專利名稱：從咸蛋清中提取溶菌酶方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及以咸蛋清為原料提取溶菌酶的技術(shù)。
溶菌酶在醫(yī)藥、食品和化工等領(lǐng)域具廣泛的用途，廣泛存在于動物、植物和微生物中，但多數(shù)材料中溶菌酶的含量很低，不適于大規(guī)模生產(chǎn)，其中以蛋清中的含量最為豐富，因此目前商品化的溶菌酶均來源于新鮮的雞蛋清，但新鮮蛋清價格昂貴，導致生產(chǎn)成本居高，且又與副食品爭奪蛋白原料。隨著溶菌酶應用范圍的擴大，酶的需求量將不斷增加，因而尋找廉價而豐富的溶菌酶新酶源具有重要的意義。眾所周知，在我國咸蛋黃被大量地用來制造月餅等各類食品，咸蛋取黃后留下的咸蛋清因含有高濃度的食鹽和具有異味等原因限制了應用，而常被廢棄，這不僅浪費了蛋白資源，而且對環(huán)境造成嚴重傷害。據(jù)估算僅粵港澳地區(qū)每年因制作蛋黃月餅而產(chǎn)生的咸蛋清就可達2000噸以上，其中大部分被廢棄。我們經(jīng)普查的結(jié)果表明咸蛋清中所含的溶菌酶活力與新鮮的蛋清相當(見表一)，是潛在的溶菌酶生產(chǎn)原料。咸表一咸鴨蛋清與新鮮鴨蛋清中溶菌酶含量的比較 注所抽取的8個批次蛋清均從廣州天河區(qū)各農(nóng)貿(mào)市場隨機購買。蛋清來源豐富，以其為原料生產(chǎn)溶菌酶不僅可變廢為寶，而且可減少對環(huán)境的污染。目前溶菌酶的分離純化大多采用離子交換層析法，該法存在操作繁瑣設(shè)備復雜等問題，如樹脂使用后必須再生和平衡、層析時需采用梯度(或分段)洗脫等操作過程；另外尚存在回收率、純化倍數(shù)和濃縮倍數(shù)均不高等缺點。若以咸蛋清為原料，蛋清中高濃度的食鹽必將嚴重影響離子交換層析這一工藝流程，因而必須先經(jīng)脫鹽處理，這使得本來就十分繁瑣的操作變得更為復雜。
本發(fā)明的目的是利用廉價的咸蛋清為酶源，并建立一套簡便又高效的從咸蛋清中提取溶菌酶的方法。
本法以咸蛋(咸鴨蛋或咸雞蛋)蛋清為原料，將咸蛋清用pH值大于5的溶液稀釋以降低蛋清粘度，攪拌均勻并過濾除去固形殘渣，于濾液中加入抽干并已經(jīng)平衡好的脫氨?；瘹ぞ厶悄z親和吸附介質(zhì)(本介質(zhì)的制備方法已向中國知識產(chǎn)權(quán)局專利局申請專利，申請?zhí)枮?01 14272.0)，開放攪拌吸附或在柱上靜態(tài)吸附，吸附完全后用上述的稀釋溶液充分洗滌凝膠顆粒除去其表面粘附的雜蛋白，待洗滌流出液在280nm波長下的吸光度小于0.1時改用pH值小于4的稀酸溶液洗脫被親和吸附的溶菌酶，收集活性部分，即為純化的溶菌酶。使用后凝膠的再生和平衡只要用相應的蛋清稀釋溶液洗滌至洗滌流出液的pH值與稀釋液一致即可。
蛋清稀釋溶液可用NaHCO3溶液、pH值大于5的磷酸緩沖液、蒸餾水或自來水等。
稀酸洗脫溶液可用0.1mol/L的HAc、0.1mol/L的HCl等。
本法所得的溶菌酶比活力大于70000U/mg蛋白，遠遠超過食品級及醫(yī)藥級的要求；并且回收率可達70％以上。
實施例將50ml咸鴨蛋清用5mmol/L NaHCO3溶液稀釋至400mL，攪拌均勻，兩層紗布過濾，于濾液中加入床體積為100ml的抽干的凝膠吸附劑，該凝膠吸附劑預先已經(jīng)5mmol/L NaHCO3溶液平衡，室溫下開放攪拌100分鐘，于尼龍布上用5mmol/L NaHCO3溶液洗滌凝膠吸附劑直至洗滌流出液在280nm波長下的吸光度小于0.1時，裝柱(2.0×22.0cm)，用0.1mol/L HAc洗脫，收集活性部分，即為純化的咸蛋清溶菌酶。
本法與原有的生產(chǎn)技術(shù)相比，采用了廢棄的咸蛋清作為原料，不僅變廢為寶，而且可減少對環(huán)境的危害；同時所建立的分離純化方法具高效簡便等特點，可直接從含高濃度鹽的咸蛋清中僅經(jīng)親和吸附法一步便獲得高純度的溶菌酶，而不受原料中高濃度食鹽的影響；并且在純化過程中不需要對原料進行加熱調(diào)酸堿度和鹽析分部等任何處理，因而經(jīng)純化操作后留下的蛋清其物化特性幾乎沒有改變，這為后續(xù)的進一步綜合開發(fā)與利用提供了極大的方便。
權(quán)利要求
1.一種從咸蛋清中提取溶菌酶的方法其特征在于以咸蛋清為原料，將咸蛋清用pH值大于5的溶液稀釋，攪拌均勻后過濾以除去固形殘渣，于濾液中加入已經(jīng)平衡好的脫氨酰化殼聚糖凝膠介質(zhì)為親和吸附劑，開放攪拌吸附或在柱上靜態(tài)吸附，待吸附完全后用稀釋溶液充分洗滌凝膠顆粒除去其表面粘附的雜蛋白，至洗滌流出液在280nm波長下的吸光度小于0.1時改用pH值小于4的稀酸溶液洗脫被親和吸附的溶菌酶，收集活性部分，即為純化的溶菌酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的溶菌酶提取方法，其特征在于咸蛋清稀釋液可選用NaHCO3溶液、磷酸緩沖液、蒸餾水或自來水等。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所說的溶菌酶提取方法，其特征在于稀酸洗脫液可選用0.1mol/L的HAc、0.1mol/L的HCl等。
全文摘要
咸蛋黃被廣泛應用于食品加工中,而咸蛋(鴨蛋或雞蛋)取黃后留下的咸蛋清因含有極高濃度的食鹽和異味限制了應用而常被廢棄。本發(fā)明經(jīng)普查表明咸蛋清中尚含有豐富的溶菌酶含量,可以作為生產(chǎn)溶菌酶的原料;進而采用脫氨?；瘹ぞ厶悄z親和吸附法,直接從咸蛋清中僅經(jīng)一步便純化得溶菌酶,所得純化酶的比活力大于70000U/mg蛋白,回收率可達70%。
文檔編號C12N9/36GK1299869SQ0110741
公開日2001年6月20日 申請日期2001年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月4日
發(fā)明者王煒軍, 胡永剛, 徐鳳彩 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學