專利名稱：用于調(diào)控外源基因表達(dá)的啟動子的制作方法
背景技術(shù)：
(a)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于調(diào)控外源基因在轉(zhuǎn)基因生物中，特別是在轉(zhuǎn)基因植物中以葉特異性方式表達(dá)的啟動子。
(b)現(xiàn)有技術(shù)描述近15年來遺傳轉(zhuǎn)化的微生物被用于生產(chǎn)有用的重組分子，目前正應(yīng)用于制藥、化妝品和護(hù)膚品工業(yè)。在過去10年里隨著將這一普通概念應(yīng)用到復(fù)雜真核生物所需技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)從微生物擴(kuò)展到植物和動物?；旧?，編碼目的蛋白的基因或者編碼用于導(dǎo)致目的分子代謝途徑改變的酶的基因，以適當(dāng)?shù)姆绞脚c順式和反式作用調(diào)控序列相連，并傳遞給靶細(xì)胞，其中以暫時的或穩(wěn)定的方式摻入其分子機(jī)制。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生的組織或生物接著進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而能夠積累目的蛋白，或通過目的酶的活性進(jìn)行新的代謝反應(yīng)。
正在出現(xiàn)的分子農(nóng)業(yè)工業(yè)是即將到來的下一世紀(jì)最有前景的產(chǎn)業(yè)之一。其前景是為工業(yè)提供安全和再生分子工廠。目前發(fā)展的應(yīng)用有生產(chǎn)供治療和診斷用的低成本單克隆抗體；生產(chǎn)用于治療慢性或致死性疾病的大量激素、細(xì)胞因子和其它生物活性分子；生產(chǎn)多種血液成分的生物安全替代品；生產(chǎn)用于食品和造紙工業(yè)的大量加工酶；生產(chǎn)用于廢物處理的低成本酶；以及生產(chǎn)用于化妝品工業(yè)的安全的生物活性分子。
這項技術(shù)應(yīng)用的局限常常是由于轉(zhuǎn)基因生物不能積累足夠量的重組產(chǎn)品，其原因是由于低的轉(zhuǎn)錄效率、信使不恰當(dāng)?shù)募艚印⑼庠磎RNA的不穩(wěn)定、低的翻譯效率、重組蛋白對內(nèi)源性蛋白酶的超敏感性、或者是重組生物對外源蛋白的超敏感性導(dǎo)致不恰當(dāng)?shù)暮陀邢薜纳L，或最壞時對宿主生物產(chǎn)生強(qiáng)的有害效應(yīng)。當(dāng)利潤率低、或當(dāng)處理或處置殘余物質(zhì)導(dǎo)致生物安全或環(huán)境問題時，生產(chǎn)水平的不足直接影響應(yīng)用發(fā)展。所需重組產(chǎn)品積累水平的提高是保證分子農(nóng)業(yè)許多應(yīng)用商業(yè)化的一個關(guān)鍵因素。
光合作用在生物界中是極其重要的代謝反應(yīng)。它在大多數(shù)植物、藻類和某些細(xì)菌中進(jìn)行。整個反應(yīng)涉及空間排列于葉細(xì)胞葉綠體的內(nèi)囊體膜系統(tǒng)內(nèi)電子傳遞蛋白的復(fù)合裝配體。該電子傳遞鏈在一端與光合作用天線偶連，其包含許多大分子(包括所有光合作用生物所共有的一種分子即葉綠素)，另一端與涉及NADPH和ATP合成的酶及卡爾文循環(huán)偶連，后者涉及從NADPH和ATP釋放能量與固定氣態(tài)二氧化碳到有機(jī)分子的偶聯(lián)。在涉及全部光合反應(yīng)的蛋白中，事實(shí)上核酮糖二磷酸羧化酶(Rubisco)是最豐富的蛋白。
光合作用專門在葉細(xì)胞中進(jìn)行。當(dāng)為植物生物技術(shù)應(yīng)用而構(gòu)建強(qiáng)的葉特異性表達(dá)盒時，對利用有如此顯著組織特異性代謝活性基因的啟動子發(fā)生興趣是顯而易見的。
光合作用裝置的許多肽成份是由葉綠體基因組中的基因編碼，例如，Rubisco的大亞單位(帶有固定CO2的催化位點(diǎn))由葉綠體基因編碼。然而該酶的小亞單位是由核基因編碼。因此Rubisco全蛋白是由兩種不同基因組編碼的亞單位組成。很明顯，使用Rubisco啟動子控制轉(zhuǎn)基因植物葉中轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn)錄受到關(guān)注。該啟動子特性已被充分闡明，并且它在表達(dá)載體中的使用受美國專利NO.4,962,028保護(hù)。
提供該啟動子用于調(diào)控外源基因在轉(zhuǎn)基因生物中，特別是轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)是非常希望的。
按照本發(fā)明的一個實(shí)施方案，提供了涉及用于調(diào)控外源基因在轉(zhuǎn)基因生物中表達(dá)的啟動子，其含有具有如下啟動子的鑒別特征的啟動子，所述啟動子具有選自SEQ ID NOS1-3所示序列的序列和其功能性片段或其衍生物，其中所述啟動子經(jīng)改造與所述外源基因可操作地定位，以達(dá)所述基因。
本發(fā)明優(yōu)選的啟動子具有選自SEQ ID NOS1-3所示序列的序列。
優(yōu)選地，生物是植物。
優(yōu)選地，本發(fā)明啟動子可通過光的有無來調(diào)控。
優(yōu)選的植物是雙子葉植物、單子葉植物或裸子植物。
按照本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了一種調(diào)控外源基因在轉(zhuǎn)基因生物中表達(dá)的方法，由以下步驟組成(a)使用表達(dá)構(gòu)建體制備轉(zhuǎn)基因生物，其中所述的構(gòu)建體至少包含本發(fā)明的啟動子以及基因的可讀框(ORF)，其中所述啟動子與所述外源基因可操作地定位以表達(dá)所述基因。
用于本發(fā)明的下列術(shù)語定義如下。
“功能片段或其衍生物”的表述意為序列SEQ ID NOS1-3的任何衍生物或片段，其可使外源基因得到與SEQ ID NOS1-3所示本發(fā)明序列中的啟動子相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平。發(fā)明詳述以下是用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因苜蓿系方法的詳細(xì)描述，其可調(diào)控其中報告基因的表達(dá)。
在該實(shí)施方案中，具有如SEQ ID NOS1-3所示序列的啟動子與報告基因和終止子相連，該構(gòu)建體插到植物表達(dá)載體中，載體適于用DNA轟擊到苜蓿系的葉中，以及適于按照Desgagnes(1995，植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)(Plant Cell Tissue Organ Cult.)42129-140)用做土壤桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。這兩種DNA轉(zhuǎn)移方法用以證明報告基因的表達(dá)可受光調(diào)控。
材料和方法DNA測序DNA測序按照Sanger等所述方法進(jìn)行(1997，美國國家科學(xué)院院報，(P.N.A.S，USA，)745643-5647)。
本發(fā)明所得啟動子具有如SEQ ID NOS1-3所示的序列表達(dá)盒與載體的構(gòu)建使用GUS報告基因的表達(dá)分析盒構(gòu)建如下。用HindIII和EcoRI從pBI101消化無啟動子的GUS盒，插到pUC19多克隆位點(diǎn)的HindIII與EcoRI位點(diǎn)中。所得質(zhì)粒命名為pBI201并用于進(jìn)一步構(gòu)建。各種pGPlas3-2缺失片段在pBI201中GUS報告基因的5’端轉(zhuǎn)錄性地和瞬時性地融合，用于利用DNA轟擊作瞬時表達(dá)研究。在鑒定了足夠多的缺失片段后，將其亞克隆到二元植物表達(dá)載體如pBI101(Clonetech)中。這些重組質(zhì)粒用于如下述的通過根癌土壤桿菌(A.tumefaciens)感染的穩(wěn)定整合。
土壤桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)基因系的產(chǎn)生按照Khoudi等(1999，生物技術(shù)與生物工程(Biotechnol.Bioeng)，64135-143)所述，用電穿孔將重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌土壤桿菌株LBA4404。選出的土壤桿菌株在無選擇壓力(卡那霉素)下與基因型為C5-1的葉盤共培養(yǎng)4天。孵育后，清洗和營養(yǎng)葉片，再在B5H培養(yǎng)基上形成愈傷組織。愈傷組織再轉(zhuǎn)移至SH培養(yǎng)基21天用于胚誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)移至BOi2Y 28天用于胚發(fā)育。從BOi2Y上取下魚雷狀的胚置于MS培養(yǎng)基以再生。除了MS上的共培養(yǎng)及再生，在所有培養(yǎng)基中都有卡那霉素。Desgages等對該方法有詳細(xì)描述(1995，植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)42129-140)。含根的小苗在溫室中長到成熟。
盡管本發(fā)明與其特定的實(shí)施方案一起被描述，應(yīng)該理解，其能作進(jìn)一步修改。本申請意在包括一般地參考本發(fā)明原則的任何改變、運(yùn)用或調(diào)整，還包括在本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)已知的或慣例的實(shí)踐中對本發(fā)明的偏離，只要其中涉及了本發(fā)明以及應(yīng)用了以上闡明的重要特性，和如下所附權(quán)利要求的范圍。
序列表<110>V ZINA，Louis-PhilippeD＇AOUST，Marc-AndréMEDICAGO Inc<120>用于調(diào)控外源基因表達(dá)的啟動子<130>14149-4＂PCT＂<150>US 60/157,129<151>1999-10-04<160>3<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>1350<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>待用作啟動子用于調(diào)控外源基因表達(dá)的序列<400>1cgacggcccg ggctggtata tttatatgtt gtcaaataac tcaaaaacca taaaagttta 60agttagcaag tgtgtacatt tttatttgaa caaaaatatt cacctactac tgttataaat120cattattaaa cattagagta aagaaatatg gatgataaga acaagagtag tgatattttg180acaacaattt tgttgcaaca tttgagaaaa ttttgttgtt ctctcttttc attggtcaaa240aacaatagag agagaaaaag gaagagggag aataaaaaca taatgtgagt atgagagaga300aagttgtaca aaagttgtac caaaatagtt gtacaaatat cattgaggaa tttgacaaaa360gctacacaaa taagggttaa ttgctgtaaa taaataagga tgacgcatta gagagatgta420ccattagaga atttttggca agtcattaaa aagaaagaat aaattatttt taaaattaaa480agttgagtca tttgattaaa catgtgatta tttaatgaat tgatgaaaga gttggattaa540agttgtatta gtaattagaa tttggtgtca aatttaattt gacatttgat cttttcctat600atattgcccc atagagtcag ttaactcatt tttatatttc atagatcaaa taagagaaat660aacggtatat taatccctcc aaaaaaaaaa aacggtatat ttactaaaaa atctaagcca720cgtaggagga taacatccaa tccaaccaat cacaacaatc ctgatgagat aacccacttt780aagcccacgc actctgtggc acatctacat tatctaaatc acacattctt ccacacatct840gagccacaca aaaaccaatc cacatcttta tcacccattc tataaaaaat cacactttgt900gagtctacac tttgattccc ttcaaacaca tacaaagaga agagactaat taattaatta960atcatcttga gagaaaatgg ccaccgttac ttccaccacc gttgctattc catcattcac 1020aggccttaag gcaaacgcaa gcaaagttaa tgccatagct aaggttccaa cttcaacttc 1080tcaattgcca aggctttgtg tcagagcttc cctcaaagac tttggagttg ctgctgttgc 1140cactgctgca agtgcattgt tagctagcaa tgcccttgca gttgaagtgt tgcttggtgc 1200tagtgatggg ggtttggctt ttgttccaaa caatttcaca gtgaacgctg gagacaccat 1260tacattcaag aacaatgctg gttttcctca caacgttatc ttcgatgaag acgagattcc 1320aagcggggtt gatgctgcaa tcgaattccc1350
<210>2<211>971<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>待用作啟動子用于調(diào)控外源基因表達(dá)的序列<400>2cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt taagttagca 60agtgtgtaca tttttatttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa atcattatta120aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt tgacaacaat180tttgttgcaa catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca aaaacaatag240agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga gaaagttgta300caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa aagctacaca360aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg taccattaga420gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta aaagttgagt480catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt aaagttgtat540tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct atatattgcc600ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa ataacggtat660attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc cacgtaggag720gataacatcc aatccaacca atcacaacaa tcctgatgag ataacccact ttaagcccac780gcactctgtg gcacatctac attatctaaa tcacacattc ttccacacat ctgagccaca840caaaaaccaa tccacatctt tatcacccat tctataaaaa atcacacttt gtgagtctac900actttgattc ccttcaaaca catacaaaga gaagagacta attaattaat taatcatctt960gagagaaaat g 971<210>3<211>731<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>待用作啟動子用于調(diào)控外源基因表達(dá)的序列<400>3agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga gaaagttgta 60caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa aagctacaca120aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg taccattaga180gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta aaagttgagt240catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt aaagttgtat300tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct atatattgcc360ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa ataacggtat420attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc cacgtaggag480gataacatcc aatccaacca atcacaacaa tcctgatgag ataacccact ttaagcccac540gcactctgtg gcacatctac attatctaaa tcacacattc ttccacacat ctgagccaca600caaaaaccaa tccacatctt tatcacccat tctataaaaa atcacacttt gtgagtctac660actttgattc ccttcaaaca catacaaaga gaagagacta attaattaat taatcatctt720gagagaaaat g 73權(quán)利要求
1.一種用于調(diào)控外源基因在轉(zhuǎn)基因生物中表達(dá)的啟動子，它包括具有如下啟動子鑒別特征的啟動子，所述啟動子具有選自SEQ ID NOS1-3所示序列的序列和其功能片段或其衍生物，其中所述啟動子經(jīng)改造與所述外源基因可操作地定位，用于表達(dá)所述基因。
2.權(quán)利要求1的啟動子，其中為了該基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，以光的有無調(diào)節(jié)啟動子。
3.權(quán)利要求1的啟動子，其中啟動子具有選自SEQ ID NOS1-3中所示序列的序列。
4.權(quán)利要求1的啟動子，其中所述生物是植物。
5.權(quán)利要求4的啟動子，其所述植物是雙子葉植物、單子葉植物或裸子植物
6.一種調(diào)控外源基因在轉(zhuǎn)基因生物中表達(dá)的方法，由以下步驟組成a)使用表達(dá)構(gòu)建體制備轉(zhuǎn)基因生物，其中該構(gòu)建體至少由權(quán)利要求1的啟動子和基因的可讀框組成，其中所述啟動子與所述基因可操作地定位，用于表達(dá)所述基因。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述生物是植物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述植物是雙子葉植物、單子葉植物或裸子植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于調(diào)控外源基因在轉(zhuǎn)基因生物中表達(dá)的啟動子,其中包括含有選自SEQ ID NOS:1－3所示序列的啟動子的鑒別特征的啟動子,和功能片段或其衍生物,其中所述啟動子經(jīng)修飾與所述外源基因可操作地定位,以表達(dá)所述基因。
文檔編號C12N15/09GK1377418SQ00813866
公開日2002年10月30日 申請日期2000年10月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月4日
發(fā)明者L-P·維吉納, M-A·德奧斯特 申請人:麥迪卡格公司