專利名稱：CpG島甲基化檢測試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因檢測技術(shù)，具體是指用于腫瘤診斷、去甲基化藥物篩選的CpG島甲基化檢測試劑盒及其應(yīng)用。
目前測定5′-CpG島甲基化的方法有Southern blot，原理是利用對甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶不能切開含有一個或幾個甲基化的CpG位點的序列，這種方法提供了估計CpG島總體甲基化情況，要求大量DNA成分，它能提供甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶所能識別序列之內(nèi)CpG位點的甲基化信息；另一種方法是利用甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶結(jié)合PCR的方法，酶消化后的DNA被覆蓋著限制性位點的引物擴增，只有CpG位點甲基化的才能提供完整的模板。這種方法也只能提供限制性內(nèi)切酶識別范圍內(nèi)的CpG位點甲基化信息，非甲基化的DNA必須完全限制，消化不完全的DNA可產(chǎn)生假陽性。
人們?yōu)閷ふ覚z測CpG島甲基化，開展了長期深入的研究，得出了一些CpG島的高甲基化的基因失活與腫瘤和白血病的關(guān)系，為診斷與治療癌癥提供了新途徑。但目前在國內(nèi)外均未見有關(guān)檢測腫瘤基因甲基化和去甲基化試劑盒生產(chǎn)、銷售、使用方面的報道。
CpG島甲基化檢測試劑盒包含有下列藥物
(1)引物利用人類基因組的基因序列，根據(jù)堿基錯配原理，引物選自細胞周期上二個基因即P15INK4B，P16INK4A基因，胰癌基因CPG，蛋白激酶相關(guān)蛋白基因CPG，乳腺癌基因2CPG，急性白血病相關(guān)基因，基因調(diào)節(jié)因子3基因，基因調(diào)節(jié)因子27基因，GTP激酶相關(guān)蛋白27基因，GTP激酶相關(guān)蛋白基因27B，GTP激酶相關(guān)蛋白基因2L引物中的任何一種；(2)提取模板DNA的藥物①內(nèi)含200～400μg/ml的蛋白酶K的DNA提取液，②飽和酚/氯仿/異戊醇體系，它們的體積比為20～25∶20～25∶1，③醋酸鈉，④淋巴細胞分層液；(3)基因組修飾用藥物①硅精，②氫醌，③亞硫酸氫鈉，④礦物油；(4)基因組修飾后的DNA純化用藥物①DNA純化用DEAE樹脂，②異丙醇；(5)特異性MSP-PCR反應(yīng)體系①甲基化PCR緩沖液，10×buffer，②四種核苷酸即dNTP，③MgCl2，④耐高溫聚合酶即Taq酶；(6)陽性和陰性對照標(biāo)本①陽性標(biāo)本甲基化Raji細胞，②陰性標(biāo)本非甲基化HL60細胞。
提取模板DNA的藥物中飽和酚是指用50mmol/L的三羥甲基氨基甲烷飽和的酚；飽和酚/氯仿/異戊醇體積比為24∶24∶1。
基因修飾用藥物中硅精是指用常規(guī)DNA純化方法純化過的硅精，氫醌和亞硫酸氫鈉采用分析純干粉。
CpG島甲基化檢測試劑盒的應(yīng)用，包括常規(guī)標(biāo)本的收集；基因組DNA提取、修飾和純化，其特征在于(1)基因組修飾中①純化硅精DNA用量為0.51～2μg/份，②氫醌的新鮮配制將10～13mg的氫醌定容在10ml超凈水中，③亞硫酸氫鈉的新鮮配制將2.9～3.2g的亞硫酸氫鈉定容在10ml超凈水中，④修飾的溫度為50～60℃，⑤孵育時間為12～18小時；(2)修飾后模板DNA純化中①DEAE樹脂加入量為0.5～1.5mg，②用異丙醇洗滌并過濾后離心，③干燥樹脂，④加入50～60μl的預(yù)熱至55～75℃超凈水中，并離心，⑤加入1mol/L的氫氧化鈉，使其終濃度達0.2～0.4mmol/L、置室溫保存，⑥加無水乙醇并在-20℃下過夜，⑦0℃離心，⑧70％乙醇洗滌后干燥，⑨超凈水溶解后，-20℃保存；(3)特異性PCR即MSP反應(yīng)體系配制如下①反應(yīng)體積50μlPM PU10×buffer 5μl 5μldNTP5～8μl 5～8μlMgCl210～15μl10～15μlPM或PU 2～4μlMoDNA 8～10μl 8～10μlTaq酶 1～4u1～4u加H2O至50ml，加50ml石蠟油②反應(yīng)條件
將上述體系放入PCR機中進行如下反應(yīng)首先93～95℃變性5～10min，然后按93～95℃ 30～45S→55～65℃30～45S→70～72℃ 30～45S的次序做24～34個循環(huán)，再70～72℃延伸5～10min，產(chǎn)物4℃下保存?zhèn)溆茫?4)陰陽性對照MSP反應(yīng)中放Raji和HL60細胞株分別做陽性和陰性對照，設(shè)不加模板DNA即MODNA作空白對照；除上述之外的其他應(yīng)用過程均為常規(guī)技術(shù)，所用藥物均為分析純。
特異性PCR即MSP反應(yīng)優(yōu)選條件為按94℃ 35S→58℃ 35S→71℃ 35S做25個循環(huán)。
應(yīng)用過程中所用離心均選9000～12000rpm。
本發(fā)明具有如下突出的優(yōu)點本發(fā)明開發(fā)的CpG島甲基化檢測試劑盒在陽性與陰性細胞混合為1∶104時可以測到甲基化陽性細胞，靈敏度高，準(zhǔn)確，該試劑盒的生產(chǎn)和應(yīng)用，將可達到如下使用目的(1)檢測臨床患者基因是否甲基化，在CpG島基因甲基化說明該患者已有癌變的可能；(2)測定腫瘤病人在治療過程中的CpG島基因甲基化的情況、從而可改變治療方案，用去甲基化藥物去甲基化后再化療，療效高；(3)檢測和篩選去甲基化的藥物；(4)檢測腫瘤患者應(yīng)用去甲基化藥物治療的結(jié)果。
廣泛應(yīng)用于癌癥的診斷和相關(guān)藥物的篩選，將會產(chǎn)生巨大經(jīng)濟效益和社會效益。
(2)提取模板DNA藥物①內(nèi)含濃度為200μg/ml或300μg/ml或400μg/ml蛋白酶K的DNA提取液10ml，②用50mmol/L的三羥甲基氨基甲烷飽和的酚/氯仿/異戊醇比例為24∶24∶1，10ml，③濃度范圍為2.5～4.6ml/L，PH范圍為4.6～5.2的醋酸鈉，10ml，④淋巴細胞分層液35ml；(3)基因組的修飾所用藥物①用常規(guī)DNA純化方法純化過的硅精12μg，②分析純的粉末狀氫醌13mg，③分析純的粉末狀亞硫酸氫鈉3.5mg，④礦物油1.5ml；(4)基因組修飾后的DNA純化用藥物①DNA純化用DEAE52樹脂1g，②分析純的異丙醇20ml；(5)特異性PCR-MSP反應(yīng)體系①甲基化PCR緩沖液，10×buffer含硫酸銨10mg、三羥甲基氨基甲烷10mg、PH8.8β-巰基乙醇10ml，②濃度為25mol/L的dNTP即dTTP、dATP、dCTP、dGTP四種核苷酸各10μl，③濃度為2.5mmol/L的MgCl21.5ml；(6)陽性和陰性對照標(biāo)本甲基化的陽性標(biāo)本DNA 15μg，非甲基化陰性標(biāo)本DNA 15μg；將上述藥物總裝于試劑盒。應(yīng)用實施例應(yīng)用實施例1不成熟B系細胞株Raji為P15基因甲基化陽性的細胞株(中山醫(yī)腫瘤醫(yī)院研究所贈)；HL60為P15基因非甲基化陽性的髓系細胞株；K562為P15基因純合缺失的紅-巨核系細胞株由本室提供。本實施例中1.細胞培養(yǎng)取傳代用HL60、K562、Raji細胞株分別轉(zhuǎn)入RPMI1640100ml培養(yǎng)瓶中，RPMI1640，加5％滅活小牛血清，青霉素100U/ml，1％(v/v)谷酰胺。5％CO2培養(yǎng)箱，37℃，培養(yǎng)72小時。
2.收集細胞細胞混懸液轉(zhuǎn)入10ml離心管，LXJ-II離心1800rpm，棄上清，1×PBS洗二遍，1×107細胞轉(zhuǎn)入2ml離心管。
3.消化把含有107個細胞體積的混懸液轉(zhuǎn)入2ml小管離心沉淀，去凈上清。
4.基因組DNA提取加入1ml內(nèi)含200～400μg/ml的蛋白酶K的DNA抽提液，使其終濃度達300μg/ml，充分攪動混勻，呈粘稠狀，置37℃溫箱過夜。加1ml酚/氯仿/異戊醇混合液于DNA抽提液中，用力震振蕩并顛倒混勻至乳白色，放置3分鐘后，室溫下離心10000rpm，在TGL-16G離心機中離心20分鐘，吸取上清，轉(zhuǎn)入新管重復(fù)抽提1次；取上清約0.6ml，加醋酸鈉0.6ml，2倍體積-20℃預(yù)冷的無水乙醇，輕輕顛倒，可見白色絮狀DNA。然后室溫離心10000rpm 10分鐘，棄上清，沉淀用70％乙醇洗二次，離心去盡上清和管壁液體，室溫干燥，加超凈水約500μl溶解DNA，并檢測DNA的濃度和質(zhì)量。
5.基因組DNA質(zhì)檢和濃度測定取DNA溶液50μl，加水稀釋10倍。用7521-紫外分光光度計測定OD260的值，并計算OD260/OD280之比值，若比值在1.70-1.90之間，則樣品較純，(＜1.7則污染有蛋白質(zhì)，需重復(fù)抽提過程)。樣品DNA含量＝OD260×稀釋倍數(shù)×50μg/ml(1OD260相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA)。
6.基因組亞硫酸氫鹽修飾取含有2μg的DNA溶液樣本，加1mol/L氫氧化鈉，使其終濃度達0.15mol/L，DNA在濃堿液中變性，變性溫度為37℃，變性時間5分鐘。然后加0.5μg的純化硅精，再加入新鮮配制的10mol/L分析純氫醌10μl和2mol/L亞硫酸氫鈉400μl，充分混勻后，加礦物油覆蓋液面，放入調(diào)至50℃溫箱，孵育12小時。
7.修飾后模板DNA純化吸棄礦物油，底物體積約0.5ml，加1.5mg/lDEAE52樹脂，顛倒數(shù)次混勻，推筒連接濾過頭，把樹脂混合物轉(zhuǎn)入推筒，輕柔地插入推動推頭，使混合物通過過濾頭，DNA被吸附在樹脂上，滯溜于過濾頭，同法用異丙醇洗滌過濾頭，并把過濾頭接到1.5ml離心機管口，離心10000rpm，室溫3分鐘，干燥樹脂，然后把過濾頭接到新的離心管。加50μl預(yù)熱至55℃超純水，室溫下放置1分鐘，離心10000rpm，30秒離心洗脫DNA后，加1mol/L氫氧化鈉，使其終濃度達0.2mol/L室溫下5分鐘后終止還原反應(yīng)。加2倍體積-20℃預(yù)冷無水乙醇并在-20℃下過夜，沉淀DNA，0℃下12000rpm，離心13分鐘，棄上清，1ml 70％乙醇洗滌2次去鹽，每次于4℃ 12000rpm，離心5-10分鐘，去凈管壁液體，自然干燥，加20μl超凈水溶解，-20℃保存。
8.MSP反應(yīng)體系 終體積50μl的PCR反應(yīng)體系含1×MSPbuffer，1.5mmol/L的四種核苷酸dTTP、dATP、dCTP、dGTP共5μl，7mmol/L MgCl2，300ng primer(單個)，修飾后模板DNA(MoDNA)1μg，Taq酶2u，具體配制如下P15M P15U10×buffer(甲基化PCR) 5μl 5μldNTP 5μl 5μlMgCl210μl10μlP15M1，P15M22μl(單個)P15U1，P15U22μl(單個)MoDNA 10μl10μlTaq酶 2u 2uMSP反應(yīng)條件加H2O至50μl，混勻后30μl消毒石臘油覆蓋，輕微離心收集，并按下列條件做三次第一次首先93℃變性10min，再按93℃ 45S→55℃ 45S→70℃ 45S做30個循環(huán)，然后70℃延伸10min，第二次94℃變性8min，再按94℃ 40S→55℃40S→71℃ 40S做28個循環(huán)，然后71℃延伸10min，第三次95℃變性5min，再按95℃ 35S→55℃ 35S→72℃ 35S做25個循環(huán)，然后72℃延伸5min，產(chǎn)物4℃下保存。
MSP反應(yīng)中放入Raji和HL60細胞株，分別做陽性和陰性對照。同時，設(shè)不加模板MoDNA作空白對照。
9.MSP特異度和靈敏度測定以野生型DNA，MoDNA兩種類型模板測定Raji，HL60，K562的P15M和P15U PCR擴增，了解其特異性。將Raji和HL60按1∶10，1∶102，1∶103，1∶104，1∶105，1∶106混合后進行P15甲基化的MSP，測定其靈敏度。
10.檢測樣本結(jié)果可選以下二種方法中的一種①產(chǎn)物加1.8％的瓊脂糖加溴乙錠，在1.5～2.5v/cm下電泳45～60分鐘，在紫外檢測儀下觀察結(jié)果，并照像；在凝膠電泳分析系統(tǒng)上分析結(jié)果，②將產(chǎn)物用熒光試劑標(biāo)記，做等電聚焦定量PCR檢測。
應(yīng)用實施例2～10不成熟B系細胞株Raji為P15基因甲基化陽性的細胞株，均為中山醫(yī)腫瘤醫(yī)院研究所贈HL60為P15基因非甲基化陽性的髓系細胞株；K562為P15基因純合缺失的紅-巨核系細胞株由本室提供。除以下部分不一樣之外，與應(yīng)用實施例1相同。
(一)基因組亞硫酸氫鹽修飾應(yīng)用實施例序號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10加氫氧化鈉終濃度(mol/L) 0.15 0.15 0.2 0.2 0.3 0.3 0.4 0.4 0.25 0.2537℃下變性時間(分鐘)5 6 7 8 9 105 8 1015硅精加入量μg 0.51 0.6 070.8 0.9 1.0 1.2 1.4 1.6 2.0氫醌加入量μl 10121520253035202530亞硫酸氫鈉加入量μl 400 420 440 460 490 520 550 580 500 480修飾溫度℃ 50515253545556575860孵育時間小時12131415151616171718(二)修飾后模板DNA純化DEAE52樹脂(mg) 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.2 1.3 1.4 1.5加純水的溫度(℃)55586265687072756065加氫氧化鈉終濃度mmol/L 0.2 0.2 0.25 0.25 0.3 0.30 0.35 035 0.4 0.4(三)MSP反應(yīng)體系dNTP(μl) 5 5.5 5.75 6.0 6.25 6.5 6.75 7.0 7.5 8.0MgCl(μl) 10111213141516171819P15U1，P15U2(μl) 10111213141516171819P15M1，P15M2(μl) 10111213141516171819MoDNA(μl) 8 8 9 9 101011111212Taq酶(u)1.0 1.5 2.0 2.0 2.5 2.5 3.0 3.0 3.5 4.0
(四)MSP反應(yīng)條件加H2O至50μl，混勻加30μl石臘油，離心收集，并按下列條件做三次應(yīng)用實施例2和7第一次首先93℃變性10min，再按93℃ 45S→58℃ 45S→70℃ 45S做30個循環(huán)，然后70℃延伸10min；第二次94℃變性8min，再按94℃ 40S→58℃ 40S→71℃ 40S做28個循環(huán)，然后71℃延伸8min；第三次95℃變性5min，再按95℃ 35S→58℃ 35S→72℃ 35S做25個循環(huán)，然后72℃延伸5min，產(chǎn)物4℃下保存。
應(yīng)用實施例3和8第一次首先93℃變性10min，再按93℃ 45S→60℃ 45S→70℃ 45S做30個循環(huán)，然后70℃延伸10min；第二次94℃變性8min，再按94℃ 40S→60℃ 40S→71℃ 40S做28個循環(huán)，然后71℃延伸10min；第三次95℃變性5min，再按95℃ 35S→60℃35S→72℃ 35S做25個循環(huán)，然后72℃延伸5min，產(chǎn)物4℃下保存。
應(yīng)用實施例4和9第一次首先93℃變性10min，再按93℃ 45S→62℃ 45S→70℃ 45S做30個循環(huán)，然后70℃延伸10min；第二次94℃變性8min，再按94℃ 40S→62℃ 40S→71℃ 40S做28個循環(huán)，然后71℃延伸10min；第三次95℃變性5min，再按95℃ 35S→60℃ 35S→72℃ 35S做25個循環(huán)，然后72℃延伸5min，產(chǎn)物4℃下保存。
應(yīng)用實施例5和10第一次首先93℃變性10min，再按93℃ 45S→65℃ 45S→70℃ 45S做30個循環(huán)，然后70℃延伸10min；第二次94℃變性8min，再按94℃ 40S→65℃ 40S→71℃ 40S做30個循環(huán)，然后71℃延伸8min；第三次95℃變性5min，再按95℃ 35S→65℃ 35S→72℃ 35S做30個循環(huán)，然后72℃延伸5min，產(chǎn)物4℃下保存。
實施例6的MSP反應(yīng)條件同實施例1。
權(quán)利要求
1.CpG島甲基化檢測試劑盒，其特征在于它包含有下列藥物(1)引物利用人類基因組的基因序列，根據(jù)堿基錯配原理，引物選自細胞周期上二個基因即P15INK4B，P16INK4A基因，胰癌基因CPG，蛋白激酶相關(guān)蛋白基因CPG，乳腺癌基因2CPG，急性白血病相關(guān)基因，基因調(diào)節(jié)因子3基因，基因調(diào)節(jié)因子27基因，GTP激酶相關(guān)蛋白27基因，GTP激酶相關(guān)蛋白基因27B，GTP激酶相關(guān)蛋白基因2L引物中的任何一種；(2)提取模板DNA的藥物①內(nèi)含200～400μg/ml的蛋白酶K的DNA提取液，②飽和酚/氯仿/異戊醇體系，它們的體積比為20～25∶20～25∶1，③醋酸鈉，④淋巴細胞分層液；(3)基因組修飾用藥物①硅精，②氫醌，③亞硫酸氫鈉，④礦物油；(4)基因組修飾后的DNA純化用藥物①DNA純化用DEAE樹脂，②異丙醇；(5)特異性MSP-PCR反應(yīng)體系①甲基化PCR緩沖液，10×buffer，②四種核苷酸即dNTP，③MgCl2，④耐高溫聚合酶即Taq酶；(6)陽性和陰性對照標(biāo)本①陽性標(biāo)本甲基化Raji細胞，②陰性標(biāo)本非甲基化HL60細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CpG島甲基化檢測試劑盒，其特征在于引物是下列引物中的一種胰癌基因CPG引物AGTGGAGGACAAGTCAGGGGGGGCTTCGAGAGGACAGAG蛋白激酶相關(guān)蛋白基因CPG引物TCTATGCCACTGTTGGGGTTAAGGGAGCTCCAAAATCTCCT乳腺癌基因2CPG引物TCCGTCAGATACTGACGGTTGGCAGAGACAAAAGGGCAAGAAG急性白血病相關(guān)基因引物TCACMACACTTGCCCTCTCTAGGAAGACAGTGACGAAGACC基因調(diào)節(jié)因子3基因引物CTCTGACCTCCACTCACTCATAGCCTGTGCTCCTCCTGTGAG基因調(diào)節(jié)因子27基因引物ATAGCCCTGGACATCACTGCCGAGAGAGTGTGTTTCTCACTGGTP激酶相關(guān)蛋白27基因引物GTCTTCTTTGCAAGGATTTCTGCATACCTGGTACGCTGCTGATTGTP激酶相關(guān)蛋白基因27B引物TTTGAAAGGGTCAGTCCTCCTCATCCAAAGATACAGCATCTAAGTP激酶相關(guān)蛋白基因2L引物AAAACAGCGTAGAGCCTGAGAAGAAAGATAAACATCCAAGCTCTTCCP16基因引物M1GAGTACTTGGGGTGTGGCACTM2GATAACGATTCACAGACATTCP15引物M1CGTTCGTATTTTGCGGTTM2GTACAATAACCGAACGACCGA
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CpG島甲基化檢測試劑盒，其特征在于提取模板DNA的藥物中飽和酚是指用50mmol/L的三羥甲基氨基甲烷飽和的酚；飽和酚/氯仿/異戊醇體積比為24∶24∶1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CpG島甲基化檢測試劑盒，其特征在于基因修飾用藥物中硅精是指用常規(guī)DNA純化方法純化過的硅精，氫醌和亞硫酸氫鈉均采用分析純干粉。
5.CpG島甲基化檢測試劑盒的應(yīng)用，包括常規(guī)標(biāo)本的收集；基因組DNA提取、修飾和純化，其特征在于(1)基因組修飾中①純化硅精DNA用量為0.51～2μg/份，②氫醌的新鮮配制將10～13mg的氫醌定容在10ml超凈水中，③亞硫酸氫鈉的新鮮配制將2.9～3.2g的亞硫酸氫鈉定容在10ml超凈水中，④修飾的溫度50～60℃，⑤孵育時間為12～18小時；(2)修飾后模板DNA純化中①DEAE樹脂加入量為0.5～1.5mg，②用異丙醇洗滌并過濾后離心，③干燥樹脂，④加入50～60μl的預(yù)熱至55～75℃超凈水中，并離心，⑤加入1mol/L的氫氧化鈉，使其終濃度達0.2～0.4mmol/L、置室溫保存，⑥加無水乙醇并在-20℃下過夜，⑦0℃離心，⑧70％乙醇洗滌后干燥，⑨超凈水溶解后，-20℃保存；(3)特異性PCR即MSP反應(yīng)體系配制如下①反應(yīng)體積50μlPM PU10×buffer 5μl 5μlDNTP5～8μl 5～8μlMgCl210～15μl10～15μlPM或PU 2～4μlMoDNA 8～10μl 8～10μlTaq酶 1～4u1～4u加H2O至50ml，加50ml石蠟油②反應(yīng)條件將上述體系放入PCR機中進行如下反應(yīng)首先93～95℃變性5～10min，然后按93～95℃ 30～45S→55～65℃ 30～45S→70～72℃ 30～45S的次序做24～34個循環(huán)，70～72℃延伸5～10min，產(chǎn)物4℃下保存?zhèn)溆茫?4)陰陽性對照MSP反應(yīng)中放Raji和HL60細胞株分別做陽性和陰性對照，設(shè)不加模板DNA即MODNA作空白對照；除上述之外的其他應(yīng)用過程均為常規(guī)技術(shù)，所用藥物均為分析純。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的CpG島甲基化檢測試劑盒的應(yīng)用，其特征在于特異性PCR即MSP反應(yīng)條件為按94℃ 35S→58℃ 35S→71℃ 35S做25個循環(huán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的CpG島甲基化檢測試劑盒的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用過程中所用離心均選9000～12000rpm。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因檢測技術(shù),具體是指用于腫瘤診斷、去甲基化藥物篩選的CpG島甲基化檢測試劑盒及其應(yīng)用。本試劑盒主要包含引物、提取模板DNA的藥物、基因組修飾用藥物、DNA純化用藥物、特異性MSP－PCR反應(yīng)體系和陽性和陰性對照標(biāo)本。本發(fā)明利用人類基因的基因序列,根據(jù)堿基錯配原理設(shè)計引物,它們可選自細胞周期上二個基因即P
文檔編號C12Q1/68GK1357636SQ0112996
公開日2002年7月10日 申請日期2001年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月27日
發(fā)明者郭秀枝 申請人:暨南大學(xué)