專利名稱：蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽及獲得方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學技術領域。具體地說是一種蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽及獲得方法。
背景技術：
蝎又稱全蟲、全蝎，在“詩經”、“開寶本草”、“本草綱目”等古代醫(yī)學名著中對其藥用性進行了詳細描述，具有祛風鎮(zhèn)驚，通絡止痛，攻毒散解等功能。用于小兒驚風，抽搐痙攣，中風口堝，半身不遂，風濕頑痹，偏、正頭痛，神經痛，軀身銳痛，瘡瘍瘰疬，各類惡性腫瘤等。但全蝎中究竟哪一種成分在發(fā)揮通絡止痛，攻毒散解的功能，一直不很清楚。
發(fā)明內容
本發(fā)明是利用生物技術，從蝎毒中篩選、分離、純化發(fā)現(xiàn)并得到一種鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽。該鎮(zhèn)痛抗腫瘤活性肽不僅可從全蝎或蝎毒中分離純化制備；也可通過重組DNA技術即基因工程方法表達獲得；也可通過化學合成獲得。該活性肽具有顯著的鎮(zhèn)痛和抗腫瘤生物活性。
本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)利用全蝎或蝎毒中蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的分子量、等電點、分子表面的疏水性與其它蛋白質、多肽、酶的差異，單獨或綜合借助這些差異，通過超濾；膠過濾、離子交換、疏水、反相層析方法，從全蝎或蝎毒中抽提、分離、純化，獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽，該活性肽的結構見說明書附圖1、根據(jù)該活性肽的結構，利用化學合成方法獲得該蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽或該蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的部分片段或該蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的衍生物、類似物。根據(jù)該活性肽的結構，利用化學合成方法或生物技術獲得該蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽或該蝎鎮(zhèn)壓痛抗腫瘤纈精甘肽的部分片段或該蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的衍生物、類似物的基因，通過重組DNA技術即基因工程方法，克隆至基因工程表達載體中，經表達、純化獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽或該蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的部分片段或該蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的衍生物、類似物。本發(fā)明所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽或該蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的部分片段或該蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的衍生物、類似物不僅可作為治療各種疼痛和腫瘤疾病的藥物，也可作為研究工具，用于鎮(zhèn)痛、抗腫瘤的新化合物的篩選。蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的抽提、分離、純化操作在10℃～30℃半無菌或無菌室進行。本發(fā)明所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽或該蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的部分片段或該蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的衍生物、類似物的獲得方法常規(guī)、簡單、產量高，對研制開發(fā)蝎鎮(zhèn)痛抗捉瘤纈精甘肽類藥物具有重要的指導意義和實用價值，為工業(yè)化生產和實用化奠定了基礎。
圖1為蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽氨基酸序列及基因序列。
圖2為蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽類似物氨基酸序列。
圖3為蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽衍生物氨基酸序列。
圖1基因序列中N代表A或T或C或G堿基，P代表A或G堿基，M代表C或T堿基。
具體實施例方式實施例1蝎毒2.0克溶于20毫升蒸餾水后，15000轉/分離心15分鐘，取上清液用0.01M鹽酸或磷酸溶液調PH為2，15000轉/分離心15分鐘，取上清液用磷酸鈉溶液調pH為12，15000轉/分離心15分鐘。取上清液用鹽酸或磷酸水溶液調pH在生理條件下，加(HN3)2SO4或Na2SO4至2M濃度，上樣于預先用2M(HN3)2SO4或Na2SO4溶液平衡的疏水層析柱(2.6cm×30cm)，如苯基-或正辛烷-疏水層析，分別用1.5M、1.0M、0.5M(HN3)2SO4或Na2SO4緩沖液洗脫，最后用50mM磷酸鈉緩沖液(pH在生理條件下)洗脫，將具有鎮(zhèn)痛抗腫瘤活性組份的洗脫液合并，分別用截留分子量為30kDa、1kDa(千道爾頓)范圍的超濾膜進行上述合并超濾，以除去該洗脫液中鹽和雜蛋白，最后用10mM pH4.0檸檬酸-磷酸鈉緩沖液平衡，將平衡好的30kDa、1kDa(千道爾頓)范圍的超濾樣品液上樣于預先用10mM pH4.0檸檬酸-磷酸鈉緩沖液平衡好的陽離子交換層析柱(2.6cm×50cm)，如CM-、SP-等陽離子交換層析添料，先用10mM pH4.0檸檬酸-磷酸鈉緩沖液充分洗滌，以10mM pH4.0檸檬酸-磷酸鈉緩沖液為基礎液，進行NaCl濃度梯度(0.0M～1.0M)洗脫，合并具有鎮(zhèn)痛抗腫瘤活性組份的洗脫液，用氫氧化鈉或鹽酸或磷酸水溶液調pH在。。生理條件下，加(HN3)2SO4或Na2SO4至2.0M濃度，上樣于預先用2M(HN3)2SO4或Na2SO4溶液平衡的疏水層析柱(2.6cm×30cm)，如至丁基—或至辛烷—疏水層析添料，以50mM磷酸鈉緩沖液(pH在生理條件下)為基礎液，進行中性鹽濃度梯度(2.0M～0.0M)洗脫，合并收集兩個洗脫峰的第二個峰，用截留分子量為1kDa(千道爾頓)的超濾膜進行超濾濃縮，樣品液上樣于預先用20mM磷酸鈉緩沖液(pH在生理條件下，含150mM NaCl)平衡好的凝膠過濾層析柱(1.6cm×60cm)，如Sephacry1 S-100HR或Superose6、12prep grade或Superdex30、75prep grade層析添料，合并收集洗脫峰面積最大的洗脫峰組分，該組分在SDS-PAGE為單一銀染色區(qū)帶，將凝膠過濾所得的活性組分，上樣于預先用0.1％三氟醋酸-20％乙腈水溶液平衡好的反相層析柱(1.0cm×15cm)，如SURCE 15RPC、30PRC層析添料，先用0.1％三氟醋酸-20％乙腈水溶液充分洗滌，而后進行乙腈濃度梯度(20％至95％)洗脫，合并收集洗脫峰面積最大的洗脫峰組分，該組分脫峰面積占整個反相層析洗脫峰面積的95％以上。
實施例21000克全蝎加2.5升蒸餾水勻漿后，4500轉/分離心20分鐘，收集上清液，沉淀加1.5升蒸餾水勻漿后，4500轉/分離心20分鐘，收集上清液，沉淀加1.0升蒸餾水勻漿后，，4500轉/分離心20分鐘，收集上清液，合并上述三次抽提液，用0.01M鹽酸或磷酸溶液調pH為2，5000轉/分離心15分鐘，取上清液用磷酸鈉溶液調pH為12，5000轉/分離心15分鐘。其他操作同實施例1。
實施例3按蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的結構(氨基酸序列見說明書附圖1)，合成核苷酸片段，通過雜交篩選從蝎eDNA池(pool)或cDNA庫或DNA庫中篩選獲蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽全長基因(基因序列見說明書附1)或其衍生物、類似物基因片段或者它們部分片段基因。如從人工飼養(yǎng)的蝎獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽全長基因為說明書附圖1的基因序列，從野生的蝎獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽全長基因序列，除編碼第24位、第29位氨基酸的密碼子為GAC、AAT外，其它的與人工飼養(yǎng)的基因序列一致。
實施例4以蝎鎮(zhèn)痛抗捉瘤纈精甘肽的N端、C端氨基酸序列設計PCR簡并引物，如引物15’GGAATTCCATGGTACGCGATGGTTATAT3’(GTA CGC GAT GGTTAT編碼蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽第1～5位氨基酸)，引物25’TTGCTCGAGACCGCCATTGCATTTTGG3’(ACC GCC ATT GCA TTT TGG為編碼蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽第61～66位氨基酸的互補鏈序列)(獲得重組蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽類似物氨基酸序列見說明書附圖2)。引物35’CAAGCATATGGTACGATGGTTATAT3’(GTA CGCGAT GGT TAT編碼蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽第1～5位氨基酸)，引物45’ATAGGATCCTATTAACCGCCATTGCATTTTGG3’(ACC GCC ATT GCA TTTTGG編碼蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽第61～66位氨基酸的互補鏈序列)(獲得重組蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽衍生物氨基酸序列見說明書附圖3)。經PCR反應可從cDNA池(pool)或cDNA庫或DNA庫中篩選獲得蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽全長基因或其衍生物、類似物基因片段或者它們的部分片段基因。
實施例5按說明書附圖1、附圖2、附圖3所示蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽或其衍生物、類似物的結構(氨基酸序列)，人工合成蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽全長基因或其衍生物、類似物基因片段或者它們的部分片段基因。
實施例6將從實施例3、4、5獲得的基因，經限制性內切酶消解，克隆的在各種基因工程表達載體中，如將從實施例4中獲得的PCR產物，經限制性內切酶NcoI、Xho I消解或Nde I、BamH I消解，克隆在大腸桿菌表達載體pET28a中，經表達、后處理、分離和純化獲得重組蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽及其延長的或縮短的衍生物、類似物(氨基酸序列見說明書附圖2、3)。
實施例7從實施例1、2、6獲得的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽或該蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的部分片段或該蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的衍生物、類似物，在小鼠醋酸扭體模型，靜脈注射給予上述樣品，劑量在0.1mg/kg體重至16.0mg/kg體重，小鼠扭體反應抑制率在0.0％至100％，如從實施例1獲得的SDS-PAGE單一區(qū)帶的蝎鎮(zhèn)痛抗捉瘤纈精甘肽的ED50(半數(shù)有效量)為0.47mg/kg體重，靜脈注射給予陽性對照藥-嗎啡的ED50(半數(shù)有效量)為1.2mg/kg體重；灌胃給予上述樣品，劑量在0.1mg/kg體重至16.0mg/kg體重，小鼠扭體反應抑制率在0.0％至100％，如從實施例2獲得的SDS-PAGE單一區(qū)帶的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的ED50(半數(shù)有效量)為2.86mg/kg體重。在小鼠熱板法模型，靜脈注射給予上述樣品，劑量在0.1mg/kg體重至16.0mg/kg體重，小鼠痛閾值(在55℃±5℃熱板上舔后足所需時間)為正常值(10秒至30秒)至60秒(如果痛閾值超過60秒，小鼠仍不舔后足，則取出小鼠)，如從實施例1、2獲得的SDS-PAGE單一區(qū)帶的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽，靜脈注射給予0.6mg/kg體重，在5分鐘、15分鐘、25分鐘、35分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘的痛閾提高率分別為16.5％、145.7％、219.1％、219.1％、177.6％、32.4％、14.9％，而靜脈注射給予10.0mg/kg體重嗎啡的痛閾提高率則分別為0.6％、27.0％、112.6％、177.9％、125.8％、50.9％、-3.7％。
實施例8在小鼠實驗性腫瘤模型(如艾氏腹水癌、S180實體瘤)，從實施例1、2、6獲得的蝎鎮(zhèn)痛抗捉瘤纈精甘肽或該蝎鎮(zhèn)痛抗捉瘤纈精甘肽的部分片段或該蝎鎮(zhèn)痛抗捉瘤纈精甘肽的衍生物、類似物，皮下注射給予0.1mg/kg體重至16.0mg/kg體重，連續(xù)給樣七天，對S180肉瘤實體型腫瘤的瘤重抑制率[(C-T)/C；C對照組平均瘤重，T樣品組平均瘤重]為0％至62％，如從實施例1獲得的SDS-PAGE單一區(qū)帶的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽，劑量為0.639mg/kg體重，對瘤重抑制率為30.9％；而陽性對照藥環(huán)磷酰胺，劑量為60.0mg/kg體重，對瘤重抑制率為50.5％。灌胃給予0.1mg/kg體重至16.0mg/kg體重的從實施例1、2、6獲得的蝎鎮(zhèn)抗腫瘤纈精甘肽或該蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的部分片段或該蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的衍生物、類似物，連續(xù)給樣十天，對艾氏腹水癌小鼠的生命延長率為0％至46％，如從實施例2獲得的SDS-PAGE單一區(qū)帶的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽，劑量為0.213mg/kg體重、0.639mg/kg體重，其生命延長率分別為16.8％、31.5％；而陽性對照藥環(huán)磷酰胺，劑量為60.0mg/kg體重(皮下注射給予)，其生命延長率為15.6％。
權利要求
1.蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽，它包括氨基酸序列，其特征在于從蝎毒或全蝎抽提、分離、純化獲得。
2.如權利要求1所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的生產方法，它包括(1)蝎毒分別用蒸餾水、酸性溶液、堿性溶液溶解抽提，離心除去雜質，(2)抽提液經疏水層析柱分得鎮(zhèn)痛抗腫瘤活性組分，(3)將所得鎮(zhèn)痛抗腫瘤活性組分經超濾，以除去鹽和雜蛋白，同時進行濃縮，通過陽離子交換層析柱純化得到鎮(zhèn)痛抗腫瘤活性組分，(4)經疏水層析柱進一步純化得到鎮(zhèn)痛抗腫瘤活性組分，(5)通過超濾，除去鹽和濃縮，經凝膠過濾層析柱獨得電泳純蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽，(6)經反相層析柱可進一步純化，其特征在于a、蝎毒用蒸餾水溶解抽提，抽提液在酸性溶液(溶液pH值大于等于2)、堿性溶液(溶液pH值小于等于12)沉淀雜質，蝎毒溶液pH值在2～12范圍內，蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽可溶且不失活；b、蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤活性組分經兩次疏水層析分離純化，層析介質是苯基-或正辛烷-或丁基-疏水層析添料，磷酸鈉洗脫液pH值在生理條件下，其磷酸根濃度在5mM～100nM，(HN3)2SO4或Na2SO4的濃度梯度在2.0M～0.0M；c、蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤活性組分或活性肽進行超濾除去鹽、雜蛋白和濃縮，超濾膜的截留分子量為30kDa(千道爾頓)或1kDa(千道爾頓)；d、蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽進行凝膠過濾層析，介質是Sephacry1 S-100HR或Superose 6 prep grade或Superose 12 prep grade或Superdex 30 prep grade或Superdex 75 prep grade層析添料，洗脫液的pH值在2～12范圍內；e、蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽進行反相層析，介質是SOURCE 15RPC或SOURCE30RPC層析添料，洗脫液為0.1％三氟醋酸-乙腈水溶液，乙腈濃度梯度洗脫為20％至95％；f、蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的抽提、分離、純化操作在10℃～30℃半無菌或無菌室進行；
3.根據(jù)權利要求2所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的生產方法，它包括(1)全蝎首先在蒸餾水中進行勻漿抽提活性組分，抽提液分別在酸性溶液、堿性溶液沉淀雜質，離心除去雜質，(2)抽提液經疏水層析柱分得鎮(zhèn)痛抗腫瘤活性組分，(3)將所得鎮(zhèn)痛抗腫瘤活性組分經超濾，以除去鹽和雜蛋白，同時進行濃縮，通過陽離子交換層析柱純化得到鎮(zhèn)痛抗腫瘤活性組分，(4)經疏水層析柱進一步純化得到鎮(zhèn)痛抗腫瘤活性組分，(5)通過超濾，除去鹽和濃縮，經凝膠過濾層析柱獨得電泳純蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽，(6)經反相層析柱可進一步純化，其特征在于a、全蝎在蒸餾水中勻漿抽提，抽提液分別在酸性溶液、堿性溶液中沉淀雜質，溶液pH值分別大于等于2、小于等于12，溶液pH值在2～12范圍內，蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽可溶且不失活；b、蝎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤活性組分經兩次疏水層析分離純化，層析介質是苯基-或正辛烷-或丁基-疏水層析添料，磷酸鈉洗脫液的磷酸根濃度在5mM～100nM，(HN3)2SO4或Na2SO4的濃度梯度在2.0M～0.0M；c、蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤活性組分或活性肽進行超濾除去鹽、雜蛋白和濃縮，超濾膜的截留分子量為30kDa(千道爾頓)或1kDa(千道爾頓)；d、蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽進行凝膠過濾層析，介質是Sephacry1 S-100HR或Superose 6 prep grade或Superose 12 prep grade或Superdex 30 prep grade或Superdex 75 prep grade層析添料，洗脫液的pH值在2～12范圍內；e、蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽進行反相層析，介質是SOURCE 15RPC或SOURCE30RPC層析添料，洗脫液為0.1％三氟醋酸-乙腈水溶液，乙腈濃度梯度洗脫為20％至95％；
4.根據(jù)權利要求1所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽，蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的部分片段或蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的衍生物、類似物，其特征在于以權利要求1的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽為基礎，所獲得的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的部分片段或蝎鎮(zhèn)痛的抗腫瘤纈精甘肽的衍生物、類似物。
5.根據(jù)權利要求1所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽，其特征在于蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽基因為根據(jù)權利要求1編碼蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽；
6.根據(jù)權利要求1所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽，蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的部分片段或蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的衍生物、類似物基因，其特征在于根據(jù)權利要求4編碼蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽折部分片段或蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的衍生物、類似物。
7.根據(jù)權利要求1或5或6所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽，蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽基因或蝎鎮(zhèn)痛抗捉瘤纈精甘肽的部分片段基因或蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的衍生物、類似物基因獲得的方法，其特征在于a、基因可利用化學合成方法獲得；b、基因可通過雜交篩選從蝎cDNA池(pool)或cDNA庫或DNA庫中篩選獲得；c、基因可利用其序列設計引物，通過PCR反應從蝎cDNA池(pool)或cDNA庫或cDNA庫中篩選獲得；
8.根據(jù)權利要求1或4或5或6或7所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽，蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽或蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的部分片段或蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的衍生物、類似物獲得的方法，其特征在于a、可通過重組DNA技術即基因工程方法表達、加工、純化、制備獲得；b、可通過化學合成方法合成、加工、純化、制備獲得；
9.根據(jù)權利要求1或2或3或4或6或8所述的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽，其特征在于所獲得的蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽或蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的部分片段或蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的衍生物、類似物具有顯著的鎮(zhèn)痛、抗腫瘤的生物活性，可作為加工、制備、制造、生產用于鎮(zhèn)痛、抗腫瘤的藥物。
全文摘要
本發(fā)明是一種蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽及其制法,蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽來源于蝎或蝎毒;蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽及其部分片段、衍生物、類似物的基因可由蝎或通過化學一成獲得者;蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽或其部分片段或其衍生物、類似物可通過化學合成生產制備;蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽或蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽的部分片段或其衍生物、類似物可通過基因工程技術生產制備;蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽或其部分片段或其衍生物、類似物能作為鎮(zhèn)痛、抗腫瘤的藥物。
文檔編號C12N15/12GK1341662SQ0112823
公開日2002年3月27日 申請日期2001年9月30日 優(yōu)先權日2001年9月30日
發(fā)明者張景海, 馬潤林, 王思玲, 吳春福 申請人:沈陽藥科大學