用于處理骨病或牙病的乳蛋白水解物的制作方法

專利名稱：用于處理骨病或牙病的乳蛋白水解物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乳蛋白水解物在制造用于治療或預(yù)防骨病或牙病的組合物中的用途；本發(fā)明還涉及治療骨病或牙病的方法，包括施用有效量的乳蛋白水解物。
在本說明書的內(nèi)容中，詞語＂含有＂是指＂除......外包括＂。不能理解為＂僅由其組成＂。
在本說明書的內(nèi)容中，術(shù)語＂可生物利用的＂指能夠越過腸屏障并且能夠在血液中以活性形式回收。術(shù)語＂骨病或牙病＂是指其中涉及鈣并且影響到骨組織健康包括鈣吸收、保留、再吸收或鈣化的病況。
CGMP是酪蛋白-糖大分子肽的簡寫，CGMP-Ca和CGMP-Na是其鈣鹽和鈉鹽的簡寫。酪蛋白-糖大分子肽是κ-酪蛋白糖-肽。
＂乳蛋白水解物＂是指可以經(jīng)過用胰蛋白酶至少部分水解后從奶中提取的多肽。
＂多肽＂指含有兩個或多個氨基酸的任何肽或蛋白質(zhì)，其中所說的氨基酸通過肽鍵或修飾的肽鍵相連接，即肽同配物。它們可以含有除20個基因編碼氨基酸外的氨基酸。＂多肽＂包括通過自然加工修飾的氨基酸序列，例如通過翻譯后加工，或者通過本領(lǐng)域公知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾的氨基酸序列。這種修飾在基本教科書中都有所描述，并且在專著以及長篇研究文獻(xiàn)中有更詳細(xì)描述。修飾可以發(fā)生在多肽的任何部位，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端?？梢岳斫?，在指定多肽的多個位點(diǎn)處可以存在相同程度或不同程度的相同類型的修飾。而且，一定的多肽中可以含有很多類型的修飾。多肽可以是因遍在蛋白化作用而呈支鏈狀，或者它們可以是環(huán)狀，具有或不具有分支。環(huán)狀、支鏈或分支環(huán)狀的多肽可以是翻譯后自然加工產(chǎn)生的或者可以通過合成方法來制造。修飾包括乙?；?、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素共價連接、血紅素共價連接、核苷酸或核苷酸衍生物共價連接、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物共價連接、磷脂酰肌醇共價連接、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、形成共價交聯(lián)、胱氨酸形成、焦谷氨酸鹽形成、甲?；ⅵ敏然?、糖基化、CPI固定形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋、硒化、硫酸化、轉(zhuǎn)化RNA介導(dǎo)的向蛋白質(zhì)添加氨基酸如精氨?；约氨樵诘鞍谆?例如參見《蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和分子性能》第2版，T.E.Creighton、W.H.Freeman和Company編，New York，1993；wold.F.＂翻譯后蛋白質(zhì)修飾觀點(diǎn)和展望＂，《蛋白質(zhì)的翻譯后共價修飾》第1-12頁，B.C.Johnson編，Academic Press，New York，1983；Seifter等＂蛋白質(zhì)修飾和非蛋白質(zhì)輔因子＂，Meth Enzymol(1990)182626-646和Rattan等，＂蛋白質(zhì)合成翻譯后修飾和老化＂，Ann NY AcadSci(1992)66348-62)。
在本說明書的內(nèi)容中，術(shù)語＂模擬物＂和＂同源物＂是按照本領(lǐng)域的定義并且指保持所述活性的變異體。＂變異體＂指不同于參比多肽、但保持了基本特性的多肽。通常來說，不同性是有限的，以致參比多肽和變異體的序列增體上非常接近并且很多結(jié)構(gòu)域是相同的。變異體和參比多肽可能在氨基酸序列中一個或幾個任意組合的置換、增加、缺失的區(qū)別。被置換或插入的氨基酸可以是或不是由遺傳密碼編碼的。多肽的變異體可以是自然存在的，如等位變異體，或者可以是自然存在中不知道的變異體。多核苷酸和多肽的非自然存在的變異體可以通過誘變技術(shù)或通過直接合成來制造。
＂同源性＂是本領(lǐng)域已知的并且指兩個或多個多肽序列之間的關(guān)系，通過比較序列而測定。本領(lǐng)域中，＂同一性＂也指多肽或多核苷酸序列之間序列的關(guān)系程度，可以通過將兩串序列配比來測定。通過已知方法容易計算＂同一性＂或＂同源性＂，所述的方法包括但不局限于以下中的描述《計算分子生物學(xué)》Lesk，A.M編，牛津大學(xué)出版社，New York，1988；《生物計算信息學(xué)和染色體組計劃》Smith，D.W.編，Academic Press，New York，1993；《序列數(shù)據(jù)的計算機(jī)分析》第I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G編，Humana Press，New Jersey，1994；《分子生物學(xué)中的序列分析》von Heinje，G.，Academic Press，1987以及《序列分析引物》Gribskov，M.和Devereux，J.編，M Stockton Press，New York，1991以及Carillo，H.，和Lipman.D.，SIAM J.《應(yīng)用數(shù)學(xué)》481073(1988)。測定同一性的優(yōu)選方法設(shè)計成獲得測試序列之間的最大匹配。測定同一性或同源性程度的方法被編輯了成公眾可獲得的計算機(jī)程序。測定兩個序列之間同一性或相似性的優(yōu)選的計算機(jī)程序方法包括(但不局限于此)GCG程序包(Devereux，J等，核酸研究12(1)387(1984))，BLASTP、BLASIN和PASTA(Atschul，S.F.等，分子生物學(xué)雜志215403410(1990)。BLAST X程度是從NCBI和其它來源可公眾獲得的(BLAST手冊，Altscbul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；AItschul，S.等，分子生物學(xué)雜志215403410(1990)。也可以使用公知的Smith Waterman算法來測定同一性。
多肽序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括算法Needleman等，分子生物學(xué)雜志48443-453(1970)比較基質(zhì)來自Hentikoff and Hentikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915-10919(1992)的BLOSSUM62間隙補(bǔ)償(Gap Penalty)12，間隙長度補(bǔ)償(Gap Length Penalty)4。
使用這些參數(shù)的有用程序是Genetics Computer Group的可公共獲得的＂通用匯編＂程序。前述的參數(shù)用于肽比較時(以及沒有最終通用匯編程序的補(bǔ)償)為缺省參數(shù)。
BLAST表示基本局部順序檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool)(Altschul SF(1993)J Mol Evol 36290-300；Altschul.S F等分子生物學(xué)雜志215403-10)，產(chǎn)生用于測定序列相似性的核苷酸和氨基酸序列的順序。由于順序的局部性質(zhì)，BLAST特別適用于測定精確的匹配或確認(rèn)同源性。當(dāng)解決主序列模式和次結(jié)構(gòu)間隙補(bǔ)償時，其它算法如描述于Smith R F和T FSmith(1992蛋白工程535-51)中的算法也可以使用BLAST方法(1993；Proc Nat Acad Sci 905873-7)(引入這里作為參考)用于研究查詢序列與數(shù)據(jù)庫序列之間的匹配，以評價所發(fā)現(xiàn)的任何匹配的統(tǒng)計學(xué)意義，并且僅報道滿足使用者所選有效性閾值的那些匹配。在本申請中，閾值設(shè)定為至少40％同一性或同源性。
CGMP是一種乳蛋白水解物。其是唾液酸化的(sialylated)大分子肽并且占κ-酪蛋白部分的約40％。CGMP的產(chǎn)生有許多方式，包括κ-酪蛋白的腸內(nèi)消化，在其中首先通過胃內(nèi)的蛋白酶(凝乳酶和/或胃蛋白酶)作用產(chǎn)生水解產(chǎn)物。CGMP還在乳凝結(jié)的初期階段通過凝乳酶的作用而得到釋放并且進(jìn)入乳清部分(甜乳清)。之后，從甜乳清中工業(yè)分離CGMP并且以鈉-CGMP(NaCGMP)的形式洗脫出來。由NaCGMP進(jìn)一步產(chǎn)生鈣CGMP(CaCGMP)。
已知CGMP可以粘附在各種類型的表面上，如聚苯乙烯(J.R.Neeser等，傳染和免疫，56，12，3201-3208，1988)以及唾液覆蓋的羥磷灰石(J.R.Neeser等，口部微生物免疫，9，193-201，1994)，由此防止細(xì)菌對表膜包著的牙齒的粘著、從而可以通過抑制誘發(fā)齲的致齲細(xì)菌的粘附來保護(hù)齲齒。B.Chabance等(Biochimie 80，155-165，1998)中顯示了在食用之后，可以在胃和血液中檢測到很多得自α、β或κ-酪蛋白的肽包括CGMP最多8小時，說明CGMP可以越過腸屏障。
迄今，歸于吸收肽的主要生物學(xué)作用是減少血小板凝集或血液凝固。這種作用的機(jī)理據(jù)顯示是由于纖維蛋白原和CGMP的N-末端十一肽(殘基106-116)之間存在結(jié)構(gòu)同源性。據(jù)證明這種十一肽可以結(jié)合作用于活化血小板的整聯(lián)蛋白受體(正常情況下是纖維蛋白原的γ-鏈結(jié)合在其上)并且由此減少凝結(jié)。
被認(rèn)為是大眾首要健康問題的骨病的一個實(shí)例是骨質(zhì)疏松癥。事實(shí)上，絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松性骨折每年要影響約一百五十萬人。據(jù)報導(dǎo)，美國每年有約300,000起新的髖骨骨質(zhì)疏松、650,000起脊椎骨折和200,000起遠(yuǎn)側(cè)前臂骨折。髖骨骨折之后第一年的死亡率達(dá)到20％(美國流行病雜志1001-1005(1993))并且據(jù)估計每年花費(fèi)在治療這些患者的費(fèi)用達(dá)60-100億美元。
盡管可獲得獲得有效藥物來減少骨損失，還期望有可以與藥物聯(lián)合使用或者可以單獨(dú)使用的營養(yǎng)替代品。迄今為止，關(guān)于預(yù)防骨損失的研究主要集中于更經(jīng)典的營養(yǎng)素，如鈣和維生素D。然而，經(jīng)典營養(yǎng)素對預(yù)防骨損失的能力是有局限性的。
據(jù)發(fā)現(xiàn)，含有CGMP的組合物對維持骨或牙的健康或者治療骨病或牙病具有顯著的積極作用。體外試驗顯示，CGMP可以減少骨降解細(xì)胞(破骨細(xì)胞)的活性和增加骨形成細(xì)胞(成骨細(xì)胞)的活性，說明CGMP對骨健康具有潛在的益處。在骨損失的生長動物模型中進(jìn)行骨形成細(xì)胞和骨降解細(xì)胞(即成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞)的體外試驗，發(fā)現(xiàn)CaCGMP可明顯降低骨損失，并且在食用CaCGMP和NaCGMP的動物中鈣的保留性更大。此外還發(fā)現(xiàn)CaCGMP和NaCGMP可以降低絕經(jīng)骨損失動物模型中(切除卵巢的大鼠)的骨損失。除此之外，發(fā)現(xiàn)不同形式的CGMP及其肽對生活周期中不同階段的骨健康具有益處。CGMP的效果是預(yù)料不到的，因為盡管喝奶的有益效果得到充分的描述，但現(xiàn)在竟出人意料地發(fā)現(xiàn)乳蛋白水解物具有預(yù)防或治療骨病或牙病的效果。
雖然如此，但現(xiàn)有技術(shù)中并沒有指示過乳蛋白水解物特別是CGMP用于治療骨病的用途，例如通過抑制哺乳動物中的骨再吸收或骨損失；或者促進(jìn)鈣的吸收、保留或鈣化；或者兩者兼有。
本發(fā)明滿足上述提出的問題。
因此，本發(fā)明第一個方面是提供一種用于預(yù)防或治療骨病或牙病的組合物，該組合物中含有乳蛋白水解物。
本發(fā)明第二個方面是提供乳蛋白水解物在制造用于治療或預(yù)防骨病或牙病的組合物中的用途。
本發(fā)明的第三個方面是提供一種治療骨病或牙病的方法，包括施用有效量的乳蛋白水解物。
本發(fā)明的一個優(yōu)點(diǎn)是提供可以口服施用的組合物。這比起通過注射給藥的常規(guī)治療對患者來說更安全和更方便。
優(yōu)選，乳蛋白水解物能夠抑制骨再吸收或骨損失；或者能夠促進(jìn)鈣的吸收、保留或鈣化；或者兩者兼有。
優(yōu)選，乳蛋白水解物中含有酪蛋白水解物，更優(yōu)選是酪蛋白糖大分子肽(CGMP)、其保持CGMP能力以抑制骨再吸收或骨損失或促進(jìn)鈣的吸收、保留或鈣化或兩者兼有的可生物利用形式的模擬物、同源物或片段或者其組合。更優(yōu)選是CGMP的鈉鹽或鈣鹽或其混合物。首選是CGMP的鈉鹽。
優(yōu)選，在一個實(shí)施方案中，CGMP在組合物中的含量為約0.01-約10％干物質(zhì)重量，優(yōu)選約0.5-約5％干物質(zhì)重量。
優(yōu)選，在一個實(shí)施方案中，組合物含有鈣。優(yōu)選，在本發(fā)明一個實(shí)施方案中，每250g組合物含有約15-約64％RDA的鈣(RDA鈣是1000mg)，即每125g組合物含有約75-約320mg鈣。更優(yōu)選，酶250g組合物含有約50％RDA的鈣，即每125g組合物含有250mg鈣。
優(yōu)選，在一個實(shí)施方案中，組合物含有蛋白質(zhì)源和至少0.01％干物質(zhì)重量的可生物利用形式的CGMP。作為蛋白質(zhì)源，優(yōu)選使用適宜形式的膳食蛋白。特別優(yōu)選乳蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白或其兩種或多種的混合物。組合物還可以含有碳水化合物源和/或脂肪源。
優(yōu)選，本發(fā)明提供一種食品補(bǔ)劑和/或食物制品，其中含有至少0.01％干物質(zhì)重量的可生物利用形式的用于抑制哺乳動物中骨再吸收或骨損失或促進(jìn)鈣的吸收、保留或鈣化或兩者兼有的CGMP。
優(yōu)選，組合物含有碳水化合物源、脂肪源或蛋白質(zhì)源或者至少含有其中兩種的組合。更優(yōu)選，組合物含有約15-約25％總熱量的蛋白質(zhì)、約10-約30％總熱量的脂肪和約40-約60％總熱量的碳水化合物。優(yōu)選，蛋白質(zhì)的至少一部分是以酪蛋白糖大分子肽(CGMP)的形式提供的。
優(yōu)選，組合物含有足夠滿足每日需求量的礦物質(zhì)和維生素。
優(yōu)選，將營養(yǎng)組合物摻加到食品配方制劑中，例如嬰兒配方食品。
優(yōu)選，組合物含有約1-約50g、優(yōu)選5-約15g、首選5-約10g CGMP每100g食品配方。
優(yōu)選，施用組合物以提供足夠量的CGMP抑制人或?qū)櫸锕窃傥栈蚬菗p失或促進(jìn)鈣的吸收、保留或鈣化或其組合。通過施用CGMP直至看到適當(dāng)效果，可以不困難地確定準(zhǔn)確的量。CGMP的劑量優(yōu)選為每天約1-約50g，更優(yōu)選9-約18g每天，首選3-約6g每天，全天分兩次或三次施用。
優(yōu)選，CGMP通過離子交換處理含CGMP的液體乳汁原料來獲得。乳汁源的適宜起始原料可以包括例如-通過用無機(jī)酸或酸化酶使脫脂乳酸沉淀獲得的天然酪蛋白的凝乳酶水解產(chǎn)物，其中選擇性添加鈣離子，-酪蛋白酸鹽的凝乳酶水解產(chǎn)物，-將凝乳酶凝固的酪蛋白分離后獲得的甜乳清，-甜乳清或脫礦質(zhì)的甜乳清，例如通過電滲析和/或離子交換和/或反滲透，-甜乳清的濃縮物，-通過將甜乳清超濾和滲濾獲得的乳清蛋白的濃縮物，-從甜乳清中將乳糖結(jié)晶的母液，-甜乳清超濾的滲透物。
獲得CGMP的優(yōu)選方法在例如WO98/53702中有所描述，并且包括將液體原料去陽離子，以致pH為1-4.5，讓所說的液體與疏水基質(zhì)的弱陰離子樹脂(主要是呈堿性形式)接觸直至達(dá)到穩(wěn)定的pH，然后將樹脂與液體產(chǎn)物分離，回收液體產(chǎn)物，并且從樹脂中解吸出CGMP。
優(yōu)選，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，組合物含有益生菌。優(yōu)選，益生菌是乳酸菌。更優(yōu)選，選自嗜酸乳桿菌、卷曲乳桿菌、食淀粉乳桿菌、雞乳桿菌、加氏乳桿菌和約氏乳桿菌；類干酪乳桿菌、路氏乳桿菌、瑞士乳桿菌、短乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌，特別是干酪乳桿菌、類干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌；德氏乳桿菌，特別是德氏乳桿菌乳亞種、德氏乳桿菌德氏亞種和德氏乳桿菌保加利亞亞種以及雙歧桿菌，特別是嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、長雙歧桿菌以及腸膜明串株菌，特別是腸膜明串株菌乳脂亞種。首選細(xì)菌是嗜酸乳桿菌La10(ATCC11975)。這些細(xì)菌所提供的優(yōu)點(diǎn)在于它們對增強(qiáng)鈣的吸收具有驚人的積極影響。當(dāng)組合物含有嗜酸乳桿菌(La10)時，對骨形成和吸收的影響尤其出人意料。優(yōu)選，在本發(fā)明一個實(shí)施方案中，組合物含有約107-約109cfu/ml或/g的益生菌。更優(yōu)選，含有約108cfu/ml的益生菌。
優(yōu)選，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，每天分兩份提供約250-約300g劑量的組合物。更優(yōu)選，每天約250g劑量，即每天兩個約125g的劑量。
優(yōu)選，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，組合物含有選自以下物質(zhì)的營養(yǎng)素/非營養(yǎng)素，包括每250g組合物約15-約50％RDA的鎂、檸檬酸蘋果酸鈣或檸檬酸乳酸該或奶鈣、磷、鐵、碘、鋅、銅、硒；每125g組合物約7.5-約25％RDA的維生素D、D3、A、B1、B2、B6、B12、C、E、K、煙酸、葉酸、泛酸、每125g組合物約15-約33％RDA的生物素；每250g組合物約6-約40g的益生素(如纖維、纖維素)；每250g組合物約50mg-約2g的酪蛋白磷酸肽(CPP)；每250g組合物約25-50mg的異黃酮；每mg蛋白質(zhì)約1.5-約2.5ng的得自奶乳的生物活性肽，如TGF-、PTHrp。
本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將從以下給出的關(guān)于優(yōu)選實(shí)施方案的描述以及參看附圖中顯而易見。


圖1顯示了對照、NaCGMP和CaCGMP類物質(zhì)的平均[H3]四環(huán)素排泄量以及標(biāo)準(zhǔn)誤差的線形圖。每條線代表每類物質(zhì)在13周周期內(nèi)的[H3]四環(huán)素排泄(骨再吸收)。
圖2顯示了CaCGMP和NaCGMP對切除卵巢大鼠中小梁骨密度長期損失的作用。
現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，不同形式的CGMP(NaCGMP和CaCGMP)對Ca的吸收和骨的代謝具有明顯的生物學(xué)作用。不期望得到理論支持，據(jù)揣測CaCGMP(含有2.3％Ca)可以使Ca在腸中保持為可溶性的形式，以與酪蛋白磷酸肽相似的方式，并由此增加Ca的生物利用率。其次，鑒于其抗粘性和對羥磷灰石的親合性，據(jù)推測CGMP肽可以對骨產(chǎn)生直接的生物作用，也許通過削弱破骨細(xì)胞對骨表面的粘附并由此減少骨損失。在這些假設(shè)的支持下，研究表明CGMP的Na形式可以減少分離破骨細(xì)胞對牙質(zhì)切片的骨再吸收活性。
為試驗這些假設(shè)，研究了含有兩種形式CGMP(NaCGMP和CaCGMP)的組合物以大約4.5％總飲食的量對四環(huán)素標(biāo)記大鼠中骨損失的作用，所說的這種大鼠是骨損失的合法動物模型(Am.J.Physiol 259R679-R689)。在＂誘導(dǎo)＂骨損失的環(huán)境下，該模型在短時間內(nèi)(＜14d)顯示出對骨損失藥物和非藥物抑制劑(如二膦酸酯、植物衍生的組分)的高度敏感。此外，由于在實(shí)驗期間每天收集尿和糞便是可行的，因而可以使用這種模型來測定被吸收、保留和排泄的Ca的量(即Ca的平衡)。總之，這種骨損失動物模型用于測試來自飲食的CGMP對骨損失和Ca吸收的短期效果是足夠用和靈敏的。
優(yōu)選，在一個實(shí)施方案中組合物含有至少一種蛋白質(zhì)源和CGMP。優(yōu)選使用膳食蛋白質(zhì)作為蛋白質(zhì)的來源。膳食蛋白質(zhì)可以是任何適宜的膳食蛋白質(zhì)，例如動物蛋白(如乳蛋白、肉蛋白或蛋蛋白)；植物蛋白質(zhì)(如大豆蛋白、小麥蛋白、稻米蛋白或豌豆蛋白)；游離氨基酸的混合物或其組合。特別優(yōu)選諸如酪蛋白、乳清蛋白的乳蛋白或大豆蛋白。
組合物還可以含有碳水化合物源和/或脂肪源。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物含有脂肪源，脂肪源優(yōu)選提供營養(yǎng)制劑的約5-約55％能量；例如提供約20-約50％能量。構(gòu)成脂肪源的脂類可以是任何適宜的脂肪或脂肪混合物。植物脂肪是特別適宜的，例如大豆油、棕桐油、椰子油、紅花油、向日葵油、玉米油、低芥酸菜籽油、卵磷脂等等或其兩種或多種的混合物。如果需要也可以添加諸如乳脂肪的動物脂肪。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物含有碳水化合物源。其優(yōu)選提供營養(yǎng)組合物的約40-約80％能量?？梢允褂萌魏芜m宜的碳水化合物，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖漿和麥芽糖糊精或者其兩種或多種的混合物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物含有膳食纖維。如果需要，其優(yōu)選占營養(yǎng)制劑的最多約5％能量。膳食纖維可以來自任何適宜的來源，包括例如大豆、豌豆、燕麥、果膠、瓜爾豆膠、阿拉伯樹膠、果糖低聚糖或其兩種或多種的混合物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物含有一種或多種適宜的維生素和/或礦物質(zhì)，其含量滿足適宜的指標(biāo)。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物含有一種或多種可以摻加到營養(yǎng)制劑中的食用級乳化劑，例如包括二乙酰酒石酸的甘油單酸酯和二酸酯、卵磷脂以及甘油單酸酯和二酸酯或者其兩種或多種的混合物?？梢园愃七m宜的鹽和穩(wěn)定劑。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物是可腸內(nèi)施用的，例如以粉末、液體濃縮物或即飲飲料的形式。如果需要生產(chǎn)粉末類型的營養(yǎng)制劑，則將經(jīng)過均質(zhì)的混合物轉(zhuǎn)移到適宜的干燥設(shè)備中如噴霧干燥器或冷凍干燥器中并且使其轉(zhuǎn)變成粉末。
在另一個實(shí)施方案中，可以使典型的食物制品富含CGMP。例如，發(fā)酵乳、酸奶、鮮奶酪、凝乳酶酶凝奶、糖食棒、早餐谷物片或棒、飲品、奶粉、大豆基料的產(chǎn)品、非乳發(fā)酵制品或臨床營養(yǎng)用的營養(yǎng)補(bǔ)劑。CGMP的添加量優(yōu)選為至少約0.01％重量。
在另一個實(shí)施方案中，可以將組合物摻入糖食制品中，例如甜食或加甜飲料。
以下實(shí)施例僅是以舉例說明的方式給出的并且不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)容的限制。除非另有說明，百分?jǐn)?shù)和份數(shù)均按重量計。
將脫礦質(zhì)的乳清粉末溶解于去離子水中，在除去陽離子之后，溶液的初始pH為3.8。在前面的設(shè)備中，于8℃下處理392kg溶液，同時在23kg聚苯乙烯(IMAC HP 661 TM，Rohm & Haas，再生呈OH-形式)基疏水基質(zhì)的弱陰離子樹脂的存在下將其在反應(yīng)器中攪拌4小時。pH穩(wěn)定到4.89說明反應(yīng)結(jié)束。然后取出液體并且如上回收樹脂。
將液體通過蒸發(fā)濃縮至45％干物質(zhì)之后，將濃縮物在干燥塔中噴霧干燥。
HPLC分析濃縮物顯示反應(yīng)已去除了89％的起始CGMP。此外，粉末含有9.1％的乳清蛋白，相當(dāng)于乳清蛋白的產(chǎn)率為90％。
為回收CGMP，將樹脂陸續(xù)用去離子水、30L 0.5％HCl水溶液和30L去離子水洗滌，然后用40L 2％Ca(OH)2水溶液洗脫兩次。用30L去離子水漂洗。將洗脫液體積和漂洗液體積合并，之后通過用具有3000道爾頓標(biāo)稱截流的膜超濾，濃縮至25L體積，然后將截留物冷凍干燥，獲得900g CGMP，相當(dāng)于起始CGMP的產(chǎn)率為80％。實(shí)施例2從大鼠骨中分離的解集破骨細(xì)胞對牙質(zhì)的吸收材料和方法從1-2天齡的大鼠切開的股骨和脛骨中分離破骨細(xì)胞。用解剖刀將骨刮到含Earle氏鹽與15mM NaHCO3和10％胎牛血清(FBS)的MEM中。將細(xì)胞懸浮液添加到象牙切片上，并且讓細(xì)胞粘附40分鐘的培養(yǎng)時間。將非粘附的細(xì)胞洗掉之后，將各個切片放入48-孔的組織培養(yǎng)皿中并且用含10％FBS和不同濃度如實(shí)施例1制備的CGMP的培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時。將細(xì)胞固定并且對耐酒石酸鹽的酸性磷酸酶(TRAP)進(jìn)行染色，所說的TRAP是破骨細(xì)胞的一個特定標(biāo)記，接著對細(xì)胞計數(shù)。然后通過超聲除去細(xì)胞。經(jīng)洗滌和干燥后，將切片噴金并且使用正切光源計算凹坑數(shù)。在一個實(shí)驗中，將象牙切片用CGMP預(yù)處理1小時。之后，除去含CGMP的培養(yǎng)基并且讓破骨細(xì)胞粘附在牙質(zhì)的礦質(zhì)表面上。
經(jīng)鈣-電極測定，以10mg/ml濃度溶于α-MEM中的CGMP和牛血清白蛋白分別結(jié)合了約0.3-0.4mM和約0.2mM的Ca。結(jié)果結(jié)果見表1。首先，用＂破骨細(xì)胞吸收試驗＂來評價CGMP對破骨細(xì)胞形成的作用。將CGMP以不同的濃度添加到細(xì)胞中，所說的細(xì)胞包括添加測試物質(zhì)前被允許粘附在牙質(zhì)切片(4.0×4.0×0.1)mm上的不成熟和成熟的大鼠破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞的混合物。被標(biāo)記的除外，所有培養(yǎng)在均在10％胎牛血清(FBS)的存在下進(jìn)行。使用牛血清白蛋白作為多種蛋白質(zhì)。將細(xì)胞培養(yǎng)24小時。之后，使用兩種不同的破骨細(xì)胞庫，在16個分開培養(yǎng)的牙質(zhì)切片上尋找耐酒石酸鹽酸性磷酸酶陽性的多核細(xì)胞(TRAP+MNC)(第1行)。待計算破骨細(xì)胞數(shù)之后，通過超聲將其去除。之后，洗滌切片，空氣干燥并且固定到金屬盤上，在其中給它們噴涂金。使用裝配有正切光源的光學(xué)顯微鏡，由兩個不同的人來計算凹坑的數(shù)量。
數(shù)據(jù)顯示了使用兩個不同破骨細(xì)胞庫在16個單獨(dú)培養(yǎng)的牙質(zhì)切片上計算的凹坑數(shù)(第2行)。第3行顯示了第1行和第2行所示凹坑與TRAP+MNC的比。然后，研究當(dāng)在破骨細(xì)胞附著在礦質(zhì)表面上之后向培養(yǎng)基添加蛋白質(zhì)時的CGMP效果。如表1所示，第1行，CGMP對破骨細(xì)胞的數(shù)量僅具有微弱效果。在10mg/ml下效果明顯下降似乎并不特殊，因為白蛋白具有相似的效果。相反，在10mg/ml濃度下，CGMP減少了每象牙凹坑數(shù)量而白蛋白增加了每象牙凹坑數(shù)量(表1第2行)。由第1行和第2行計算，每破骨細(xì)胞的凹坑數(shù)量證明CGMP在1和10mg/ml濃度下可明顯抑制解集破骨細(xì)胞的骨再吸收活性(表1第3行)，而白蛋白刺激這種活性。表1CGMP對破骨細(xì)胞形成(第1行)、對破骨細(xì)胞的吸收活性(第2行)和對破骨細(xì)胞吸收活性(第3行)的效果
*不含F(xiàn)BS實(shí)施例3CGMP對骨肉瘤存活/增生的作用材料和方法1.細(xì)胞HOS58人骨肉瘤細(xì)胞該細(xì)胞系的特征在于是一種高分化型成骨細(xì)胞-類骨肉瘤細(xì)胞系(Kern等，1990，Calcif.Tiss.Int.46，Suppl.2，A54)，其在適宜的條件下可以被刺激成高分化顯型，由維生素D受體表達(dá)和礦化來指征。TE 85人骨肉瘤細(xì)胞該細(xì)胞系得自ATCC(CRL1543)，是一種得自人13y女性的成骨骨肉瘤細(xì)胞系。取決于培養(yǎng)基的組成，其可以生長成高密度或低密度。這些細(xì)胞是快速生長型成骨細(xì)胞類細(xì)胞，其特征在于分化不充分的早期成骨細(xì)胞。2.用MTT-四唑鎓比色試驗來定量測量細(xì)胞的增生和存活使用T.Mosman氏試驗體系(免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods)(1983)65，55-63)的改良方法來測定生長中細(xì)胞的細(xì)胞增生和在生長抑制培養(yǎng)中剩余細(xì)胞的存活能力。在處理周期結(jié)束時(48或72個小時)，將細(xì)胞用10LMTT-四唑鎓原料溶液(Sigma，5mg/ml PBS)每100L細(xì)胞培養(yǎng)基在CO2培養(yǎng)器最中于37℃下培養(yǎng)4小時。在反應(yīng)周期之后，通過抽吸仔細(xì)去除培養(yǎng)基-底物混合物并且將深藍(lán)色甲晶體在37℃下于100L 20％十二烷基硫酸鈉(SDS)中溶解過夜。在550nm下測定染料溶液的光密度。結(jié)果由高細(xì)胞密度培養(yǎng)物開始進(jìn)行CGMP對細(xì)胞存活/增生的效果，將所說高細(xì)胞密度培養(yǎng)物首先在10％FCS中生長1天，接著在1％FCS中生長2天，最后在不含血清、補(bǔ)充BSA培養(yǎng)基中用兩種試劑生長3天；或者以較低的初始細(xì)胞密度，用10％FCS生長1天，接著立即在不含血清、用補(bǔ)充BSA的培養(yǎng)基中用CGMP處理(表2)。表2CGMP對HOS58骨肉瘤細(xì)胞(第1行)、對TE 85人骨肉瘤細(xì)胞(第2行)MTT反應(yīng)的效果
兩個系列的實(shí)驗結(jié)果顯示，兩個培養(yǎng)條件下的整體效果類似。CGMP誘導(dǎo)了MTT反應(yīng)的劑量依賴性增加，同時TE 85是最兩種試劑最具響應(yīng)性的細(xì)胞類型。如表2所示，10mg/ml劑量的CGMP最大程度地刺激了TE 85的代謝活性，使其活性達(dá)到3倍多，在HOS 58細(xì)胞中也觀察到了相同的情形(表2)。實(shí)施例4含CGMP的發(fā)酵乳如下制備含1-4％脂肪的傳統(tǒng)發(fā)酵乳將全脂奶、低脂肪奶或者兩者的混合物標(biāo)準(zhǔn)化之后，加入0.05％重量實(shí)施例1制備的CGMPs。將整體在板式交換器中巴氏滅菌，將液體冷卻至發(fā)酵溫度，加入嗜熱或嗜常溫的乳酸發(fā)酵素并且進(jìn)行培養(yǎng)，直至達(dá)到pH＜5。
接下來按常規(guī)方式裝罐并且密封。
另一個實(shí)施方案是制備添加0.1％、0.25％和0.5％重量CGMPs的發(fā)酵乳。實(shí)施例5含CGMP的富含益生菌發(fā)酵和膠凝乳制備富含益生菌的發(fā)酵和膠凝乳。將89.3份含脂肪的奶與3.7份脫脂奶粉和約0.05重量的實(shí)施例1制備的CGMP混合，然后將混合物預(yù)加熱至70℃并且在92℃下巴氏滅菌6分鐘，并且冷卻至43℃之后將混合物用2％含嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的普通酸奶引酵物和5％約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii La-1，CNCM I-1225)培養(yǎng)。經(jīng)過在罐中調(diào)理后，在38℃下發(fā)酵直至pH4.6，然后將罐冷卻至6℃。
添加以下量的CGMP0.1％、0.25％和0.5％重量。據(jù)顯示，如此獲得的產(chǎn)品對骨形成細(xì)胞的代謝活性具有增加的刺激效果并且對骨再吸收具有抑制效果。實(shí)施例6含CGMP的富含益生菌發(fā)酵和膠凝乳按實(shí)施例5的描述制備發(fā)酵和膠凝乳，其中用嗜酸乳桿菌La-10(雀巢Culture collection，Lausanne，瑞士)代替約氏乳桿菌。實(shí)施例7含CGMP的腸內(nèi)組合物由＂低溫＂脫脂奶粉制備具有6.3kJ/ml能量密度且含有8％(p/v)蛋白質(zhì)的腸內(nèi)組合物，所說的＂低溫＂脫脂奶粉即在熱受控條件下干燥的脫脂奶粉。將20kg低溫脫脂奶粉分散到100kg約50-55℃脫礦質(zhì)水中。通過讓脫礦質(zhì)水經(jīng)過，將分散液微濾直至除去600kg滲透物。然后將保留物進(jìn)一步濃縮至大約60kg，其中存在21％干物質(zhì)含量，基于干物質(zhì)蛋白質(zhì)含量為82％。
為制備腸內(nèi)組合物，將2.3kg液體保留物在55℃下與600g麥芽糖糊精、200g蔗糖、20.3g Tri-K檸檬酸鹽H2O、9.2g MgCl26H2O、5.8g NaCl和約0.5-1％重量的實(shí)施例1制備的CGMP混合。待配料溶于保留液中后，加入脫礦質(zhì)水使分散液的總重量達(dá)到4.7kg。然后將pH調(diào)整至6.8，之后引入300g脂肪相，分散液的總重量達(dá)5kg。
均質(zhì)和殺菌后，產(chǎn)品具有令人愉快的甜味。據(jù)顯示其對骨再吸收具有抑制效果并且對鈣化具有刺激效果。實(shí)施例8含CGMP的谷物棒制備膨化起始產(chǎn)品，將大麥、小麥、玉米或燕麥粉在雙螺桿擠出機(jī)中于約350rpm的螺桿速度下在大約12％水的存在下處理約15秒。處理之后，讓膨化產(chǎn)品以2-3mm長的顆粒形式離開擠出機(jī)，然后在100℃下干燥20分鐘。如此獲得的產(chǎn)品具有多孔狀結(jié)構(gòu)并且具有如下組成可食纖維類31％蛋白質(zhì)類21％糖類37.5％脂類6.5％灰分2.4％水1.6％將該膨化產(chǎn)品摻加到欲治療糖尿病的棒狀食品中，其具有如下組成膨化產(chǎn)品39.4％燕麥片16.7％山梨糖醇8.4％果糖8.5％蘋果丁6.1％稻米脆皮4.1％明膠4.0％杏粉2.5％棕桐油3.0％CGMP 2.5％(實(shí)施例1制備)水4.8％實(shí)施例9含CGMP的食品補(bǔ)劑將來源于人的約氏乳桿菌(La-1，CNCM I-1225)菌株培養(yǎng)物與實(shí)施例1制備的CGMP混合，并且按照EP0818529給出的工藝噴霧干燥，以便獲得含約5％重量CGMP的食品補(bǔ)劑。
所獲得的粉末可以用作食品補(bǔ)劑?？梢詫⑦@種含CGMP的粉末撒在早餐谷物食品、奶制品或其它食物制品上。實(shí)施例10含CGMP的食品補(bǔ)劑按實(shí)施例9的描述制備食品補(bǔ)劑除用用嗜酸乳桿菌La-10(雀巢Cultyrecollection，Lausanne，瑞士)代替約氏乳桿菌，或者使用兩種菌株的混合物。實(shí)施例11CGMP對骨損失模型(四環(huán)素標(biāo)記的大鼠)中骨損失和鈣平衡的作用使用合法的骨損失模型(四環(huán)素標(biāo)記的大鼠)來測試4.5％飲食的CaCGMP和NaCGMP是否可以降低短期骨損失和影響鈣吸收。據(jù)顯示CaCGMP的消耗與對照相比，顯著地降低了大約20％的骨損失(p＝0.01)。NaCGMP與對照(p＝0.01)相比降低了大約20％的骨損失(不顯著)。此外，在消耗CaCGMP或NaCGMP的動物中，鈣的吸收高于對照組。在CaCGMP和NaCGMP組中，鈣的保留明顯均高于對照。
在所用的模型中，CaCGMP和NaCGMP都可以正向影響攝取Ca的吸收和保留。相比對照CaCGMP對骨損失的降低非常顯著，說明CGMP的Ca形式比Na形式更顯有益性。NaCGMP和CaCGMP對表觀鈣吸收和保留的效果下表3中顯示了NaCGMP、CaCGMP和對照組的Ca吸收率(％)、Ca的保留(mg/天)和Ca保留率(％)的平均值(括號內(nèi)是標(biāo)準(zhǔn)偏差)，并且繪制成
圖1。沒有表觀分離數(shù)據(jù)出現(xiàn)，并且數(shù)據(jù)的分布說明測定組與組之間區(qū)別的經(jīng)典ANOVA方法是適宜的。表3對照、NaCGMP和CaCGMP組的Ca吸收率(％)、保留(mg/天)和保留率(％)的平均值(括號內(nèi)是標(biāo)準(zhǔn)偏差)
鈣吸收率CaCGMP和NaCGMP組的表觀Ca吸收率分別平均比對照組的平均表觀Ca吸收率高5.6％和5.8％。使用用于多重對比的Dunett氏試驗進(jìn)行這三個組的統(tǒng)計學(xué)比較，顯示至少一個組的平均值是明顯不同的。然而，通過使用95％置信度，兩個CGMP組和對照組之間Ca吸收率的差異是沒有統(tǒng)計學(xué)意義的。CaCGMP和NaCGMP組之間沒有發(fā)現(xiàn)差別。鈣的保留平均來說，對照組保留了26.1(2.3)mg Ca/天，CaCGMP保留了30.4(2.5)mg/天并且NaCGMP保留了28.1(2.0)mg/天，因此，CaCGMP組對鈣的保留比對照平均估計增加了4.25mg/d，而NaCGMP是1.98mg/d。使用用于多重對比的Dunett氏試驗比較兩個CGMP組與對照組的Ca保留值，顯示CaCGMP組對Ca的保留顯著地高于對照組(p＜0.05)。NaCGMP組顯出較高Ca保留的趨勢，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義。使用Tukey氏多重對比試驗比較兩個CGMP組，但在CaCGMP和NaCGMP之間沒有發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。鈣保留率計算Ca的保留率，以便表達(dá)Ca保留量與Ca消耗量的百分比，由此考慮兩個組之間對Ca攝取的微小差別。通過單向ANOVA分析Ca保留率得到p-值為0.88，說明至少一個平均值可能明顯不同。使用用于多重對比的Dunett氏試驗，具有10％的顯著性程度，證明CaCGMP和NaCGMP具有平均比對照高差不多5.2％(絕對)的Ca保留率，然而這些差距均處于明顯性的邊緣。通過尿[H3]四環(huán)素含量定量測量骨損失每天測定[H3]四環(huán)素的排泄，測定13天，以便定量測量骨的損失。各個組的平均值示于
圖1。從
圖1中可以清楚看出[H3]四環(huán)素的排泄量在實(shí)驗的開始(第1天)基本上是相同的，但到第13天，三個組的情況彼此分開。使用用于多重對比的Dunett氏試驗對三個組進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較，顯示至少一個組的平均值是明顯不同的(p＝0.01)。使用Tukey氏多重對比試驗進(jìn)一步進(jìn)行組的比較，發(fā)現(xiàn)在CaCGMP和對照之間的區(qū)別具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
顯然，在所用的骨損失模型中，與對照相比，消耗一定量的CaCGMP(大約660mg/天)明顯降低了大約20％的尿四環(huán)素排泄和骨損失。消耗720mg的NaCGMP與對照相比降低了大約10％的四環(huán)素排泄，其是不明顯的。
干飲食中含有4.5％CaCGMP和4.7％NaCGMP，并且在將飲食與大約40％水混合之后，每天大約消耗的CGMP(根據(jù)持續(xù)5天的實(shí)驗期間所消耗的食物量來計算)為660mg CaCGMP和720mg NaCGMP。對平均成人來說，其相當(dāng)于大約18gCGMP每天。如果CaCGMP的最終目標(biāo)是減少經(jīng)絕后婦女或老人(其蛋白質(zhì)的攝取不太理想)的骨損失，則含有上限18gCGMP的膳食代用品類型的產(chǎn)品將是最合適派上用場的。實(shí)施例12CGMP對絕經(jīng)骨損失模型(被切除卵巢的老年大鼠)中骨損失和鈣平衡的作用測定CGMP在3個月期限內(nèi)是否可以降低被切除卵巢的大鼠因雌激素缺乏引起的骨損失。將40只老年大鼠隨機(jī)分成四組A、B、C或D。A組經(jīng)過SHAM操作(沒有結(jié)扎卵巢進(jìn)行手術(shù)過程)并且B組、C組和D組切除卵巢(即結(jié)扎卵巢)。A組和B組為對照組并且食用不含乳蛋白的飲食。C組的飲食中含有4.5％CaCGMP并且D組的飲食中含有4.5％NaCGMP。使用定量的計算機(jī)X線體層照相術(shù)(pQCT)在卵巢切除術(shù)之前取在關(guān)節(jié)間隙遠(yuǎn)側(cè)6mm處測定基準(zhǔn)骨密度。卵巢切除術(shù)之后5周和再5周后重復(fù)測定。正如預(yù)料到的，A組(SHAM對照)中的小梁骨密度(TBD)沒有變化，B組(切除卵巢的對照)損失了大約16％TBD，出人意料地是C組(消耗CaCGMP)和D組(消耗NaCGMP)分別損失了它們原始TBD的4.6％和6.4％。這說明CGMP在降低骨損失中起重要作用。
應(yīng)當(dāng)理解，對本發(fā)明所述優(yōu)選實(shí)施方案的各種改變和改進(jìn)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。這種改變和改進(jìn)是在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下可以作到的并且不會喪失其優(yōu)點(diǎn)。因此，這種改變和改進(jìn)將被所附的權(quán)利要求書所覆蓋。
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防或治療骨病或牙病的組合物，該組合物中含有乳蛋白水解物。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中乳蛋白水解物能夠抑制骨再吸收或骨損失；或者能夠促進(jìn)鈣的吸收、保留或鈣化；或者兩者兼有。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中乳蛋白水解物是酪蛋白糖大分子肽(CGMP)、其保持CGMP抑制骨再吸收或骨損失或促進(jìn)鈣的吸收、保留或鈣化能力的模擬物、同源物或片段或者其組合。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中CGMP、其模擬物、同源物或片段是鈉鹽或鈣鹽的形式。
5.權(quán)利要求3或4的組合物，含有約0.01-約10％干物質(zhì)重量的CGMP。
6.前述權(quán)利要求任一項的組合物，其是以用于人或?qū)櫸锏臓I養(yǎng)組合物的形式。
7.前述權(quán)利要求任一項的組合物，含有提供約7-約25％總能量的蛋白質(zhì)源、提供約25-約60％總能量的脂肪源和提供約28-約66％總能量的碳水化合物源、滿足每日需求量的礦物質(zhì)和維生素。
8.前述權(quán)利要求任一項的組合物在制造用于治療或預(yù)防骨病或牙病的組合物中的用途。
9.一種治療或預(yù)防骨病或牙病的方法，包括施用有效量的 1-7任一項的組合物。
全文摘要
一種用于預(yù)防或治療骨病或牙病的組合物,其含有乳蛋白水解物;乳蛋白水解物在制造用于治療或預(yù)防骨病或牙病的組合物中的用途以及一種治療骨病或牙病的方法,包括施用有效量的乳蛋白水解物。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中,乳蛋白水解物是酪蛋白糖大分子肽(CGMP)、其保持CGMP抑制骨再吸收或骨損失或促進(jìn)鈣的吸收、保留或鈣化能力的可生物利用形式的模擬物、同源物或片段或者其組合。
文檔編號A23L1/304GK1352528SQ00803922
公開日2002年6月5日 申請日期2000年2月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月25日
發(fā)明者J·－R·尼澤爾, E·奧富德卡文, R·菲利克斯, H·圖爾博格－雷納特, F·金蒂, D·巴克萊, R·穆爾鮑爾 申請人:雀巢制品公司