)切酶序列，以便將BACE克隆進(jìn)表達(dá)載體pGEN-IRES-GFP克隆位點(diǎn)EcoRI內(nèi)切酶位點(diǎn)區(qū)間。該載體是由pIRES2-EGFP(CLONTECH公司)載體衍生來(lái)的，功能相同的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。它們都攜帶拮抗抗生素Neomycin和Geneticin(G418)的功能基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，編碼標(biāo)記有Fc的β分泌酶DNA序列如下
GAATTCGGCTTTGGATCCGGCCCAC GCCCAAGCCCTGCCCTGGCTCCTGCTGTGGATGGGCGCGGGAGTGCTGCCTGCCCACGGCACCCAGCACGGCATCCGGCTGCCCCTGCGCAGCGGCCTGGGGGGCGCCCCCCTGGGGCTGCGGCTGCCCCGGGAGACCGACGAAGAGCCCGAGGAGCCCGGCCGGAGGGGCAGCTTTGTGGAGATGGTGGACAACCTGAGGGGCAAGTCGGGGCAGGGCTACTACGTGGAGATGACCGTGGGCAGCCCCCCGCAGACGCTCAACATCCTGGTGGATACAGGCAGCAGTAACTTTGCAGTGGGTGCTGCCCCCCACCCCTTCCTGCATCGCTACTACCAGAGGCAGCTGTCCAGCACATACCGGGACCTCCGGAAGGGTGTGTATGTGCCCTACACCCAGGGCAAGTGGGAAGGGGAGCTGGGCACCGACCTGGTAAGCATCCCCCATGGCCCCAACGTCACTGTGCGTGCCAACATTGCTGCCATCACTGAATCAGACAAGTTCTTCATCAACGGCTCCAACTGGGAAGGCATCCTGGGGCTGGCCTATGCTGAGATTGCCAGGCCTGACGACTCCCTGGAGCCTTTCTTTGACTCTCTGGTAAAGCAGACCCACGTTCCCAACCTCTTCTCCCTGCAGCTTTGTGGTGCTGGCTTCCCCCTCAACCAGTCTGAAGTGCTGGCCTCTGTCGGAGGGAGCATGATCATTGGAGGTATCGACCACTCGCTGTACACAGGCAGTCTCTGGTATACACCCATCCGGCGGGAGTGGTATTATGAGGTGATCATTGTGCGGGTGGAGATCAATGGACAGGATCTGAAAATGGACTGCAAGGAGTACAACTATGACAAGAGCATTGTGGACAGTGGCACCACCAACCTTCGTTTGCCCAAGAAAGTGTTTGAAGCTGCAGTCAAATCCATCAAGGCAGCCTCCTCCACGGAGAAGTTCCCTGATGGTTTCTGGCTAGGAGAGCAGCTGGTGTGCTGGCAAGCAGGCACCACCCCTTGGAACATTTTCCCAGTCATCTCACTCTACCTAATGGGTGAGGTTACCAACCAGTCCTTCCGCATCACCATCCTTCCGCAGCAATACCTGCGGCCAGTGGAAGATGTGGCCACGTCCCAAGACGACTGTTACAAGTTTGCCATCTCACAGTCATCCACGGGCACTGTTATGGGAGCTGTTATCATGGAGGGCTTCTACGTTGTCTTTGATCGGGCCCGAAAGCGAATTGGCTTTGCTGTCAGCGCTTGCCATGTGCACGATGAGTTCAGGACGGCAGCGGTGGAAGGCCCTTTTGTCACCTTGGACATGGAAGACTGTGGCTACAACATTCCACAGACAGATGAGTCAACCCTCATGACCATAGCCTATGTCATGGCTGCCATCTGCGCCCTCTTCATGCTGCCACTCTGCCTCATGGTGTGTCAGTGGCGCTGCCTCCGCTGCCTGCGCCAGCAGCATGATGACTTTGCTGATGACATCTCCCTGCTGAAGGCTGTAACAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA CTCGAGTTAAGCCGAATTC其中黑體字 是BACE-Fc的起始蛋氨酸編碼，黑體字 是BACE-Fc的截止信號(hào)，GAATTC是內(nèi)切酶EcoRI的酶切位點(diǎn)。經(jīng)內(nèi)切酶消化后，將此DNA插入pGEN-IRES-GFP載體EcoRI酶切位點(diǎn)。
本發(fā)明所用APP695的DNA編碼區(qū)5’端含有NheI內(nèi)切酶序列；3’端含有NotI內(nèi)切酶序列；以便將APP695DNA克隆進(jìn)表達(dá)載體pcDNA3.1zeo+多克隆位點(diǎn)的NheI和NotI內(nèi)切酶位點(diǎn)區(qū)間。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，編碼人APP695的DNA序列如下GCTAGCCACC CTGCCCGGTTTGGCACTGCTCCTGCTGGCCGCCTGGACGGCTCGGGCGCTGGAGGTACCCACTGATGGTAATGCTGGCCTGCTGGCTGAACCCCAGATTGCCATGTTCTGTGGCAGACTGAACATGCACATGAATGTCCAGAATGGGAAGTGGGATTCAGATCCATCAGGCACCAAAACCTGCATTGATACCAAGGAAGGCATCCTGCAGTATTGCCAAGAAGTCTACCCGGAACTGCAGATCACCAATGTGGTAGAAGCCAACCAACCAGTGACCATCCAGAACTGGTGCAAGCGGGGCCGCAAGCAGTGCAAGACCCATCCCCACTTTGTGATTCCCTACCGCTGCTTAGTTGGTGAGTTTGTAAGTGATGCCCTTCTCGTTCCTGACAAGTGCAAATTCTTACACCAGGAGAGGATGGATGTTTGCGAAACTCATCTTCACTGGCACACCGTCGCCAAAGAGACATGCAGTGAGAAGAGTACCAACTTGCATGACTACGGCATGTTGCTGCCCTGCGGAATTGACAAGTTCCGAGGGGTAGAGTTTGTGTGTTGCCCACTGGCTGAAGAAAGTGACAATGTGGATTCTGCTGATGCGGAGGAGGATGACTCGGATGTCTGGTGGGGCGGAGCAGACACAGACTATGCAGATGGGAGTGAAGACAAAGTAGTAGAAGTAGCAGAGGAGGAAGAAGTGGCTGAGGTGGAAGAAGAAGAAGCCGATGATGACGAGGACGATGAGGATGGTGATGAGGTAGAGGAAGAGGCTGAGGAACCCTACGAAGAAGCCACAGAGAGAACCACCAGCATTGCCACCACCACCACCACCACCACAGAGTCTGTGGAAGAGGTGGTTCGAGTTCCTACAACAGCAGCCAGTACCCCTGATGCCGTTGACAAGTATCTCGAGACACCTGGGGATGAGAATGAACATGCCCATTTCCAGAAAGCCAAAGAGAGGCTTGAGGCCAAGCACCGAGAGAGAATGTCCCAGGTCATGAGAGAATGGGAAGAGGCAGAACGTCAAGCAAAGAACTTGCCTAAAGCTGATAAGAAGGCAGTTATCCAGCATTTCCAGGAGAAAGTGGAATCTTTGGAACAGGAAGCAGCCAACGAGAGACAGCAGCTGGTGGAGACACACATGGCCAGAGTGGAAGCCATGCTCAATGACCGCCGCCGCCTGGCCCTGGAGAACTACATCACCGCTCTGCAGGCTGTTCCTCCTCGGCCTCGTCACGTGTTCAATATGCTAAAGAAGTATGTCCGCGCAGAACAGAAGGACAGACAGCACACCCTAAAGCATTTCGAGCATGTGCGCATGGTGGATCCCAAGAAAGCCGCTCAGATCCGGTCCCAGGTTATGACACACCTCCGTGTGATTTATGAGCGCATGAATCAGTCTCTCTCCCTGCTCTACAACGTGCCTGCAGTGGCCGAGGAGATTCAGGATGAAGTTGATGAGCTGCTTCAGAAAGAGCAAAACTATTCAGATGACGTCTTGGCCAACATGATTAGTGAACCAAGGATCAGTTACGGAAACGATGCTCTCATGCCATCTTTGACCGAAACGAAAACCACCGTGGAGCTCCTTCCCGTGAATGGAGAGTTCAGCCTGGACGATCTCCAGCCGTGGCATTCTTTTGGGGCTGACTCTGTGCCAGCCAACACAGAAAACGAAGTTGAGCCTGTTGATGCCCGCCCTGCTGCCGACCGAGGACTGACCACTCGACCAGGTTCTGGGTTGACAAATATCAAGACGGAGGAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTCCATCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGACAGTGATCGTCATCACCTTGGTGATGCTGAAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATCATGGTGTGGTGGAGGTTGACGCCGCTGTCACCCCAGAGGAGCGCCACCTGTCCAAGATGCAGCAGAACGGCTACGAAAATCCAACCTACAAGTTCTTTGAGCAGATGCAGAAC CGGCCGC其中黑體字ATG是APP695的起始蛋氨酸編碼，黑體字TAG是APP695的截止信號(hào)。GCTAGC是內(nèi)切酶NheI的酶切位點(diǎn)，CGGCCGC是內(nèi)切酶NotI的酶切位點(diǎn)。經(jīng)內(nèi)切酶消化后，將此DNA插入pcDNA3.1zeo+載體(NheI和NotI酶切位點(diǎn)之間)。
以上所列舉BACE-Fc和APP695DNA序列，其中至少有三分之一是可以改變而不改變所表達(dá)融合抗體的多肽序列和蛋白結(jié)構(gòu)。
將上述攜帶BACE-Fc基因的pGEN-IRES-GFP載體和攜帶APP695基因的pcDNA3.1zeo+載體AND結(jié)構(gòu)進(jìn)行克隆，篩選，擴(kuò)增后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染可使用電穿孔法(electroporation)，脂質(zhì)體法(LipofectAmine from Invitrogen)，或鈣沉淀法等。許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以用于上述BACE-Fc和APP695基因的表達(dá)，例如CHO，HEK293，HELA細(xì)胞等等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，并使用抗生素G418和Zeocin篩選出能高效穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。本發(fā)明已經(jīng)建立此種高效表達(dá)的HEK細(xì)胞株。細(xì)胞所產(chǎn)生的Aβ可以分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)液中，使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞所釋放的Aβ。在藥物篩選中，凡是能夠顯著降低細(xì)胞釋放Aβ的藥物都可能成為防治老年癡呆癥的藥物，值得進(jìn)一步開發(fā)研究。
以下將結(jié)合非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例1β分泌酶BACE和人APP695的真核細(xì)胞表達(dá)構(gòu)建β分泌酶BACE的表達(dá)DNA載體使用PCR方法從人腦細(xì)胞文庫(kù)中選擇性擴(kuò)增人BACE基因。選用ROCHE公司的EXPEND HIGH FIDELITY PCRKIT。PCR反應(yīng)包括38ul去離子水，5ul試劑盒提供的10X緩沖液，3ul DMSO，1ul dNTP(10mM dATP，10mM dCTP，10mMdGTP，10mM dTTP)，1uK試劑盒提供的混合DNA聚合酶，1ul 10uM含EcoR1內(nèi)切酶位點(diǎn)的BACE正向引物GATCCAGAATTCGGCTTTGGATCCGGCCCACCATGGCCCAAGCCCTGCCC和1ul 10uM含BACE-AVT連接肽的反向引物GAGTTTTGTCTGTTACAGCCTTCAGCAGGGAGATGTC，1ul人腦cDNA文庫(kù)(CloneTech)。PCR反應(yīng)使用94℃，30秒；54℃，30秒；72℃，1分鐘；共30周期。
第二組PCR反應(yīng)包括38ul去離子水，5ul試劑盒提供的10X緩沖液，3ulDMSO，1ul dNTP(10mM dATP，10mM dCTP，10mM dGTP，10mM dTTP)，1ul試劑盒提供的混合DNA聚合酶，1ul 10uM含AVT-Fc的正向引物GCTGTAACAGACAAAACTCACACATGCCC和1ul 10uM含EcoRI內(nèi)切酶位點(diǎn)的反向引物GATCTTGAATTCGGCTTAACTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC，1ul人淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)(CloneTech)。PCR反應(yīng)使用94℃，30秒；54℃，30秒；72℃，1分鐘；共30周期。經(jīng)1％瓊脂電泳分離證實(shí)上述兩個(gè)PCR產(chǎn)物含有BACE或Fc大小的DNA后，各提取1ul，再加入5ul試劑盒提供的10X緩沖液，3ul DMSO，1ul dNTP(10mMdATP，10mM dCTP，10mM dGTP，10mM dTTP)，1ul試劑盒提供的混合DNA聚合酶，加去離子水至最終體積50ul。PCR反應(yīng)使用94℃，30秒；54℃，30秒；72℃，1分鐘；共2個(gè)周期，然后再加入1ul 10uM濃度的下列兩種引物GATCCAGAATTCGGCTTTGGATCCGGCCCACCATGGCCCAAGCCCTGCCC(BACE-R1-F)和GATCTTGAATTCGGCTTAACTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC(Fc-R1-R)。PCR反應(yīng)使用94℃，30秒；54℃，30秒；72℃，1分鐘；共30個(gè)周期。PCR產(chǎn)物使用QIAGEN公司的QIAQUIK PCR PURIFICATIONKIT純化一份PCR反應(yīng)產(chǎn)物與五份PB緩沖液混合，然后裝入KIT所提供的小型離心柱離心；再使用0.5ml PB緩沖液離心洗柱一次；再用50ul KIT所提供的EB緩沖液裝柱離心洗脫。經(jīng)DNA濃度測(cè)定，吸取1ug純化的PCR產(chǎn)物，加2ul 10X緩沖液，1ul EcoRI內(nèi)切酶(New England Biolab)，再加去離子水至最終體積20ul，37℃保溫2小時(shí)。1ug pGEN-IRES-GFP載體DNA加5ul 10X緩沖液，1ul EcoRI內(nèi)切酶(New England Biolab)，再加去離子水至最終體積48ul，37℃保溫1小時(shí)，然后再加1ul EcoR I內(nèi)切酶，再37℃保溫1小時(shí)，然后再加1ul CIP(Calf Intestinal Phosphatase，New England Biolab公司)37℃保溫20分鐘。酶切后的PCR產(chǎn)物和載體經(jīng)1％瓊脂電泳分離，切出2.2kb大小含BACE-Fc融合DNA帶和近8kb的載體帶，再使用QIAGEN的AGROSE GELEXTRACTION KIT將酶切后的目的基因和載體分別純化稱出含有目的DNA的瓊脂重量，加入3倍體積的QG緩沖液，在50℃水浴保溫10分鐘以使瓊脂溶化，再加入1倍于瓊脂體積的異丙醇后過(guò)MinElute親和柱。使用Eppendorff離心機(jī)離心一分鐘后，目的DNA會(huì)滯留在親和柱上。使用500ul QG緩沖液，而后750ul PE溶液離心清洗MinElute親和柱各一次，然后用20ul 10mM pH8.5Tris-Cl緩沖液洗脫目的DNA。得到內(nèi)切酶處理和純化過(guò)的目的DNA和載體后，使用ROCHE公司的RAPID DNA LIGATION KIT將它們連接在一起3ul上述純化過(guò)的DNA加1ul載體，再加入1ul試劑盒提供的5X DNA混合溶液，混合好兩種DNA后再加入5ul試劑盒提供的2X連接緩沖液和0.5ul試劑盒提供的連接酶(ligase)，混合后在23-25℃室溫保溫5-10分鐘即可。使用2ul上述連接好DNA加20-40ul感受態(tài)DH5α細(xì)菌細(xì)胞，4℃冰上保溫20分鐘，42℃水浴熱休克1分鐘，4℃冷卻2分鐘，加入SOC培養(yǎng)液(Invitrogen公司)200ul，37℃搖床培養(yǎng)45分鐘，然后涂含有AMPICILIN的LB瓊脂平板。選陽(yáng)性菌落小量擴(kuò)增提取DNA(QIAGEN公司QIASPIN PLASMID MINI KIT)，經(jīng)克隆位點(diǎn)內(nèi)切酶的酶切，DNA序列分析驗(yàn)證表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的正確性后，進(jìn)行DNA大量擴(kuò)增(QIAGENQ公司QIAFILTER PLASMID MAXI KIT)。
圖1示出如此構(gòu)建的含有BACE-Fc融合基因的載體的示意圖。
構(gòu)建APP695的表達(dá)DNA載體使用PCR方法從人APP695DNA(哈佛大學(xué)Selkoe實(shí)驗(yàn)室慧贈(zèng))中選擇性擴(kuò)增含所需內(nèi)切酶序列的人APP695。選用ROCHE公司的EXPEND HIGH FIDELITYPCR KIT。PCR反應(yīng)包括38ul去離子水，5ul試劑盒提供的10X緩沖液，3ulDMSO，1ul dNTP(10mM dATP，10mM dCTP，10mM dGTP，10mM dTTP)，1ul試劑盒提供的混合DNA聚合酶，1ul 10uM含Nhe1內(nèi)切酶位點(diǎn)的APP正向引物CTATAGCTAGCCACCATGCTGCCCGGTTTGGCAC和1ul 10uM含NotI內(nèi)切酶位點(diǎn)的反向引物CTATATGCGGCCGCTAGTTCTGCATCTGCTCAAAG，1ul人APP695基因(1ng)。PCR反應(yīng)使用94℃，30秒；54℃，30秒；72℃，1分鐘；共30周期。PCR產(chǎn)物使用QIAGEN公司的QIAQUIK PCRPURIFICATION KIT純化一份PCR反應(yīng)產(chǎn)物與五份PB緩沖液混合，然后裝入KIT所提供的小型離心柱離心；再使用0.5ml PB緩沖液離心洗柱一次；再用50ul KIT所提供的EB緩沖液裝柱離心洗脫。經(jīng)DNA濃度測(cè)定，吸取1ug純化的PCR產(chǎn)物，加2ul 10X緩沖液，1ul NheI和1ul NotI內(nèi)切酶(New EnglandBiolab)，再加去離子水至最終體積20ul，37℃保溫2小時(shí)。1ug pcDNA3.1zeo載體DNA加5ul 10X緩沖液，1ul NheI和1ul NotI內(nèi)切酶(New England Biolab)，再加去離子水至最終體積48ul，37℃保溫1小時(shí)，然后再加1ul NheI和1ulNotI內(nèi)切酶，再37℃保溫1小時(shí)，然后再加1ul CIP(Calf Intestinal Phosphatase，New England Biolab公司)37℃保溫20分鐘。酶切后的PCR產(chǎn)物和載體經(jīng)1％瓊脂電泳分離，分別切出2.1kb大小含APP695的DNA帶和約5kb的載體帶，再使用QIAGEN的AGROSE GEL EXTRACTION KIT將酶切后的目的基因和載體分別純化稱出含有目的DNA的瓊脂重量，加入3倍體積的QG緩沖液，在50℃水浴保溫10分鐘以使瓊脂溶化，再加入1倍于瓊脂體積的異丙醇后過(guò)MinElute親和柱。使用Eppendorff離心機(jī)離心一分鐘后，目的DNA會(huì)滯留在親和柱上。使用500ul QG緩沖液，而后750ul PE溶液離心清洗MinElute親和柱各一次，然后用20ul 10mM pH8.5 Tris-Cl緩沖液洗脫目的DNA。得到內(nèi)切酶處理和純化過(guò)的目的DNA和載體后，使用ROCHE公司的RAPID DNALIGATION KIT將它們連接在一起3ul上述純化過(guò)的DNA加1ul載體，再加入1ul試劑盒提供的5X DNA混合溶液，混合好目的基因DNA和載體后再加入5ul試劑盒提供的2X連接緩沖液和0.5ul試劑盒提供的連接酶(ligase)，混合后在23-25℃室溫保溫5-10分鐘即可。使用2ul上述連接好DNA加20-40ul感受態(tài)DH5α細(xì)菌細(xì)胞，4℃冰上保溫20分鐘，42℃水浴熱休克1分鐘，4℃冷卻2分鐘，加入SOC培養(yǎng)液(Invitrogen公司)200ul，37℃搖床培養(yǎng)45分鐘，然后涂含有AMPICILIN的LB瓊脂平板。選陽(yáng)性菌落小量擴(kuò)增提取DNA(QIAGEN公司QIASPIN PLASMID MINI KIT)，經(jīng)克隆位點(diǎn)內(nèi)切酶的酶切，DNA序列分析驗(yàn)證表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的正確性后，進(jìn)行DNA大量擴(kuò)增(QIAGENQ公司QIAFILTER PLASMID MAXI KIT)。圖2示出如此構(gòu)建的含有人APP695基因的表達(dá)載體示意圖。
建立表達(dá)β分泌酶BACE的細(xì)胞株人HEK293細(xì)胞培養(yǎng)在含有10％小牛血清(Sigma公司)的DMEM培養(yǎng)液(Sigma公司)中。培養(yǎng)液還含有1X青霉素和鏈霉素(稀釋自Sigma公司100X濃縮液)。當(dāng)HEK293細(xì)胞培養(yǎng)在60mm培養(yǎng)皿中至50-70％細(xì)胞密度，在轉(zhuǎn)染前改換OptiMEM培養(yǎng)液(Invitrogen公司)2ml并準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。3ug含有BACE基因的表達(dá)質(zhì)粒與100ul OptiMEM混合，9ul LipofectAmine(Invitrogen公司)與100ul OptiMEM混合，再將兩種溶液混合并在室溫放置20分鐘。將上述DNA-LipofecAmine混合液加入上述HEK293細(xì)胞中，在37℃和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4小時(shí)后，更換為5ml前述含有10％小牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)1至2天至滿盤(confluence)。然后將細(xì)胞分養(yǎng)(split)到100mm培養(yǎng)皿中，平均每個(gè)培養(yǎng)皿分200至1000個(gè)細(xì)胞，使用上述含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，并添加篩選藥Geneticin(Sigma公司)至每毫升250ug濃度。細(xì)胞在此培養(yǎng)液中培養(yǎng)3至4周后，只有能穩(wěn)定表達(dá)BACE基因的細(xì)胞可以形成細(xì)胞群落。將獨(dú)立的細(xì)胞群落分離出來(lái)分別獨(dú)立培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板和使用上述篩選培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞密度到達(dá)80％左右，將細(xì)胞一分為二繼續(xù)在6孔培養(yǎng)板中生長(zhǎng)。一套留種，另一套待細(xì)胞生長(zhǎng)直至90-100％細(xì)胞密度，去除培養(yǎng)液，使用0.3ml細(xì)胞裂解溶液(1％Nonidet P-40，10mM Tris pH8，150mM氯化鈉，0.25mMPhenylmethylsulfonyl fluoride(Sigma))在4℃將細(xì)胞裂解10分鐘，然后將細(xì)胞及其裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管，離心10000轉(zhuǎn)5分鐘后，提取10ul與電泳用樣品緩沖液混合，10％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)移(transfer)到硝酸纖維素膜上，使用蛋白質(zhì)印跡法(Western-Blot)探測(cè)所表達(dá)的BACE-Fc融合蛋白。將硝酸纖維素膜在含5％牛奶的TBST緩沖液中輕搖1小時(shí)，更換含有抗人Fc抗體(1∶10000稀釋自Zymet公司HRP酶聯(lián)抗體)TBST緩沖液并輕搖1小時(shí)，然后使用TBST緩沖液清洗三次各15分鐘，使用PIERCE的SUPER SIGNALKIT熒光顯色后再曝光膠片，以確定高效表達(dá)BACE基因的細(xì)胞株。高效表達(dá)BACE基因的細(xì)胞株B33既是這種方法選出，它有82kDa的可被抗人Fc抗體識(shí)別的蛋白帶。使用抗BACE的兔抗體，以HRP酶聯(lián)抗兔抗體作為第二抗體作Western-Blot，也可以探測(cè)到82kDa的BACE-Fc融合蛋白。
圖3示出在人HEK293細(xì)胞中表達(dá)的BACE-Fc融合蛋白的B33細(xì)胞株鑒定試驗(yàn)。
建立同時(shí)表達(dá)β分泌酶BACE和APP基因的細(xì)胞株上述表達(dá)BACE的B33細(xì)胞培養(yǎng)在含有10％小牛血清(Sigma公司)的DMEM培養(yǎng)液(Sigma公司)中。培養(yǎng)液還含有1X青霉素和鏈霉素(稀釋自Sigma公司100X濃縮液)。把B33細(xì)胞培養(yǎng)在60mm培養(yǎng)皿中至50-70％細(xì)胞密度，在轉(zhuǎn)染前改換OptiMEM培養(yǎng)液(Invitrogen公司)2ml并準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。3ug含有APP695基因的表達(dá)質(zhì)粒與100ul OptiMEM混合，9ulLipofectAmine(Invitrogen公司)與100ul OptiMEM混合，再將兩種溶液混合并在室溫放置20分鐘。將上述DNA-LipofecAmine混合液加入上述B33細(xì)胞中，在37℃和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4小時(shí)后，更換為5ml前述含有10％小牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)1至2天至滿盤(confluence)。然后將細(xì)胞分養(yǎng)(split)到100mm培養(yǎng)皿中，平均每個(gè)培養(yǎng)皿分200至1000個(gè)細(xì)胞，使用上述含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，并添加篩選藥Geneticin(Sigma公司)和Zeocin(Invitrogen公司)至每毫升各200ug濃度。細(xì)胞在此培養(yǎng)液中培養(yǎng)3至4周后，只有能同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)BACE和APP基因的細(xì)胞可以形成細(xì)胞群落。將獨(dú)立的細(xì)胞群落分離出來(lái)分別獨(dú)立培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板和使用上述篩選培養(yǎng)液直至80％細(xì)胞密度，更換3ml新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)后，收集培養(yǎng)液0.3ml，用ELSIA檢測(cè)細(xì)胞所釋放的Aβ。使用Reacti-Bind-NeutrAvedin(PIERCE)96孔測(cè)定板，每孔加100ul用TBST緩沖液1∶200稀釋的標(biāo)記有Biotin的羊抗兔抗體(Zymed65-6140)，23-25℃保溫1小時(shí)；再以TBST緩沖液清洗5次，然后每孔加100ul兔抗Aβ40抗體(QCB公司44348，以含5％小牛血清(FCS)的TBST稀釋到2.2ug/ml)，保溫37℃一小時(shí)；再以TBST緩沖液清洗5次，然后每孔加100ul上述細(xì)胞培養(yǎng)液4℃保溫過(guò)夜(每個(gè)樣品作兩個(gè)重復(fù)測(cè)定)；標(biāo)準(zhǔn)曲線使用合成Aβ40，以細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成0，100，200，400，800，1600，3200pg/ml濃度，與測(cè)定樣品一樣每孔加100ul不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)肽4℃保溫過(guò)夜；第二天以TBST緩沖液清洗5次，然后每孔加100ul鼠抗Aβ1-17抗體6E10(Senetec公司，以含5％FCS的TBST稀釋1∶2000)，23-25℃保溫1小時(shí)；再以TBST緩沖液清洗5次，然后每孔加100ul以含2％牛白蛋白的TBST稀釋1∶5000，標(biāo)記有堿性磷酸酶的羊抗鼠抗體(PIERCE)，23-25℃保溫1小時(shí)；然后以TBST緩沖液清洗3次，去離子水清洗2次后，每孔加100ul底物AttoPhos(Boehringer-Mann公司)23-25℃避光保溫30-45分鐘；熒光強(qiáng)度以450激發(fā)光和555發(fā)射光波長(zhǎng)檢測(cè)。同時(shí)表達(dá)BACE和APP的細(xì)胞能夠釋放大量Aβ到細(xì)胞培養(yǎng)液中。高效表達(dá)BACE和APP兩種基因的細(xì)胞株B33A110既是這種方法篩選出來(lái)的。
圖4示出在B33細(xì)胞中用ELISA測(cè)定Aβ釋放的方法篩選表達(dá)APP基因細(xì)胞株的一個(gè)代表試驗(yàn)。
抑制劑對(duì)B33A110細(xì)胞Aβ釋放的抑制效果為鑒定能穩(wěn)定表達(dá)BACE和APP兩種基因的B33A110細(xì)胞株在藥物篩選中的效果，選用已知能夠抑制細(xì)胞釋放Aβ的γ分泌酶抑制劑Difluoro ketonepeptidomimetic inhibitor 115(Wolfe MS 1999)進(jìn)行測(cè)試。將抑制劑115和結(jié)構(gòu)相似但是沒有效果的對(duì)照劑124(哈佛大學(xué)Wolfe實(shí)驗(yàn)室慧贈(zèng))溶解于DMSO至25mM濃度。將B33A110細(xì)胞培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)皿至80％密度，更換新鮮培養(yǎng)液2ml，并加入抑制劑115或?qū)φ談?24至20uM(1∶1000稀釋自上述工作液)濃度繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。收取300ul培養(yǎng)液，用100ul一個(gè)測(cè)定作重復(fù)ELISA測(cè)定Aβ含量(方法見上述)。如果試驗(yàn)結(jié)果超出標(biāo)準(zhǔn)曲線，可將剩余樣品稀釋5-10倍再進(jìn)行ELISA測(cè)定。試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行5次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤作圖。圖5示出已知γ分泌酶抑制劑115對(duì)B33A110細(xì)胞釋放Aβ的抑制效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制劑115能夠顯著抑制B33A110細(xì)胞釋放Aβ；B33A110細(xì)胞株是用于篩選抗老年癡呆癥藥物，特別是尚未發(fā)現(xiàn)的β分泌酶抑制劑的重要工具。
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權(quán)利要求
1.一種用于篩選防治老年癡呆癥藥物的細(xì)胞株，其特征在于所進(jìn)細(xì)胞株能夠同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)β-淀粉樣前體蛋白和β-分泌酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，其中所說(shuō)的β-淀粉樣前體蛋白是從人β-淀粉樣前體蛋白序列衍生出來(lái)的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和/或2所述的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，其中所說(shuō)的人β-淀粉樣前體蛋白具有下述氨基酸序列或MLPGLALLLLAAWTARALEVPTDGNAGLLAEPQIAMFCGRLNMHMNVQNGKWDSDPSGTKTCIDTKEGILQYCQEVYPELQITNVVEANQPVTIQNWCKRGRKQCKTHPHFVIPYRCLVGEFVSDALLVPDKCKFLHQERMDVCETHLHWHTVAKETCSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESDNVDSADAEEDDSDVWWGGADTDYADGSEDKVVEVAEEEEVAEVEEEEADDDEDDEDGDEVEEEAEEPYEEATERTTSIATTTTTTTESVEEVVRVPTTAASTPDAVDKYLETPGDENEHAHFQKAKERLEAKHRERMSQVMREWEEAERQAKNLPKADKKAVIQHFQEKVESLEQEAANERQQLVETHMARVEAMLNDRRRLALENYITALQAVPPRPRHVFNMLKKYVRAEQKDRQHTLKHFEHVRMVDPKKAAQIRSQVMTHLRVIYERMNQSLSLLYNVPAVAEEIQDEVDELLQKEQNYSDDVLANMISEPRISYGNDALMPSLTETKTTVELLPVNGEFSLDDLQPWHSFGADSVPANTENEVEPVDARPAADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVITLVMLKKKQYTSIHHGVVEVDAAVTPEERHLSKMQQNGYENPTYKFFEQMQN與上述氨基酸序列至少70-80％同源的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，其中所說(shuō)的β-分泌酶是從人β-分泌酶蛋白序列衍生出來(lái)的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和/或4所述的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，其中所說(shuō)的人β-分泌酶具有下述氨基酸序列或MAQALPWLLLWMGAGVLPAHGTQHGIRLPLRSGLGGAPLGLRLPRETDEEPEEPGRRGSFVEMVDNLRGKSGQGYYVEMTVGSPPQTLNILVDTGSSNFAVGAAPHPFLHRYYQRQLSSTYRDLRKGVYVPYTQGKWEGELGTDLVSIPHGPNVTVRANIAAITESDKFFINGSNWEGILGLAYAEIARPDDSLEPFFDSLVKQTHVPNLFSLQLCGAGFPLNQSEVLASVGGSMIIGGIDHSLYTGSLWYTPIRREWYYEVIIVRVEINGQDLKMDCKEYNYDKSIVDSGTTNLRLPKKVFEAAVKSIKAASSTEKFPDGFWLGEQLVCWQAGTTPWNIFPVISLYLMGEVTNQSFRITILPQQYLRPVEDVATSQDDCYKFAISQSSTGTVMGAVIMEGFYVVFDRARKRIGFAVSACHVHDEFRTAAVEGPFVTLDMEDCGYNIPQTDESTLMTIAYVMAAICALFMLPLCLMVCQWRCLRCLRQQHDDFADDISLLK與上述氨基酸序列至少70-80％同源的序列。
6.包含編碼權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)基因的宿主細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其為真核宿主細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其為CHO，HELA或HEK293。
10.根據(jù)權(quán)利要求所說(shuō)的藥物篩選指的是微量測(cè)定細(xì)胞所釋放的致病多肽Aβ。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能夠用于篩選治療和預(yù)防老年癡呆癥藥物的細(xì)胞株，所述細(xì)胞株能夠同時(shí)表達(dá)β分泌酶及其底物APP兩種蛋白，并釋放能夠造成老年癡呆癥的致病多肽Aβ。本發(fā)明還涉及編碼所述β分泌酶及其底物APP的基因，包含該兩基因的真核表達(dá)載體。
文檔編號(hào)C12N15/79GK1407104SQ01142059
公開日2003年4月2日 申請(qǐng)日期2001年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月10日
發(fā)明者張冀民, 張小如 申請(qǐng)人:張小如, 張冀民