專利名稱：重組人血小板生成因子cDNA序列及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組人血小板生成因子的cDNA序列，特別是涉及可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組人血小板生成因子cDNA序列。
背景技術(shù)：
血小板生成因子(TPO)是由巨核細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，早期認(rèn)為它在血小板生成晚期發(fā)揮作用。1994年TPO cDNA克隆成功，從而使得對(duì)血小板生成因子的研究更加深入。TPO cDNA全長(zhǎng)1774bp，其中編碼區(qū)為1059bp，編碼353個(gè)氨基酸，其中前21個(gè)氨基酸為前導(dǎo)肽，成熟過程中被切除。從其結(jié)構(gòu)上看，它可以分為兩部分，N端區(qū)和C端區(qū)，其N端區(qū)與紅細(xì)胞生成因子(EPO)同源性較高，稱為EPO樣結(jié)構(gòu)區(qū)，而且僅此結(jié)構(gòu)區(qū)即具有完整TPO分子的功能。TPO與EPO不但在結(jié)構(gòu)上有很多相同之處，而且在功能的發(fā)揮方面亦有某些相似之處，因此有人稱TPO為血小板的EPO。
TPO的主要功能是促進(jìn)血小板生成。除此以外亦具有作用于造血祖細(xì)胞，直接調(diào)控巨核細(xì)胞祖細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及紅細(xì)胞的生長(zhǎng)及成熟，在各種情況下維持血小板的水平。由于其作用的獨(dú)特性，國(guó)內(nèi)外專家普遍認(rèn)為，TPO是臨床治療血小板減少癥的極為有效的潛在藥物。
一個(gè)廣泛被證實(shí)的規(guī)律是生物編碼蛋白質(zhì)的基因在密碼子的使用上并非是按照最大表達(dá)量來使用的?；虻谋磉_(dá)與密碼子之間的關(guān)系有兩個(gè)方面的基本結(jié)論1)在不同的生物中，氨基酸在密碼子的使用上有偏愛性。因此，當(dāng)把一種生物的基因?qū)肓硪环N生物時(shí)，往往需要根據(jù)兩種生物密碼子的偏愛性更換密碼子，借以提高其表達(dá)水平；2)即使在同一種生物中，其密碼子的使用也并非總是按照最高表達(dá)量來選擇，而是根據(jù)其生理需要在進(jìn)化過程中形成有差異的選擇。因此，即使在某種生物的工程細(xì)胞系(株)中表達(dá)一個(gè)來自于該生物的基因，其密碼子有時(shí)也需要調(diào)整，才能獲得比較高的表達(dá)量。
因此，為了在宿主細(xì)胞中獲得盡可能高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，一種十分重要的方法，就是在不改變其氨基酸組成的前提下，更換使用頻率高的密碼子。但是，迄今為止，尚未有人對(duì)TPO進(jìn)行過類似的嘗試。
本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，已克隆的TPO基因其密碼子并不符合哺乳動(dòng)物細(xì)胞使用密碼子的偏愛性，尤其是其N-端39個(gè)氨基酸的密碼子使用偏離明顯，導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后可能會(huì)造成其表達(dá)強(qiáng)度的降低。
發(fā)明目的所以，本發(fā)明的目的在于提供一種新的重組人血小板生成因子cDNA序列，它能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)。
技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種新的重組人血小板生成因子cDNA序列，它的前N-39個(gè)氨基酸密碼子發(fā)生了突變，得到的突變密碼子符合哺乳動(dòng)物細(xì)胞使用密碼子的偏愛性。
本發(fā)明所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是例如CHO細(xì)胞，Hela細(xì)胞，小鼠Ltk-(4)細(xì)胞，猴腎VERO細(xì)胞等各種常用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞株。
在本發(fā)明的部分優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的N-39個(gè)氨基酸密碼子分別是5’-atg gag ctg accgagttg ctgctggtg gtgatg ctgctgctcaccgccagg ctgaccctgtcc agc cccgcccct cccgcctgt gac ctgcgcgtgctgagcaagctgcgcgac-3’(SEQ IDNO1)，改變了24個(gè)密碼子，含此序列的完整TPO cDNA稱之為“TPO-1″；5’-atg gag ctaaccgagttg ctcctggtagtaatg ctgctgctcaccgccagg ctgaccctgtcc agc cccgcccct cccgcctgt gac ctacgggtcctcagcaacctg ctgcgggac-3’(SEQ IDNO2)，改變了22個(gè)密碼子，含此序列的完整TPO cDNA稱之為“TPO-2″；5’-atg gag ctg acagagttg ctgctggtg gtgatg ctactcctcaccgctagg ctgaccctgtcc agc cccgcccct cccgcctgt gac ctgcgagtcctgaggaagctactgcgcgac-3’(SEQ IDNO3)，改變了24個(gè)密碼子，含此序列的完整TPO cDNA稱之為“TPO-3″；5’-atg gag ctg acagacttcctgctggtg gtcatg ctactgctcaccgccagg ctgaccctgtcc agc cccgcccct cccgcctgt gac ctgcgtgtactgagcaagctgctg cgcgac-3’(SEQ IDNO4)，改變了25個(gè)密碼子，含此序列的完整TPO cDNA稱之為“TPO-4″。
發(fā)明效果根據(jù)后文實(shí)施例可以看出，當(dāng)在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞例如CHO細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，本發(fā)明的突變序列均在一定程度上提高了TPO基因的表達(dá)水平，尤其是TPO-1提高的水平尤其明顯，比標(biāo)準(zhǔn)TPO提高達(dá)3.15倍。
圖1顯示本發(fā)明所用表達(dá)載體pMSG的圖譜。
優(yōu)選實(shí)施方式實(shí)施例1TPO cDNA的擴(kuò)增一.引物的設(shè)計(jì)根據(jù)國(guó)外已經(jīng)發(fā)表的資料[Vadhan-Raj S.Recombinant human thrombopoietinin myelosuppressive chemotherapy.Oncology(Huntingt)，2001 Jul；15(7，Suppl8)35-8]設(shè)計(jì)擴(kuò)增人TPO cDNA的引物如下正向引物5’-ctcgctagcatggagctgactgaattgctc-3’(SEQ ID NO5)，其中，ctc為保護(hù)堿基，下劃線部分為向表達(dá)載體pMSG(Pharmacia)克隆時(shí)的切點(diǎn)(Nhe I)。
反向引物5’-gcactcgagttacccttcctgagacagattc-3’(SEQ ID NO6)，其中，gca為保護(hù)堿基，下劃線部分為向上述表達(dá)載體克隆時(shí)的切點(diǎn)(Xho I)。
上述引物委托上海生工生物工程有限公司代為合成并進(jìn)行PAGE純化。二.胚肝細(xì)胞總RNA的提取、純化與反轉(zhuǎn)錄取新鮮中國(guó)人胚肝組織約200毫克，在液氮中研至極細(xì)粉末，加入2毫升Trizol試劑(購(gòu)自Invitrogene公司)，按照廠家說明提取純化總RNA。純化的RNA經(jīng)1％瓊脂糖電泳鑒定，完整性良好，可用于反轉(zhuǎn)錄。將上述純化的總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自MBI)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，操作按照廠家的說明書進(jìn)行。電泳檢查證明，獲得的cDNA完整性良好。三.cDNA擴(kuò)增擴(kuò)增條件50微升反應(yīng)體系組成1×PCR反應(yīng)緩沖液，兩種引物濃度均為100pmol/L，鎂離子1.5mmol/L，模板DNA濃度為0.1mmol/L，含5U Pfu DNA聚合酶。上述每管50微升的反應(yīng)體系共進(jìn)行5只管子，已獲得足量的擴(kuò)增產(chǎn)物。
溫度循環(huán)預(yù)變性94度2分鐘；主循環(huán)94度1分鐘，58度1分鐘，72度2.5分鐘，共30個(gè)循環(huán)；后延伸72度5分鐘。
以上循環(huán)完成后在1％瓊脂糖電泳上進(jìn)行鑒定。發(fā)現(xiàn)有一分子量約1kb的單一條帶，與預(yù)期大小相符。用凝膠回收試劑盒(Bio101)對(duì)該片段回收，操作過程按照廠家說明進(jìn)行。得純化的DNA約12微克。四.cDNA的克隆、鑒定與測(cè)序?qū)⑸鲜霁@得的純化的擴(kuò)增產(chǎn)物插入到pGEM-T載體(Promega產(chǎn)品)上。操作步驟按照廠家的說明進(jìn)行，獲得重組DNA。
用常規(guī)方法將上述重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，經(jīng)藍(lán)/白斑篩選獲得陽(yáng)性克隆22個(gè)。酶切鑒定5個(gè)克隆后確認(rèn)4個(gè)帶有目的插入片段。
將上述鑒定出的陽(yáng)性克隆中的2個(gè)進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序工作委托上?；倒驹贏BI377全自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行。序列結(jié)果如下TPO的cDNA序列(5’→3’)001 atggagctga ctgaattgct cctcgtggtc atgcttctcc taactgcaag gctaacgctg tccagcccgg ctcctcctgc ttgtgacctc cgagtcctca101 gtaaactgct tcgtgactcc catgtccttc acagcagact gagccagtgc ccagaggttc accctttgcc tacacctgtc ctgctgcctg ctgtggactt201 tagcttggga gaatggaaaa cccagatgga ggagaccaag gcacaggaca ttctgggagc agtgaccctt ctgctggagg gagtgatggc agcacgggga301 caactgggac ccacttgcct ctcatccctc ctggggcagc tttctggaca ggtccgtctc ctccttgggg ccctgcagag cctccttgga acccagcttc401 ctccacaggg caggaccaca gctcacaagg atcccaatgc catcttcctg agcttccaac acctgctccg aggaaaggtg cgtttcctga tgcttgtagg501 agggtccacc ctctgcgtca ggcgggcccc acccaccaca gctgtcccca gcagaacctc tctagtcctc acactgaacg agctcccaaa caggacttct601 ggattgttgg agacaaactt cactgcctca gccagaacta ctggctctgg gcttctgaag tggcagcagg gattcagagc caagattcct ggtctgctga701 accaaacctc caggtccctg gaccaaatcc ccggatacct gaacaggata cacgaactct tgaatggaac tcgtggactc tttcctggac cctcacgcag801 gaccctagga gccccggaca tttcctcagg aacatcagac acaggctccc tgccacccaa cctccagcct ggatattctc cttccccaac ccatcctcct901 actggacagt atacgctctt ccctcttcca cccaccttgc ccacccctgt ggtccagctc caccccctgc ttcctgaccc ttctgctcca acgcccaccc1001 ctaccagtcc tcttctaaac acatcctaca cccactccca gaatctgtct caggaagggt aa-3’(SEQ ID NO7)測(cè)序結(jié)果表明，我們克隆的TPO cDNA長(zhǎng)度為1062bp，該序列第1008位為T，與GenBank中已經(jīng)登錄的TPO cDNA的堿基(C)不同，但是其編碼的氨基酸未發(fā)生變化，均為Ser。
實(shí)施例二cDNA序列的誘變一.引物的制備本發(fā)明以CHO細(xì)胞宿主為例，對(duì)TPO基因的密碼子使用頻率進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其前39個(gè)氨基酸在密碼子的使用上明顯偏離哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)密碼子使用的偏愛性。因此，確定對(duì)該區(qū)進(jìn)行誘變。
我們使用的分析軟件是DNAstar 3.10版和DNA Analysis 1.0版兩種。這兩種軟件均在設(shè)計(jì)密碼子“基因設(shè)計(jì)”模塊時(shí)考慮到了密碼子的使用頻率(即偏愛性)、相鄰6個(gè)密碼的相關(guān)性以及形成內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)(例如發(fā)夾狀結(jié)構(gòu))的可能性等因素。兩種軟件的分析結(jié)果相互比較后，取在兩個(gè)軟件中均能通過可行性檢查的用于誘變。
因此，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，優(yōu)選的4種誘變引物是5’-atg gag ctg accgagttg ctgctggtg gtgatg ctgctgctcaccgccagg ctgaccctgtcc agc cccgcccct cccgcctgt gac ctgcgcgtgctgagcaagctg ctgcgcgac-3’(SEQ IDNO1)，改變了N-39個(gè)氨基酸中的24個(gè)密碼子；5’-atg gag ctaaccgagttg ctcctggtagtaatg ctgctgctcaccgccagg ctgaccctgtcc agc cccgcccct cccgcctgt gac ctacgggtcctcagcaacctg ctgcgggac-3’(SEQ IDNO2)，改變了N-39個(gè)氨基酸中的22個(gè)密碼子；5’-atg gag ctg acagagttg ctgctggtg gtgatg ctactcctcaccgctagg ctgaccctgtcc agc cccgcccct cccgcctgt gac ctgcgagtcctgaggaagctactgcgcgac-3’(SEQ IDNO3)，改變了N-39個(gè)氨基酸中的24個(gè)密碼子；5’-atg gag ctg acagacttcctgctggtg gtcatg ctactgctcaccgccagg ctgaccctgtcc agc cccgcccct cccgcctgt gac ctgcgtgtactgagcaagctg ctg cgcgac-3’(SEQ IDNO4)，改變了N-39個(gè)氨基酸中的25個(gè)密碼子。
委托上海生工生物工程有限公司合成以上片段。二.定點(diǎn)誘變?nèi)鐚?shí)施例1所述，分別用以上片段取代原正向引物，以實(shí)施例1中克隆的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，均獲得單一條帶。重新克隆到pGEM-T載體上并進(jìn)行雙向測(cè)序。針對(duì)以上四種引物組合分別挑選一個(gè)序列完全正確的克隆。
實(shí)施例三突變cDNA序列的表達(dá)一.真核表達(dá)載體的構(gòu)建按照常規(guī)方法將上述四個(gè)克隆中的插入片段再克隆到表達(dá)載體pMSG(Pharmacia產(chǎn)品，GenBank Accession NumberU13860)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株后，經(jīng)篩選得到對(duì)應(yīng)于上述插入片段的四種不同的克隆，經(jīng)DNA測(cè)序分析，證明其序列正確無誤，分別命名為pMSG TPO-1，pMSG TPO-2，pMSGTPO-3，pMSG TPO-4。載體的圖譜見附圖1。
在大腸桿菌中擴(kuò)增上述四種質(zhì)粒，并用超純質(zhì)粒抽提純化試劑盒(Qiagene產(chǎn)品)，操作參照廠家說明進(jìn)行。制備的超純質(zhì)粒(要保證基本無內(nèi)毒)，用于轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。二.在CHO細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)本研究采用脂質(zhì)體法對(duì)CHO細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogene公司，操作按照廠家的說明書進(jìn)行。
轉(zhuǎn)染后的CHO細(xì)胞經(jīng)連續(xù)3個(gè)月的霉酚酸篩選，其濃度從0.05uM到10uM，每?jī)芍茉黾右淮螡舛?，每次霉酚酸的用量約為前一次的2倍，具體視細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定。細(xì)胞培養(yǎng)按照常規(guī)進(jìn)行，培養(yǎng)基為15％胎牛血清(Gibco)+RPM1640/DEME。于37度5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后按照常規(guī)極度稀釋法進(jìn)行單克隆化。應(yīng)用ELISA方法分別檢測(cè)其活性，總共得到267個(gè)有TPO表達(dá)的單克隆，其中pMSG TPO-1有78個(gè)，pMSG TPO-2有62個(gè)，pMSG TPO-3有66個(gè)，pMSG TPO-4有71個(gè)。經(jīng)ELISA上述所有克隆的TPO表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行了研究，具體數(shù)據(jù)如下基因型TPO-1 TPO-2TPO-3TPO-4 標(biāo)準(zhǔn)TPO平均表達(dá)水平1.07±0.31 0.89±0.43 0.77±0.26 0.96±0.34 0.34±0.23(毫克/升上清)以上數(shù)據(jù)表明，上述四個(gè)突變體均在一定程度上提高了TPO基因的表達(dá)水平，尤其是TPO-1提高的水平尤其明顯，比標(biāo)準(zhǔn)TPO提高達(dá)3.15倍。盡管本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，TPO-1突變體具有最高的表達(dá)強(qiáng)度，但是其他突變體的表達(dá)也有明顯提高。因此，可以推論，該39個(gè)氨基酸編碼區(qū)內(nèi)的突變可能普遍具有提高其表達(dá)的潛力。
序列表<110>上海張江生物技術(shù)有限公司<120>重組人血小板生成因子cDNA序列及其用途<160>7<210>1<211>117<212>DNA<213>引物<400>atggagctga ccgagttgct gctggtggtg atgctgctgc tcaccgccag gctgaccctg 60tccagccccg cccctcccgc ctgtgacctg cgcgtgctga gcaagctgct gcgcgac117<210>2<211>117<212>DNA<213>引物<400>atggagctaa ccgagttgct cctggtagta atgctgctgc tcaccgccag gctgaccctg 60tccagccccg cccctcccgc ctgtgaccta cgggtcctca gcaacctgct gcgggac 117<210>3<211>117<212>DNA<213>引物<400>atggagctga cagagttgct gctggtggtg atgctactcc tcaccgctag gctgaccctg 60tccagccccg cccctcccgc ctgtgacctg cgagtcctga ggaagctact gcgcgac 117<210>4<211>117<212>DNA<213>引物<400>atggagctga cagacttcct gctggtggtc atgctactgc tcaccgccag gctgaccctg 60tccagccccg cccctcccgc ctgtgacctg cgtgtactga gcaagctgct gcgcgac 117<210>5<211>30<212>DNA<213>引物<400>ctcgctagca tggagctgac tgaattgctc 30<210>6<211>31<212>DNA<213>引物<400>gcactcgagttacccttcctgagacagattc 31<210>7<211>1062<212>cDNA<213>人<400>atggagctga ctgaattgct cctcgtggtc atgcttctcc taactgcaag gctaacgctg60tccagcccgg ctcctcctgc ttgtgacctc cgagtcctca gtaaactgct tcgtgactcc120catgtccttc acagcagact gagccagtgc ccagaggttc accctttgcc tacacctgtc180ctgctgcctg ctgtggactt tagcttggga gaatggaaaa cccagatgga ggagaccaag240gcacaggaca ttctgggagc agtgaccctt ctgctggagg gagtgatggc agcacgggga300caactgggac ccacttgcct ctcatccctc ctggggcagc tttctggaca ggtccgtctc360ctccttgggg ccctgcagag cctccttgga acccagcttc ctccacaggg caggaccaca420gctcacaagg atcccaatgc catcttcctg agcttccaac acctgctccg aggaaaggtg480cgtttcctga tgcttgtagg agggtccacc ctctgcgtca ggcgggcccc acccaccaca540gctgtcccca gcagaacctc tctagtcctc acactgaacg agctcccaaa caggacttct600ggattgttgg agacaaactt cactgcctca gccagaacta ctggctctgg gcttctgaag660tggcagcagg gattcagagc caagattcct ggtctgctga accaaacctc caggtccctg720gaccaaatcc ccggatacct gaacaggata cacgaactct tgaatggaac tcgtggactc780tttcctggac cctcacgcag gaccctagga gccccggaca tttcctcagg aacatcagac840acaggctccc tgccacccaa cctccagcct ggatattctc cttccccaac ccatcctcct900actggacagt atacgctctt ccctcttcca cccaccttgc ccacccctgt ggtccagctc960caccccctgc ttcctgaccc ttctgctcca acgcccaccc ctaccagtcc tcttctaaac1020acatcctaca cccactccca gaatctgtct caggaagggt aa 106權(quán)利要求
1.一種新的重組人血小板生成因子cDNA序列，它的前N-39個(gè)氨基酸密碼子發(fā)生了突變，得到的突變密碼子符合哺乳動(dòng)物細(xì)胞使用密碼子的偏愛性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的序列，所述的N-39個(gè)氨基酸密碼子選自5’-atg gag ctg accgagttg ctgctggtg gtgatg ctgctgctcaccgccagg ctgaccctgtcc agc cccgcccct cccgcctgt gac ctgcgcgtgctgagcaagctg ctgcgcgac-3’(SEQ IDNO1)；或5’-atg gag ctaaccgagttg ctcctg gtagtaatg ctgctgctcaccgcc agg ctg accctgtcc agc cccgcccct cccgcctgt gac ctacgggtcctcagcaacctg ctgcgggac-3’(SEQ IDNO2)；或5’-atg gag ctg acagagttg ctgctggtg gtgatg ctactcctcaccgctagg ctgaccctgtcc agc cccgcccct cccgcctgt gac ctgcgagtcctgaggaagctactgcgcgac-3’(SEQ IDNO3)；或5’-atg gag ctg acagacttcctgctggtg gtcatg ctactgctcaccgccagg ctgaccctgtcc agc cccgcccct cccgcctgt gac ctgcgtgtactgagcaagctg ctg cgcgac-3’(SEQ IDNO4)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的序列，所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自CHO細(xì)胞，Hela細(xì)胞，小鼠Ltk-(4)細(xì)胞，猴腎VERO細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1所述序列在生產(chǎn)重組人血小板生成因子中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的重組人血小板生成因子cDNA序列，它的前N－39個(gè)氨基酸密碼子發(fā)生了突變，得到的突變密碼子符合哺乳動(dòng)物細(xì)胞使用密碼子的偏愛性。該序列可有效提高重組人血小板生成因子的生產(chǎn)效率，生產(chǎn)的產(chǎn)品是臨床治療血小板減少癥的極為有效的潛在藥物。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1408861SQ0112680
公開日2003年4月9日 申請(qǐng)日期2001年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月19日
發(fā)明者劉慶法, 王俊林 申請(qǐng)人:上海中信國(guó)健藥業(yè)有限公司