水稻赤霉素2β－羥化酶基因及其用途的制作方法

專利名稱：水稻赤霉素2β－羥化酶基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與水稻(rice)赤霉素的生物合成有關(guān)的基因及其用途。
背景技術(shù)：
赤霉素(GAs)組成具有稱為ent-赤霉素烷(


圖1A)的基本結(jié)構(gòu)的四環(huán)雙萜類羧酸(tetracyclic diterpenoid carboxylic acids)大家族，它們控制高等植物生命循環(huán)中的許多過程，對于植物的正常生長和發(fā)育是必不可少的(Graebe，J.E.(1987).Ann.Rev.Plant Physiol.，38，419-465；Hooley，R.(1994).Plant Mol.Biol.，26，1529-1555)。具生物活性的GAs，例如GA1通過質(zhì)體中環(huán)化酶，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上與膜結(jié)合的單加氧酶和位于細胞溶膠內(nèi)可溶性2-氧化戊二酸依賴型雙加氧酶(2-oxoglutarate-dependent dioxygenase)的順序作用介導反式-香葉基香葉二磷酸(trans-geranylgeranyl diphosphate)而得以生成(Hedden，P.和Kamiya，Y.(1997).Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48，431-460；Lange，T.(1998).Planta，204，409-419)。GA的生物合成途徑已經(jīng)確定(
圖1B)。2-氧化戊二酸依賴型雙加氧酶催化生物合成途徑中后面的步驟，包括通過GA 20-氧化酶去除C-20和通過GA 3β-羥化酶引入3β-羥基以合成具有生物活性的GAs。第三個雙加氧酶，GA 2β-羥化酶引入2β-羥基導致產(chǎn)生不能轉(zhuǎn)化成活性形式的生物活性喪失的GAs。
近年來，已經(jīng)從許多植物中分離出編碼GA生物合成酶的cDNA和基因組克隆(見Hedden，P.和Kamiya，Y.(1997).Ann.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.，48，431-460；Lange，T.(1998).Planta，204，409-419)。利用這些克隆正在逐步闡清GA生物合成的調(diào)控。例如，已表明GA 20-氧化酶由植物整個發(fā)育進程中一些被不同地調(diào)控的基因所編碼(Phillips，A.L.等(1995).Plant Physiol.，108，1049-1057；Garcia-Martinez，J.L.等(1997).Plant Mol.Biol.，33，1073-1084)。GA 2β-羥化酶在決定具生物活性的內(nèi)源GAs的濃度方面有著重要作用，然而直到最近這些酶基因才被分離出來。通過功能篩選方法(Thomas，S.G.等(1999).Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，4698-4703)從荷包豆(Phaseolus coccineus L.)和鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)中第一次分離出GA 2β-羥化酶基因。
GAs涉及許多發(fā)育進程，包括發(fā)芽，莖的伸長，開花和果實發(fā)育。因此，通過應(yīng)用化學藥品改變GAs的含量來修飾這些進程是普通的農(nóng)學和園藝方法。例如，在無子葡萄生產(chǎn)中用GA 3刺激漿果的生長(Christadoulou，A.J.等(1968) Proc.Am.Soc.Hort.Sci.，92，301-310)，以及將GA生物合成抑制劑用作生長抑止劑以控制谷類作物和觀賞植物的高度(Hedden，P.和Hoad，G.(1994).New YorkMarcel Dekker，pp.173-198)。一種可選的外用化學物質(zhì)的途徑是經(jīng)遺傳處理GAs生物合成而改變其內(nèi)源含量。最近涉及GA生物合成的一些基因的克隆為檢測該途徑的可行性提供了方法。特別是，預計編碼GA 2β-羥化酶的基因的分離為控制轉(zhuǎn)基因植物中生物活性GA含量提供了的非常有用的工具。
許多GA-應(yīng)答性突變體已經(jīng)從各種植物諸如玉米，豌豆，番茄，鼠耳芥屬(Arabidopsis)和水稻(Phinney，B.O.(1956).Proc.Natl.Acad.Sci.USA，42，185-189；Koornneef，M.(1978).Arabidopsis Ins.Serv.，15，17-20；Koornneef，M.等(1990).Theor.Appl.Genet.，80，852-857；Reid，J.B.和Ross，J.J.(1993).Int.J.Plant Sci.，154，22-34；Murakami，Y.(1972).Plant GrowthSubstances 1970.(Carr，D.J.ed.)BerlinSplinger-Verlag，pp.166-174)中分離出來。降低鼠耳芥屬自發(fā)突變體中GA的量所導致的表型表明GAs在莖伸長和開花中起作用(Koornneef，M.和van der Veen，J.H.(1980).Theor.Appl.Genet.，58，257-263；Sponsel，V.M.等(1997).Plant Physiol.，115，1009-1020)。GA1編碼copalyl-二磷酸合酶(copalyl-diphosphate synthase(CPS))。該座位的無效突變在長日照條件下抑制莖的伸長導致沒有抽苔就開花而在短日照條件下既抑制莖的伸長又抑制開花(Wilson，R.N.等(1992).Plant Physiol.，100，403-408；Sun，T.-P.和Kamiya，Y.(1994).Plant Cell，6，1509-1518)。GA4編碼GA 3β-羥化酶(Chiang，H.-H.等(1995).Plant Cell，7，195-201；Williams，J.等(1998).Plant Physiol.，117，559-563)，而GA5和GA6編碼不同的GA 20-氧化酶(Xu，Y.L.等(1995).Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，92，6640-6644；Sponsel，V.M.等(1997).Plant Physiol.，115，1009-1020)。在GA4和GA5中的無效突變產(chǎn)生半-矮小植物而花正常發(fā)育。相比較而言，GA6功能的喪失導致花序變短，生育力降低以及長角果變短(Sponsel，V.M.等(1997).Plant Physiol.，115，1009-1020)。
已經(jīng)分離出水稻GA-缺陷型突變體(dxd35和dyd18)。水稻矮植株突變體具有相當重要的農(nóng)業(yè)意義。例如，由于sd-1突變體是高產(chǎn)及半矮化種的遺傳基礎(chǔ)所以對水稻育種特別重要。水稻d18突變體是GA的應(yīng)答性矮植株，并且已經(jīng)鑒定出復等位基因；從不同的親代生態(tài)型里分離出Housetu-waisei(d18h)，Akibare-waisei(d18-AD)，Kotake-tamanishiki(d18k)和Waito-C(d18-w)。對d18突變體中GA中間體分析證實在這些突變體中阻止向3β-羥基GAs的轉(zhuǎn)化。這導致GA20的內(nèi)源水平升高及具生物活性的GA1的含量急劇降低(Kobayashi，M.等(1988).Plant Cell Physiol.，30(7)963-969；Kobayashi，M.等(1994).Plant Physiol.1061367-1372；Choi Y-H.等，(1995).Plant Cell Physiol.36(6)997-1001)。這些發(fā)現(xiàn)明顯提示D18基因編碼GA 3β-羥化酶并且降低GA1的量會抑制突變體植物莖的伸長。
對于農(nóng)作物和園藝作物包括果樹的育種而言，矮化的特性是最有價值的性狀之一，因為該特性能實現(xiàn)高密度種植，高效的光吸收，降低風害及減少勞作。降低轉(zhuǎn)基因植物中具生物活性的GAs的內(nèi)源含量是可能的。例如，鼠耳芥屬(Arabidopsis)GA 20-氧化酶基因和煙草GA 3β-羥化酶基因的反義表達降低活性GAs的水平，并導致半矮化表型(Coles等，(1999).Plant.J.17，547-556；Itoh等，(1999).Plant.J.20，15-24)。然而，通過這些活化的GA形成酶基因的反義表達產(chǎn)生矮化植物的方法有兩個主要缺點1)很難預見和調(diào)控GA的內(nèi)源水平，因為與要引入反義結(jié)構(gòu)的植物同種的植物中所存在的同源基因的表達，不會受到抑制，并且由于抑制編碼產(chǎn)生不具生物活性的GAs的GA 2β-羥化酶基因的表達，活性赤霉素的半衰期變長。和2)必需要從與要引入反義結(jié)構(gòu)的植物同種的植物中分離相應(yīng)的cDNA。
作為對比，由于作為GA失活酶作用底物的活性GAs的結(jié)構(gòu)在其它植物中得到了保留，GA失活酶基因例如GA 2β-羥化酶基因的超表達，在異源植物種中可能有效。而且，通過修飾轉(zhuǎn)基因的表達容易調(diào)控活性GA含量達到更好的水平。

發(fā)明內(nèi)容
由引導GA失活酶來控制植物GA含量的優(yōu)點得出本發(fā)明。本發(fā)明的主要目的是提供一種源于植物特別是水稻的新的GA 2β-羥化酶基因。本發(fā)明另一目的是通過利用該基因控制植物GA含量來改變植物株型。
GAs的主要代謝途徑是通過2β-羥基化開始啟動，這是一個由可溶的2-氧化戊二酸依賴型雙加氧酶催化的反應(yīng)。為了產(chǎn)生通過控制GA含量改變植物株型的植物，本發(fā)明人已經(jīng)從水稻中分離出GA 2β-羥化酶基因并已鑒定特征。
首先，為了分離水稻的GA 2β-羥化酶基因，基于水稻GA 2β-羥化酶基因，雙加氧酶Marah macrocarpus mRNA，水稻GA 20-氧化酶基因，兩種不同的水稻GA 3β-羥化酶基因及其它2-氧化戊二酸依賴型雙加氧酶基因所編碼的公認氨基酸序列的比較而設(shè)計簡并引物。利用所述引物和水稻基因組DNA(為模板)進行PCR以分離許多獨立的克隆。在所有克隆中，選出推測為編碼GA 2β-羥化酶的克隆，利用其序列信息檢索數(shù)據(jù)庫以獲得水稻EST克隆。接著，利用基于該EST克隆的序列信息所設(shè)計的引物以水稻基因組DNA為模板實施PCR。而且將由此得到的PCR擴增片段用作探針，篩選水稻cDNA文庫和基因組DNA文庫。就可成功的分離編碼水稻GA 2β-羥化酶的基因組DNA和cDNA(編碼水稻GA 2β-羥化酶的克隆稱為“OsGA 2ox1”)。
然后，本發(fā)明人檢測通過在大腸桿菌里表達OsGA 2ox1 cDNA獲得的重組蛋白的活性，確定這些重組蛋白有將C19-GAs和C20-GAs轉(zhuǎn)化成其相應(yīng)的2β-羥基化產(chǎn)物的GA 2β-羥化酶的活性。
對水稻各部分OsGA 2ox1表達的分析揭示出其在分化的葉原基，上皮和糊粉層的底部區(qū)中的定位。
此外，本發(fā)明人培育出表達OsGA 2ox1 cDNAs的轉(zhuǎn)基因水稻以便確定與對照植株相比這些植株為矮化植株。
如上所述，本發(fā)明人成功地分離出新的水稻GA 2β-羥化酶基因，并且利用這些基因培育出與野生型植物相比改變過植物株型的植物。
因此，本發(fā)明涉及新的源于水稻的GA 2β--羥化酶基因，接著特別是利用該基因培育改變過植物株型的植物。更具體的，本發(fā)明提供(1)編碼具有赤霉素2β-羥化酶活性的蛋白的DNA，選自(a)編碼包含SEQ ID NO1中所示氨基酸序列的蛋白的DNA，(b)包含SEQ ID NO2中所示核苷酸序列的編碼區(qū)的RNA的DNA，和(c)編碼包含SEQ ID NO1中所示氨基酸序列的蛋白的DNA，其中一個或更多個氨基酸殘基被取代，缺失，添加，和/或插入；
(2)(1)的DNA，用于產(chǎn)生矮化植物；(3)一種用于抑制內(nèi)源性(1)所述DNA在植物細胞中表達的DNA，選自(a)編碼與(1)的DNA或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的反義RNA的DNA，(b)編碼具有核酶活性的RNA的DNA，所述活性為特異性切割(1)的DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，和(c)編碼一種通過共抑制作用抑制內(nèi)源性(1)的DNA表達的RNA的DNA，該DNA與包含SEQ ID NO2中公開的核苷酸序列的DNA具有70％或更高的同源性；(4)攜帶(1)-(3)中任一項的DNA的載體；(5)一種轉(zhuǎn)化的植物細胞，其攜帶并能表達(1)-(3)中任一項的DNA；(6)含有(5)的轉(zhuǎn)化植物細胞的轉(zhuǎn)基因植物；(7)(6)的轉(zhuǎn)基因植物的繁殖材料；(8)(1)的DNA所編碼的蛋白；(9)產(chǎn)生(8)的蛋白的方法，其中該方法包括對攜有并能表達(1)的DNA的轉(zhuǎn)化細胞進行培養(yǎng)并且從所述細胞或其培養(yǎng)上清中回收表達的蛋白；(10)改變植物生長的方法，其中所述方法包括控制(1)的DNA在植物細胞里的表達水平；(11)改變植物株型的方法，其中所述方法包括控制(1)的DNA在植物細胞里的表達水平；和(12)(10)或(11)的方法，其中(1)-(3)中任一項的DNA在植物細胞中表達。
本發(fā)明提供一種從水稻中分離出的新GA 2β-羥化酶及編碼該酶的DNA。本發(fā)明人所分離出的并且包含在本發(fā)明DNAs中的OsGA 2ox1 cDNA的核苷酸序列及OsGA 2ox1蛋白的氨基酸序列分別在SEQ ID NOs2和1中公開。
OsGA 2ox1 cDNA包含1,146bp的開放式讀碼框，該讀碼框編碼由382氨基酸殘基組成的蛋白。所述cDNA編碼的蛋白具有在涉及GA生物合成的雙加氧酶內(nèi)保守的氨基酸序列(cf.圖2A)，在其活性位點存在與Fe結(jié)合的氨基酸殘基，并且還顯示出與其它的GA 2β-羥化酶有明顯的序列同源性。此外，cDNA所編碼的蛋白具有從許多C19-GAs產(chǎn)生2β-羥基化產(chǎn)物的活性。因此推測本發(fā)明人所分離的OsGA 2ox1 cDNA編碼GA 2β-羥化酶。
GA 2β-羥化酶直接調(diào)控具生物活性的3β-羥基化的GAs例如GA1和GA4的水平及其直接前體例如GA20和GA9的水平以產(chǎn)生無生物活性的2β-羥基化GAs。事實上，本發(fā)明人所分離的OsGA 2ox1 cDNA編碼的重組蛋白有將多種C19-GAs轉(zhuǎn)換為2β-羥基化產(chǎn)物的活性。因此本發(fā)明GA 2β-羥化酶和編碼該酶的DNA可用于制造無生物活性的GAs。
此外，對GA-缺陷型突變體和外源GAs作用和/或植物GA生物合成所用抑制劑的研究已經(jīng)顯示出GAs是植物生長重要且有效的調(diào)節(jié)劑。這些GAs影響具有相對高度的植物生長過程中的許多現(xiàn)象，并且還涉及到刺激莖的伸長。事實上，表達本發(fā)明OsGA 2ox1 cDNA的植物變得非常矮化。所以，本發(fā)明GA 2β-羥化酶和編碼該酶的DNA可用于改變植物生長，例如產(chǎn)生植物株型不同于野生型的植物，對植物株型的改變特別是使其矮化，帶來許多農(nóng)業(yè)上的益處例如高密度種植，有效的光吸收，降低風的損害，降低農(nóng)業(yè)勞作等。因此矮化作用對于培育農(nóng)業(yè)和園藝產(chǎn)品，包括果樹是最有價值的特性。
通過應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法本發(fā)明GA 2β-羥化酶可被制成重組蛋白或天然蛋白。可通過如下所述制備重組蛋白，例如，將編碼本發(fā)明GA2β-羥化酶的DNA(例如SEQ ID NO2)插入合適的表達載體并純化用所述載體轉(zhuǎn)化細胞的蛋白?？芍苽涮烊坏鞍?，例如，通過將制得的重組蛋白或其部分肽免疫合適的動物上，把由此制得的抗體結(jié)合到親合層析柱上，使柱與由表達本發(fā)明蛋白的水稻組織制得的提取物接觸，并純化與柱結(jié)合的蛋白。
本發(fā)明GA 2β-羥化酶包括野生型蛋白(SEQ ID NO1)，該蛋白部分氨基酸殘基已被修飾而野生型蛋白的功能得以保持。本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的制備該修飾蛋白的方法的實例包括定點誘變法(Kramer，W.和Fritz，H.-J.Methods in Enzymology，154350-367，1987)。氨基酸突變也可自發(fā)進行。因此本發(fā)明GA 2β-羥化酶包括保持野生型蛋白GA 2β-羥化酶活性的蛋白，以及通過在野生型蛋白氨基酸序列里取代，缺失，增加和/或插入一個或更多個氨基酸殘基而得以修飾的蛋白。只要所修飾的蛋白保持GA 2β-羥化酶的活性，對蛋白中所述氨基酸修飾的位置和數(shù)量不作特別限制。通常可被修飾的氨基酸的數(shù)量不超過50個氨基酸殘基，優(yōu)選不超過30個，更優(yōu)選不超過10個，最優(yōu)選不超過3個氨基酸殘基。
所用術(shù)語“GA 2β-羥化酶的活性”指的是合成底物C19-GAs(例如，GA1，GA4，GA9或GA20)2β-羥基化產(chǎn)物的活性，如下所示檢測活性。一般將所得cDNA插入表達載體并且在大腸桿菌里超表達為融合蛋白。產(chǎn)生的細胞提取物用作酶溶液，C19-GAs用作反應(yīng)底物，在有輔因子，亞鐵離子和2-氧化戊二酸存在下體外實施該反應(yīng)。最后通過GC-MS證實反應(yīng)產(chǎn)物(2β-羥基化產(chǎn)物)。
本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明GA 2β-羥化酶的DNA。只要編碼本發(fā)明的GA2β-羥化酶，所述DNA既可包括cDNA又可包括基因組DNA。例如，通過利用基于SEQ ID NO2所示的核苷酸序列信息設(shè)計的引物和以分離的水稻植物總RNA(例如花序總RNA)作為模板實施RT-PCR，編碼OsGA 2Ox1蛋白的cDNAs可得以制備。例如，通過利用基于SEQ ID NO2所示的核苷酸序列信息設(shè)計的引物及水稻基因組DNA為模板實施PCR，基因組DNA可得以制備。
例如，可以使用編碼本發(fā)明GA 2β-羥化酶的DNA來制備重組蛋白，如下所述。首先，通過利用具有限制酶切位點的引物的RT-PCR合成全長cDNA并亞克隆入pMAL-c2表達載體(NEB)的多克隆位點。所述構(gòu)建物通過標準方法用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21細胞(蛋白酶缺陷型)。應(yīng)用由此所得的轉(zhuǎn)化體誘導蛋白。在含0.2％葡萄糖的2x YT培養(yǎng)基中于37℃下培養(yǎng)大腸桿菌(搖動)。在OD600值約為0.6時，加入IPTG使其終濃度為1mM，于18℃進一步培養(yǎng)24小時。如下所述進行酶液提取。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞并在懸浮緩沖液(50mM Tris-HCl(pH8.0)含10％甘油，2mM DTT和1mg/ml溶菌酶)中裂解。細胞懸浮液于4℃擱置30分鐘，接著于-80℃培養(yǎng)直至完全冷凍。融解冷凍的懸浮液并在超聲波儀(Heat Systems-Ultrasonics，Inc.，ModelW-225R)的MAX水平超聲每次30秒，共兩次，間隔期為5分鐘。離心上述處理的懸浮液(于4℃ 15,000rpm離心20分鐘)，上清用作粗酶液。
此外，通過下述可制備純化蛋白。在大腸桿菌(或類似物)里本發(fā)明GA2β-羥化酶表達為有組氨酸標記的，麥芽糖結(jié)合蛋白或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白，隨后分別在鎳柱，直鏈淀粉柱或GST-谷胱甘肽柱上將其純化，純化后，上述標記通過利用例如需要凝血酶和Xa因子的限制蛋白酶將其裂解。
如上所述，推測本發(fā)明人所分離的基因通過產(chǎn)生生物活性失活的GAs而影響植物生長。因此，植物的生長可通過調(diào)控這些基因的表達而得到調(diào)控。特別是由于這些基因被認為涉及植物節(jié)間生長，所以可利用該基因控制植物高度?？刂浦参锔叨瓤蓭碓S多工業(yè)益處。例如，增加植物中本發(fā)明基因的表達導致高度降低能使植物抗彎曲由此增加果重。而且，縮小的株型(shortened stature)使每茬植物更加緊密以致使每單位面積上種植的植物數(shù)得到增加。密植特別是在農(nóng)作物包括水稻，小麥，玉米等的產(chǎn)量上非常重要。本發(fā)明編碼GA 2β-羥化酶的DNA可用于矮化開花植物，矮化果樹等。
另一方面，總體上植物產(chǎn)量通過在植物中抑制本發(fā)明基因的表達以增高植株高度而得到增加。用于改善例如總體上飼料農(nóng)作物的產(chǎn)量。
本發(fā)明中，許多本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的方法可用于抑制本發(fā)明基因的表達以控制植物生長。所述“抑制基因的表達”包括對基因轉(zhuǎn)錄和翻譯為蛋白的抑制，不僅包括完全抑制還包括降低基因的表達。
通過利用反義技術(shù)的常規(guī)方法能抑制植物中特異內(nèi)源基因的表達。Ecker等最先證明應(yīng)用瞬間基因表達方法通過電穿孔而導入植物細胞的反義RNA的影響(Ecker，J.R.和Davis，R.W.(1986).Proc.Natl.Acad.Sci.USA83，5372)。此后，據(jù)報道由于表達反義RNAs降低了靶基因在煙草和矮牽牛中的表達(van der Krol，A.R.等.(1988).Nature 333，866)。反義技術(shù)已經(jīng)被確立為抑制植物里靶基因表達的方法。
許多因素導致反義核酸抑制靶基因表達。包括三鏈的形成對轉(zhuǎn)錄起始的抑制作用；通過在RNA聚合酶形成開放環(huán)結(jié)構(gòu)的位點形成雜合對轉(zhuǎn)錄的抑制；通過與合成的RNA雜交的轉(zhuǎn)錄抑制作用；通過在內(nèi)含子和外顯子的接點形成雜合抑制剪接；通過在形成剪接體的位點形成雜合而抑制剪接；通過與mRNA雜交抑制mRNA從核到胞質(zhì)的易位；通過在帽位點或多聚腺苷酸添加位點形成雜交而抑制剪接；通過在翻譯起始因子的結(jié)合位點形成雜合對翻譯起始的抑制作用；通過在起始密碼子附近結(jié)合核糖體的位點形成雜合對翻譯的抑制作用；通過在翻譯區(qū)或mRNA多核蛋白體結(jié)合位點形成雜合抑制肽鏈延伸；通過在核酸和蛋白相互作用的位點形成雜合而抑制基因表達。這些因素通過抑制轉(zhuǎn)錄，剪接或翻譯的過程而抑制靶基因表達(Hirashima和Inoue，“Shin Seikagaku Jikken Koza (New Biochemistry ExperimentationLectures)2，Kakusan(Nucleic Acids)IV，Idenshi No Fukusei To Hatsugen(Replication and Expression of Genes)，”Nihon Seikagakukai Hen(TheJapanese Biochemical Society Ed.)，Tokyo Kagaku Dozin，pp.319-347，(1993))。
本發(fā)明所用反義序列通過任一上述的機制抑制靶基因的表達。如果反義序列設(shè)計成與該基因的mRNA的5’末端附近未翻譯區(qū)互補，就會有效的抑制基因的翻譯。另外，還可應(yīng)用與3’側(cè)編碼區(qū)或未翻譯區(qū)互補的序列。因此，本發(fā)明所用反義DNA包括具有針對該基因未翻譯區(qū)和翻譯區(qū)的反義序列的DNA。所用反義DNA在合適的啟動子下游連接，優(yōu)選的是，包含轉(zhuǎn)錄終止信號的序列在3’側(cè)相連。如此制備的DNA能通過已知方法轉(zhuǎn)染入所需的植物。優(yōu)選的反義DNA序列是與要被轉(zhuǎn)化的植物內(nèi)源基因(或同源的)或其一部分互補的序列，但是它不必是完全互補的，只要它能有效抑制所述基因表達。優(yōu)選轉(zhuǎn)錄的RNA不少于90％，更優(yōu)選不少于95％與靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補。為了有效的通過反義序列抑制靶基因的表達，反義DNA應(yīng)至少有15個核苷酸的長度或更長，優(yōu)選100個核苷酸或更長，最優(yōu)選500個核苷酸或更長。所用反義DNA一般短于5kb，優(yōu)選短于2.5kb的。
編碼核酶的DNA還可用于抑制內(nèi)源基因的表達。核酶定義為有催化活性的RNA分子。許多核酶在文獻中已經(jīng)公布，每個都具有不同的催化活性。對核酶作為切割RNA的酶的研究使設(shè)計特異性位點切割RNA的核酶成為可能。一些包含在RNaseP中的I組內(nèi)含子型或M1RNA核酶由400個或更多的核苷酸組成，而其它的錘頭型或發(fā)夾型的核酶有一約40個核苷酸的活性結(jié)構(gòu)域。(Koizumi，Makoto和Ohtsuka，Eiko(1990).Tanpakushitsu KakusanKohso(蛋白，核酸和酶)35，2191)。
錘頭型核酶的自我切割結(jié)構(gòu)域在序列G13U14C15的3’側(cè)C15切割。在U14和第九位A間形成的核苷酸對被認為對于核酶活性是重要的。此外，已經(jīng)顯示在第15的位置的核苷酸以A或U而不是C時也可發(fā)生切割(Koizumi，M.等.(1988).FEBS Lett.228，225)。如果將核酶的底物結(jié)合位點設(shè)計成與鄰近靶位點的RNA序列互補，可制成限制酶樣RNA切割核酶，其識別靶RNA內(nèi)序列UC，UU，或UA(Koizumi，M.等.(1988).FEBS Lett.239，285；Koizumi，Makoto和Ohtsuka，Eiko(1990).TanpakushitsuKakusan Kohso(Protein，Nucleic acid和Enzyme)，35，2191；Koizumi，M.等.(1989).Nucleic Acids Res.17，7059)。例如，在本發(fā)明人所分離OsGA 2ox1基因(SEQ ID NO2)的編碼區(qū)，有許多核酶的靶位點。
發(fā)夾型的核酶在本發(fā)明中也是有用的。例如，在煙草環(huán)斑病毒衛(wèi)星RNA的負鏈中發(fā)現(xiàn)發(fā)夾型的核酶(Buzayan，J.M.(1986).Nature 323，349)。該核酶已顯示出靶特異性切割RNA (Kikuchi，Y.和Sasaki，N.(1992).NucleicAcids Res.19，6751；Kikuchi，Yo(1992)Kagaku To Seibutsu(Chemistry和Biology)30，112)。
所設(shè)計切割靶的核酶與啟動子，例如花椰菜花葉病毒35S啟動子，及轉(zhuǎn)錄終止序列融合，使其在植物細胞中發(fā)生轉(zhuǎn)錄。然而，如果將外加序列加到已轉(zhuǎn)錄的RNA的5’末端或3’末端，核酶就會喪失活性。這種情況下，可利用一外加修剪核酶，其順式作用修剪該核酶部分5’或3’側(cè)，因此就可從含核酶的已轉(zhuǎn)錄RNA中精確地切割核酶部分(Taira，K.等.(1990).Protein Eng.3，733；Dzaianott，A.M.和Bujarski，J.J.(1989).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，4823；Grosshands，C.A.和Cech，R.T.(1991).NucleicAcids Res.19，3875；Taira，K.等.(1991.)Nucleic Acid Res.19，5125).為獲得更好的效果靶基因內(nèi)多位點可通過將這些結(jié)構(gòu)單元串聯(lián)排列來切割(Yuyama，N.等.，(1992).Biochem.Biophys.Res.Commun.186，1271)。通過應(yīng)用這些核酶，可特異地切割本發(fā)明靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而抑制該基因的表達。
靶基因的表達還可通過具有與靶基因相同或相似序列的DNA轉(zhuǎn)化之共抑制而得以抑制。所用“共抑制”，指的是在通過轉(zhuǎn)化將有與內(nèi)源靶基因相同或相似序列的基因?qū)胫参锛毎麜r，引入的外源基因與內(nèi)源靶基因的表達都受到抑制的現(xiàn)象。盡管還不知曉共抑制的具體機制，但在植物中卻可常常觀察到(Curr.Biol.(1997).7，R793，Curr.Biol.(1996).6，810).例如，如果想得到本發(fā)明基因受到共抑制的植物體，可以以為了表達本發(fā)明的基因或與其有相似序列的DNA所設(shè)計的DNA載體轉(zhuǎn)化該植物。所要用于共抑制的基因不必非要與靶基因完全同一性。然而，優(yōu)選的是70％或更多的序列同一性，更優(yōu)選的是80％或更多的序列同一性，最優(yōu)選的是90％或更多(例如95％或更多)的序列同一性。
一個氨基酸序列或核苷酸序列與另一個的同一性可通過下面的Karlin和Altschl的BLAST算法測得(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1993).90，5873-5877，)?？砷_發(fā)基于該算法的諸如BLASTN和BLASTX的程序(Altschul等.(1990).J.Mol.Biol.215，403-410)。為了利用基于BLAST的BLASTN分析核苷酸序列，參數(shù)設(shè)置為，例如，分值(score)＝100，字長＝12。另一方面，所用基于BLAST的BLASTX分析氨基酸的參數(shù)包括，例如，分值(score)＝50和字長＝3。在應(yīng)用BLAST和Gapped BLAST程序時，每個程序所用參數(shù)為默認參數(shù)。該分析的特定技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的(http//www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
利用一種抑制編碼本發(fā)明GA 2β--羥化酶的DNA或其表達的DNA通過下述方法可對植物生長進行改變，將該DNA插入合適的載體，將所述載體轉(zhuǎn)移到植物細胞中，并再生轉(zhuǎn)化植物細胞。只要在植物細胞中能表達所插入的基因，對載體類型沒有特別的限制。還可應(yīng)用具有能使組成基因在植物細胞中表達的啟動子(例如，花椰菜花葉病毒35S啟動子)的載體。此外，植物組織特異性啟動子對特定的植物組織例如，葉，花，果實等進行特異改變。組織特異性啟動子例如有種子-特異性啟動子諸如菜豆β-菜豆素(Bustos，等.(1991).EMBO J.10，1469-1479)和大豆球蛋白(Lelievre，等.(1992).PlantPhysiol.98，387-391)啟動子；葉-特異性啟動子諸如豌豆RbcS基因(Lam和Chua(1990).Science 248，471-474)和小麥Cab 1基因(Gotom，等.(1993).PlantJ.3，509-518)啟動子，根-特異性啟動子諸如煙草TobRB7基因(Yamamoto，等.(1991).Plant Cell 3，371-382)和發(fā)根土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)rolD基因啟動子(Elmayan和Tepfer(1995).Transgenic Res.4，388-396)。也可用具有由外源刺激物誘導激活的啟動子的載體。插入載體的植物細胞優(yōu)選來自與轉(zhuǎn)基因相同的植物。然而，并不僅限于此。事實上，本發(fā)明人證明導入鼠耳芥屬(Arabidopsis)基因的煙草表現(xiàn)矮化。術(shù)語“植物細胞”包括各種形式的植物細胞，例如，細胞培養(yǎng)懸浮液，原生質(zhì)體，葉切片，cali等?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的各種方法將載體轉(zhuǎn)入植物細胞中，包括聚乙二醇法，電穿孔法，農(nóng)桿菌介導法，粒子槍法等。轉(zhuǎn)化植物細胞的植物體的再生可通過本領(lǐng)域已知的標準法而得以進行。一旦產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物體，還可能獲得植物體的繁殖材料(例如，種子，塊莖，插條(cuttings)等)并且大量制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物。
附圖簡述
圖1，A為赤霉素的一般結(jié)構(gòu)(ent-赤霉素烷的基本結(jié)構(gòu))，和B為高等植物中GA生物合成的主要途徑。
圖2為OsGA 2ox1序列分析結(jié)果。A描述的是水稻(OsGA 2ox1)，鼠耳芥屬(AtGA 2ox1，AtGA 2ox2和AtGA2ox3)，荷包豆(PcGA 2ox1)和豌豆(PsGA 2ox1和PsGA 2ox2)的2β-羥化酶推導的氨基酸序列的對比。B描述的是各GA 2β-羥化酶間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。
圖3為重組OsGA 2ox1蛋白介導的代謝途徑。重組OsGA 2ox1蛋白以氚標記的GA1，GA4，GA9，GA 20，GA44和GA53培養(yǎng)。通過HPLC分離和GC/MS鑒定產(chǎn)物。
圖4為OsGA 2ox1在野生型水稻各器官中表達的RNA凝膠印跡分析結(jié)果的照片。從營養(yǎng)期苗尖(vegetative shoot apices)(泳道1)，幼葉(泳道2)，莖(泳道3)，葉片(泳道4)，葉鞘(泳道5)，根(泳道6)，花序芽尖(inflorescenceshoot apices)(泳道7)，穎片(泳道8)和花序軸(泳道9)提取總RNA并與OsGA 2ox1 cDNA片段雜交。
圖5是在萌發(fā)水稻種子和營養(yǎng)期苗尖分生組織(shoot apical meristems)中原位mRNA的定位照片。染成紫色說明存在OsGA 2ox1 mRNA。A播種后3天時水稻胚中部縱切片。B苗尖分生組織附近的高倍放大。C上皮和糊粉層附近的高倍放大。D有義RNA探針染色的水稻胚中部縱切片(對照)。E水稻營養(yǎng)期苗尖分生組織中部縱切片。線1，2，3和4代表分別在F，G，H和I圖中顯示的橫切片的近似層面。F，G，H和I為E圖水稻營養(yǎng)期苗尖分生組織連續(xù)橫切片。
圖6超表達OsGA 2ox1 cDNA的轉(zhuǎn)基因水稻表型的照片。A營養(yǎng)期野生型水稻(c)和Act∷OsGA 2ox1(1 to 5)轉(zhuǎn)基因水稻的總形態(tài)。B開花時的野生型水稻。C輕微矮化型Act∷OsGA 2ox1轉(zhuǎn)基因水稻。D中等的矮化型Act∷OsGA 2ox1轉(zhuǎn)基因水稻。E嚴重的矮化型Act∷OsGA 2ox1轉(zhuǎn)基因水稻。(B)-(E)的線(bar)代表10cm。
實施發(fā)明最佳模式本發(fā)明將對下面有關(guān)實施例詳細解釋但并不能推斷為限于此。
為制備實施例所用植物材料，水稻種子(Oryza sativa L.，Japonica cv.Nippon-bare)用1％NaClO滅菌1小時，并播種在瓊脂培養(yǎng)基上。幼苗在30℃(白天)及24℃(夜晚)溫室中生長。
實施例中，核苷酸序列通過雙脫氧核苷酸鏈終止法利用自動測序系統(tǒng)(ABI377)測定。包括大的內(nèi)含子的雙鏈cDNA和基因組克隆全部被測序。利用LASER GENE計算機軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)分析cDNA和氨基酸序列。
分離水稻GA 2β-羥化酶基因為了擴增水稻(Oryza sativa L.)japonica cv Nihon-bare基因組DNA，由所公開的鼠耳芥屬GA 2β-羥化酶基因保守區(qū)(AtGA 2ox3)(對應(yīng)入藏登記號C72618 DDBJ的cDNA)，Marah雙加氧酶macrocarpa mRNA(accessionnumber Y09113；MacMillan，J.等.(1997).Plant Physiol.，113，1369-1377)，水稻GA 20-氧化酶基因(入藏登記號U50333；Toyomasu，T.等.(1997).Physiol.Plant.，99，111-118)，水稻GA 3β-羥化酶基因和其它2-氧化戊二酸依賴型雙加氧酶基因(正向引物5′-GGNTTYGGNGARCAYWCNGAYCC-3′/SEQ ID No3；和反向引物，5′-GGISHISCRAARTADATIRTISWIA-3′/SEQID NO4)設(shè)計兩個寡核苷酸簡并引物。以水稻基因組DNA為模板進行PCR。擴增片段(約80bp)被克隆到pCR II(Invitrogen，Carlsbad，CA)并證實其序列。64個獨立克隆中有一個克隆包含新的2-氧化戊二酸依賴型雙加氧酶樣氨基酸，被預計編碼水稻GA 2β-羥化酶基因。用所述該部分氨基酸序列搜索DDBJ核苷酸序列數(shù)據(jù)庫，可得到一個水稻EST克隆(入藏登記號C72618)，推測其編碼水稻GA 2β-羥化酶基因，來自開花時的穗(ear)?；贓ST克隆設(shè)計寡核苷酸引物(正向引物，5′-GCGGCGTTCTTCGCG-3′/SEQID NO5；反向引物，5′-CTATTGTGAATGAGTACATT-3′/SEQ ID NO6)并以水稻基因組為模板實施PCR。將擴增片段克隆到pCR II(Invitrogen，Carlsbad，CA)并證實其序列。以230bp片段為探針進一步篩選cDNA和基因組克隆。
具體地，由水稻未成熟種子mRNA構(gòu)建的cDNA文庫和用Sau3AI部分消化的水稻基因組DNA構(gòu)建的DNA文庫通過上述制備的探針篩選。在5xSSC(1x SSC為0.15M NaCl，15mM檸檬酸鈉)，5x Denhardt′s溶液(1xDenhardt′s溶液含0.02％Ficoll，0.02％PVP和0.02％BSA)，0.5％[w/v]SDS，及20mg/L鮭精DNA于65C 雜交14小時，濾膜于室溫2x SSC，0.1％[w/v]SDS中沖洗。
所得cDNA稱為“OsGA 2ox1”并且包含開放的1,146bp讀碼框，該讀碼框編碼382個氨基酸蛋白(SEQ ID NO2)。它包含GA生物合成的雙加氧酶內(nèi)保守的序列，包括如上述組氨酸-241，天冬氨酸-243和組氨酸-302(號碼指的是在OsGA 2ox1氨基酸序列上的位置)。所述氨基酸序列與荷包豆(Phaseolus coccineus L.)，鼠耳芥屬(Thomas，S.G.等.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，4698-4703)和豌豆(Lester等.(1999)Plant J.1965-73)GA 2β-羥化酶cDNA序列的對比說明OsGA 2ox1是GA 2β-羥化酶一員(圖2A)。然而，這些雙加氧酶系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系顯示雙子葉(dicot)植物GA 2β-羥化酶cDNAs相互具有相對高(49-68％)的氨基酸同一性，但與OsGA 2ox1(圖2B)有顯著低的(低于36％)同一性。
相應(yīng)的完全覆蓋OsGA 2ox1編碼區(qū)的基因組DNA也被克隆。通過比較基因組DNA序列和cDNA序列，顯示出OsGA 2ox1包含三個外顯子和兩個內(nèi)含子。該外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)也在AtGA 2ox3編碼序列里保守。
重組GA 2β-羥化酶的功能將水稻GA 2β-羥化酶全長cDNA以有義方向翻譯融合插入pMAL-c2表達載體(New England Biolabs，Beverly，MA)。所形成的結(jié)構(gòu)pMAL-OsGA2ox1在大腸桿菌菌株JM109中表達。細菌細胞于37℃在含0.2％[w/v]葡萄糖和100mg/L氨芐青霉素的2x YT培養(yǎng)基里過夜生長。過夜培養(yǎng)后，培養(yǎng)物用新的培養(yǎng)基稀釋500倍，在30℃震蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)OD600為0.7時，加入IPTG至終濃度為1mM，于17℃再繼續(xù)培養(yǎng)24小時。收獲這些細菌細胞，用沖洗緩沖液(50mM Tris，pH8.0，10％[w/v]甘油，2mM DTT)沖洗，懸浮于含1g/L溶菌酶沖洗緩沖液中，在冰上保持30分鐘。
所得溶菌產(chǎn)物超聲處理并離心，將上清進行SDS-PAGE，融合蛋白的表達得以證實。上清與含各種C19-GAs包括GA1，GA4，GA9和GA20的2H-標記GA底物培養(yǎng)，GC/MS鑒定產(chǎn)物。通過OsGA 2ox1蛋白的作用，除了GA19和GA53(均有開放的內(nèi)酯形式)，將每一C19-GAs轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的2β-羥基化產(chǎn)物(圖3)。
水稻GA 2β-羥化酶基因的表達(1)RNA凝膠印跡分析從各種組織中(營養(yǎng)期苗尖，幼葉，莖，葉片，葉鞘，根，花序芽尖，穎片和花序軸)分別制備水稻總RNA以進行RNA凝膠印跡分析。每種制得的RNA 10μg在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳。轉(zhuǎn)移到Hybond N+膜上(Amersham，Buckinghamshire，England)，然后與探針HindIII-EcoRV片段(OsGA 2ox1cDNA230bp片段)雜交，在5x SSC，5x Denhardt′s溶液，0.5％[w/v]SDS及20mg/L鮭精DNA中于65℃雜交14小時，濾膜于65℃在2x SSC，0.1％[w/v]SDS中沖洗，接著于65℃ 0.2x SSC，0.1％[w/v]SDS沖洗。
在所有被檢測器官RNA中檢測到一條明顯的帶(圖4)。帶的大小為ca.1.6kb，幾乎與cDNA克隆的相同。
(2)原位雜交為更精確地測量水稻OsGA 2ox1表達的空間模式，利用地高辛配基(digoxygenin)-標記的OsGA 2ox1的反義鏈RNA作探針進行原位雜交。將植物材料在4％[w/v]低聚甲醛和含0.25％[w/v]戊二醛的0.1M磷酸鈉緩沖液，pH7.4中固定，于4℃過夜，通過系列梯度乙醇和系列叔丁醇脫水(Sass，A.E.(1958).Botanical Micro Technique，3rd ed.Iowa State UniversityPress.)，最終包埋在Paraplast Plus(Sherwood Medical)中。將切片機切片(7-10μm厚)置于用Vectabond處理的載玻片上(Vector Laboratory)。與地高辛配基-標記的有義或反義RNA雜交并且通過Kouchi和Hata所述方法進行雜交探針的免疫檢測(Kouchi，H.和Hata，S.(1993).Mol.Gen.Genet.，238，106-119)。
檢測到萌發(fā)的水稻種子OsGA 2ox1的表達模式如圖5A所示。紫染，說明OsGA 2ox1 mRNA存在，在苗尖分生組織，上皮，糊粉層的葉插入點觀察到其為環(huán)狀模式。
圖5A顯示萌發(fā)的水稻種子苗尖近中部縱切片。在苗尖分生組織的相反側(cè)面OsGA 2ox1的表達為成對信號(圖5B)。分化的葉原基底部區(qū)域也發(fā)現(xiàn)斑點表達。在胚的其它區(qū)域，盾片最外層，上皮和糊粉層有OsGA 2ox1表達(圖5C)。與有義鏈RNA探針雜交的對照切片在背景染色上沒有信號(圖5D)。
圖5E為水稻營養(yǎng)期苗尖縱切片。E圖中線1，2，3和4近似表明橫切片平面，分別在圖5F，4G，4H和4I中顯示。通過重疊在連續(xù)切片(圖5F，4G，4H和4I)中觀察到的OsGA 2ox1信號的表達，顯示出位于苗尖分生組織和最初葉原基銜接點周圍的縱切片(圖5B和4E)中OsGAzox1的斑點表達為環(huán)型。相似地，分化的葉原基底部區(qū)域的斑點表達與位于大量的維管束周圍的信號對應(yīng)(圖5F，5G，5H和5I)。
苗尖分生組織和上皮的葉插入點需高水平生物活性GA1來滿足葉的發(fā)育和長大，萌芽期間糊粉層也需高水平生物活性GA1誘導α-淀粉酶基因表達以水解胚乳中貯藏的淀粉。因此，分化的葉原基，上皮和糊粉層的底部區(qū)域OsGA 2ox1的表達被認為在這些組織中調(diào)控迅速積累GA1方面起著重要作用。OsGA 2ox1在該位點的表達似乎使GA1活性喪失并且阻止生物活性GA流向由于GA1過量而導致生長程序混亂的外組織。
OsGA 2ox1在苗尖分生組織和最初葉原基交界處的表達也為環(huán)型表達模式。該表達模式表明通過調(diào)控具生物活性的GA的含量，OsGA 2ox1可能涉及或可對早期模式形成情況的應(yīng)答，該早期模式形成將稱為植物繁殖單位的植物體分節(jié)單元定義為在可能的植物同源框基因作用中所提出的(Schneeberger，R.G.等.(1995).genes Devel.，9，2292-2304；Sato，Y.等.(1998).Plant Mol.Biol.，38，983-998)。或者，OsGA 2ox1表達和由此GA1含量的降低預示了將來節(jié)間胚后期的發(fā)育。通過在苗尖分生組織周圍恰好在葉插入點下面觀察到OsGA 2ox1環(huán)型表達的事實，說明在能看到任何節(jié)或節(jié)間分化之前就可識別出節(jié)間以后要發(fā)育之處。
水稻GA 2β-羥化酶基因在轉(zhuǎn)基因植物中的超表達為通過遺傳操作GA 2β-羥化酶基因的表達而評估OsGA 2ox1基因產(chǎn)物體內(nèi)活性和修飾轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)源GAs含量的可行性，在轉(zhuǎn)基因水稻里超表達cDNA克隆。
將水稻GA 2β-羥化酶全長cDNA切成XbaI-EcoRV片段并將其在水稻肌動蛋白啟動子和抗潮霉素的二載體pAct-Hm2胭脂堿合成酶(NOS)聚腺苷酸化信號間插入。該載體是修飾的pBI-H1(Ohta，S.等.(1990).Plant CellPhysiol.，31，805-813)并且包含肌動蛋白啟動子。形成的結(jié)構(gòu)命名為“pAct-OsGA 2ox1”。用作對照載體的“pAct-GUS”通過在肌動蛋白啟動子和pAct-Hm2的NOS終止子間導入β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因而構(gòu)建。
通過電穿孔將“pAct-OsGA 2ox1”和“pAct-GUS”融合構(gòu)建體導入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA101。根據(jù)Tanaka等的方法(Japanese Patent Application No.Hei 11-206922)進行農(nóng)桿菌-介導的水稻(Oryza sativa L.cv.Nippon-bare)愈傷組織轉(zhuǎn)化。在含50mg/L潮霉素培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)基因水稻。將抗潮霉素植株移植到土壤中于30℃(白天)和24℃(夜間)及16小時光照/8小時黑暗的循環(huán)條件下生長。
該實驗中多于40株獨立的轉(zhuǎn)基因水稻得以再生。正如所預計的，所有超表達OsGA 2ox1 cDNA的轉(zhuǎn)化體顯示出矮化表型(圖6)。與p35S∷AtGA2ox3轉(zhuǎn)基因煙草植株比較，許多轉(zhuǎn)化有pAct∷OsGA 2ox1水稻植株沒有顯示出相同的表型，但對莖伸長的抑制作用不同(圖6A)，這一現(xiàn)象主要是由于不同轉(zhuǎn)化體中轉(zhuǎn)基因不同的表達水平造成。適度矮化植株高約50cm(圖6C)，而嚴重矮化植株最終高度低于15cm(圖6E)，約為野生型水稻的一半高度(圖6B)。其它轉(zhuǎn)基因水稻植株的高度在該范圍內(nèi)變動(圖6D)。葉片長度也相應(yīng)于植株的高度得以縮短。
工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明提供了新的酶和涉及植物赤霉素失活的基因以及通過控制這些基因的表達而改變赤霉素活性的植物。本發(fā)明能改變植物赤霉活化來人工改變植物株型。植物體內(nèi)赤霉素失活由于抑制縱向的生長而誘導植物矮化的表型。例如，可防止在水稻植株由于充足的肥料而過度伸長而彎曲。由于提高了葉的光吸收效率，所以還可以預計農(nóng)作物能得到大量增產(chǎn)。還可能提高收獲和育種的管理效率。本發(fā)明另一目的是通過抑制本發(fā)明基因在植物體內(nèi)的表達來促進赤霉素的活性總體上增加植物產(chǎn)量?？傮w上該策略特別有益于改善飼料作物的產(chǎn)量。
序列表<110>農(nóng)林水產(chǎn)省國家農(nóng)業(yè)生物資源研究所所長代表的日本國(JAPAN asrepresented by Director General of Ministry of Agriculture，F(xiàn)orestry and Fisheries，National Institute of AgrobiologicalResources)理化學研究所(RIKEN)<120>水稻赤霉素2β-羥化酶基因及其用途<130>MOA-106PCT<140><141><150>JP 1999-365899<151>1999-12-24<160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>382<212>PRT<213>稻(Oryza sativa)<400>1Met Val Val Pro Ser Ala Thr Thr Pro Ala Arg Gln Glu Thr Val Val1 5 10 15Ala Ala Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ala Ser Gly Val Val Gly Gly Gly20 25 30Gly Gly Val Thr Ile Ala Thr Val Asp Met Ser Ala Glu Arg Gly Ala35 40 45Val Ala Arg Gln Val Ala Thr Ala Cys Ala Ala His Gly Phe Phe Arg50 55 60Cys Val Gly His Gly Val Pro Ala Ala Ala Pro Val Ala Ala Arg Leu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Ala Ala Phe Phe Ala Met Ala Pro Ala Glu Lys Gln85 90 95Arg Ala Gly Pro Ala Ser Pro Leu Gly Tyr Gly Cys Arg Ser Ile Gly100 105 110Phe Asn Gly Asp Val Gly Glu Leu Glu Tyr Leu Leu Leu His Ala Asn115 120 125Pro Ala Ala Val Ala His Arg Ala Arg Thr Ile Asp Ala Met Asp Pro
130 135 140Ser Arg Phe Ser Ala Ile Val Asn Glu Tyr Ile Glu Ala Met Lys Lys145 150 155 160Leu Ala Cys Glu Ile Leu Asp Leu Leu Gly Glu Gly Leu Gly Leu Lys165 170 175Asp Pro Arg Tyr Phe Ser Lys Leu Thr Thr Asn Ala Asp Ser Asp Cys180 185 190Leu Leu Arg Ile Asn His Tyr Pro Pro Ser Cys Asn Ile His Lys Leu195 200 205Asp His Asp Asp Gln Cys Asn Ile Lys Ser Leu Val Ser Thr Lys Ala210 215 220Ser Asn Gly Gly Asn Leu Met Ala Gly Gly Arg Ile Gly Phe Gly Glu225 230 235 240His Ser Asp Pro Gln Ile Leu Ser Leu Leu Arg Ala Asn Asp Val Glu245 250 255Gly Leu Gln Val Phe Val Pro Asp His Glu Gly Lys Glu Met Trp Val260 265 270Gln Val Pro Ser Asp Pro Ser Ala Ile Phe Val Asn Val Gly Asp Val275 280 285Leu Gln Ala Leu Thr Asn Gly Arg Leu Ile Ser Ile Arg His Arg Val290 295 300Ile Ala Thr Ala Cys Arg Pro Arg Leu Ser Thr Ile Tyr Phe Ala Ser305 310 315 320Pro Pro Leu His Ala Arg Ile Ser Ala Leu Pro Glu Thr Ile Thr Ala325 330 335Ser Ser Pro Arg Arg Tyr Arg Ser Phe Thr Trp Ala Glu Tyr Lys Thr340 345 350Thr Met Tyr Ser Leu Arg Leu Ser His Ser Arg Leu Glu Leu Phe Lys355 360 365Ile Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asn Ala Ser Glu Gly Lys Ala370 375 380<210>2<211>1562<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<220><221>CDS<222>(54)..(1199)<400>2ggcacgagcc attccggccg cgcattctcc cgctctcgat cgatcgatcg atc atg56Met1gtg gtg cct tcc gcg acg acg cca gcg agg cag gag acg gtg gtg gcg 104Val Val Pro Ser Ala Thr Thr Pro Ala Arg Gln Glu Thr Val Val Ala5 10 15gcg gcg ccg cca gct gcg gcg gcg tcc ggt gtc gtc ggc ggc ggc ggc 152Ala Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ala Ser Gly Val Val Gly Gly Gly Gly20 25 30ggc gtg acg ata gcg acg gtg gac atg tcg gcg gag cgc ggc gcg gtg 200Gly Val Thr Ile Ala Thr Val Asp Met Ser Ala Glu Arg Gly Ala Val35 40 45gcg agg cag gtg gcg acg gcg tgc gcg gcg cac ggg ttc ttc cgg tgc 248Ala Arg Gln Val Ala Thr Ala Cys Ala Ala His Gly Phe Phe Arg Cys50 55 60 65gtc ggg cac ggc gtg ccg gcg gcg gcg ccc gtc gcg gcg agg ctg gac 296Val Gly His Gly Val Pro Ala Ala Ala Pro Val Ala Ala Arg Leu Asp70 75 80gcc gcg acg gcg gcg ttc ttc gcg atg gcg ccg gcg gag aag cag cgc 344Ala Ala Thr Ala Ala Phe Phe Ala Met Ala Pro Ala Glu Lys Gln Arg85 90 95gcc ggg ccg gcg agc ccg ctc ggg tac ggc tgc cgg agc atc ggg ttc 392Ala Gly Pro Ala Ser Pro Leu Gly Tyr Gly Cys Arg Ser Ile Gly Phe100 105 110aac ggc gac gtc ggc gag ctg gag tac ctg ctc ctc cac gcc aac ccc 440Asn Gly Asp Val Gly Glu Leu Glu Tyr Leu Leu Leu His Ala Asn Pro115 120 125gcc gcc gtc gcg cac cgg gcc agg acc atc gac gcc atg gac ccc tct 488Ala Ala Val Ala His Arg Ala Arg Thr Ile Asp Ala Met Asp Pro Ser130 135 140 145cgc ttc agt gct att gtg aat gag tac att gaa gcc atg aag aag ctc 536Arg Phe Ser Ala Ile Val Asn Glu Tyr Ile Glu Ala Met Lys Lys Leu150 155 160gca tgt gag atc ctg gac ctg tta gga gag ggg cta ggt ctc aag gac 584Ala Cys Glu Ile Leu Asp Leu Leu Gly Glu Gly Leu Gly Leu Lys Asp
165 170 175ccc aga tac ttc agc aag ctt acc aca aac gct gac agt gac tgc ctc 632Pro Arg Tyr Phe Ser Lys Leu Thr Thr Asn Ala Asp Ser Asp Cys Leu180 185 190ctg agg atc aac cac tac cct cca tca tgc aac att cac aaa ctt gac 680Leu Arg Ile Asn His Tyr Pro Pro Ser Cys Asn Ile His Lys Leu Asp195 200 205cat gat gac caa tgc aat atc aag agc ctt gtt agc acc aag gct agc 728His Asp Asp Gln Cys Asn Ile Lys Ser Leu Val Ser Thr Lys Ala Ser210 215 220 225aat ggt ggg aat ctg atg gca ggt ggg cgc att ggg ttc ggc gag cac 776Asn Gly Gly Asn Leu Met Ala Gly Gly Arg Ile Gly Phe Gly Glu His230 235 240tct gac ccg cag atc ctt agc ttg ctc cga gca aac gat gtg gaa ggg 824Ser Asp Pro Gln Ile Leu Ser Leu Leu Arg Ala Asn Asp Val Glu Gly245 250 255cta cag gtg ttt gtg ccg gac cac gag ggc aag gag atg tgg gtt cag 872Leu Gln Val Phe Val Pro Asp His Glu Gly Lys Glu Met Trp Val Gln260 265 270gtg cca tcg gac cca tcg gcc att ttc gtc aat gtt ggt gat gtc ctc 920Val Pro Ser Asp Pro Ser Ala Ile Phe Val Asn Val Gly Asp Val Leu275 280 285cag gct ctg aca aat ggg agg ctg ata agt atc cgg cac agg gta att 968Gln Ala Leu Thr Asn Gly Arg Leu Ile Ser Ile Arg His Arg Val Ile290 295 300 305gca acc gcc tgc agg cca agg ctg tcc aca ata tac ttc gca tca cca 1016Ala Thr Ala Cys Arg Pro Arg Leu Ser Thr Ile Tyr Phe Ala Ser Pro310 315 320ccc ctg cat gca cga atc tcg gca ctc cca gag aca atc aca gcc agc 1064Pro Leu His Ala Arg Ile Ser Ala Leu Pro Glu Thr Ile Thr Ala Ser325 330 335agc cca cgc cga tac cga tca ttc acc tgg gct gag tac aag acg aca 1112Ser Pro Arg Arg Tyr Arg Ser Phe Thr Trp Ala Glu Tyr Lys Thr Thr340 345 350atg tac tca ctc cgc ctg agc cac agc cgc cta gaa ctc ttc aaa att 1160Met Tyr Ser Leu Arg Leu Ser His Ser Arg Leu Glu Leu Phe Lys Ile355 360 365gac gat gat gac agc gac aat gcc agt gag gga aaa gca taggaattgc1209Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asn Ala Ser Glu Gly Lys Ala370 375 380tggttaaatt gcagacgatg cctatggacc agtggggatt aggaagctga aactgtcccc 1269aaaattttgg ctctctggca gtctggctac tatcgtcaga tatctcacta ttatgatggt 1329gtagtgccta agttgacggg tgtgtaatat cgttagcagt ctacagaagc tatggttgta 1389cggaagtaat gtactgtcgc cttttcagct aactatccat gttctctctt atatgtaatg 1449agttagttga cggatgtgta atattgctag cattgtatat aagctatggt tgtatggaag 1509tatgtaatat agccttttca gctaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa1562<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>3ggnttyggng arcaywcnga ycc 23<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<220><221>modified_base<222>(3)<223>i<220><221>modified_base<222>(6)<223>i<220><221>modified_base<222>(18)<223>i<220><221>modified_base<222>(21)<223>i<220><221>modified_base<222>(24)<223>i<400>4ggnshnscra artadatnrt nswna 25<210>5<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>5gcggcgttct tcgcg 15<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>6ctattgtgaa tgagtacatt 20
權(quán)利要求
1.編碼具有赤霉素2β-羥化酶活性的蛋白的DNA，選自(a)編碼包含SEQ ID NO1中所示氨基酸序列的蛋白的DNA，(b)包含SEQ ID NO2中所示核苷酸序列的編碼區(qū)的DNA，和(c)編碼包含SEQ ID NO1中所示氨基酸序列的蛋白的DNA，其中一個或更多個氨基酸殘基被取代，缺失，添加，和/或插入。
2.權(quán)利要求1的DNA，用于產(chǎn)生矮化植物。
3.一種用于抑制內(nèi)源性權(quán)利要求1所述DNA在植物細胞中表達的DNA，選自(a)編碼與權(quán)利要求1的DNA或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的反義RNA的DNA，(b)編碼具有核酶活性的RNA的DNA，所述活性為特異性切割權(quán)利要求1所述的DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，和(c)編碼一種通過共抑制作用抑制內(nèi)源性權(quán)利要求1所述DNA表達的RNA的DNA，該DNA與包含SEQ ID NO2所示核苷酸序列的DNA具有70％或更高的同源性。
4.攜帶權(quán)利要求1-3中任一項的DNA的載體。
5.一種轉(zhuǎn)化的植物細胞，其攜帶并能表達權(quán)利要求1-3中任一項的DNA。
6.含有權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)化植物細胞的轉(zhuǎn)基因植物。
7.權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因植物的繁殖材料。
8.權(quán)利要求1的DNA編碼的蛋白。
9.產(chǎn)生權(quán)利要求8的蛋白的方法，其中所述方法包括對攜帶并能表達權(quán)利要求1所述DNA的轉(zhuǎn)化細胞進行培養(yǎng)并且從所述細胞或其培養(yǎng)上清中回收表達的蛋白。
10.改變植物生長的方法，其中所述方法包括控制權(quán)利要求1的DNA在植物細胞里的表達水平。
11.改變植物株型的方法，其中所述方法包括控制權(quán)利要求1的DNA在植物細胞里的表達水平。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中權(quán)利要求1-3中任一項的DNA在植物細胞里表達。
全文摘要
成功地分離出新的水稻GA 2β－羥化酶基因。此外，與野生型植物相比，改變過的禾本科植物株型(grass type)的植物通過利用這些基因得以成功地構(gòu)建。
文檔編號C12P21/02GK1425070SQ00818652
公開日2003年6月18日 申請日期2000年12月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月24日
發(fā)明者田中宥司, 萱野曉明, 松岡信, 小林正智 申請人:獨立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 理化學研究所