從植物原料中分離和回收蛋白質(zhì)和異黃酮的方法

專利名稱：從植物原料中分離和回收蛋白質(zhì)和異黃酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從含蛋白質(zhì)和異黃酮的植物原料中分離和回收蛋白質(zhì)和異黃酮的方法，更具體說，本發(fā)明涉及使用離子交換從植物原料中分離和回收蛋白質(zhì)和異黃酮的方法。
植物蛋白提供了世界范圍的重要營養(yǎng)源。例如，大豆是動(dòng)物和人類的極好營養(yǎng)來源。大豆蛋白可從大豆中工業(yè)化提取，得到的蛋白質(zhì)便宜、高營養(yǎng)源。分離出的大豆蛋白因其營養(yǎng)價(jià)值以及蛋白質(zhì)提供給食品或飲料的功能特性可用于很多飲食用途中。使用大豆蛋白的一些常見食品包括肉餡、乳化肉和腌泡肉；飲料，如營養(yǎng)飲料、運(yùn)動(dòng)飲料、強(qiáng)化蛋白飲料、果汁、乳、乳代用品和減肥飲料；干酪，如硬質(zhì)干酪和軟質(zhì)干酪、乳脂干酪和酪農(nóng)干酪；冷凍甜點(diǎn)，如冰淇凌、冰乳、低脂肪冷凍甜點(diǎn)和非乳冷凍甜點(diǎn)；酸奶；湯；布丁；焙烤制品；色拉調(diào)料；以及調(diào)味汁和涂抹料，如蛋黃醬和酸飲料(chipdip)。
某些植物如大豆、豌豆、菜豆和其它豆類中含有異黃酮和蛋白質(zhì)。異黃酮是植物雌激素化合物，據(jù)發(fā)現(xiàn)其可提供人類各種保健作用。例如，大豆中存在的異黃酮是染料木黃酮、黃豆苷原、黃豆黃素(glycitein)、芒柄花黃素(見式1)，和其天然配糖體和配糖體共軛物(見式2)。這里所說的“Mal”為“丙二?！鼻摇癆c”為“乙?！?。在除大豆外的植物中發(fā)現(xiàn)的另一種生物活性異黃酮是生原禪寧A(見式1)。式1
式2
和異黃酮有關(guān)的保健作用有很多，并且仍在繼續(xù)發(fā)現(xiàn)中。例如，一些異黃酮據(jù)發(fā)現(xiàn)可抑制乳腺癌和前列腺癌的發(fā)育，并且可減少乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞的編程性死亡。從大豆中提取的異黃酮還據(jù)發(fā)現(xiàn)可抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，降低總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的血清濃度，減少或抑制絕經(jīng)癥狀，抑制阿耳茨海默氏病，抑制因骨質(zhì)疏松引起的骨質(zhì)流失。
異黃酮與異黃酮化合物含量明顯的豆類的苦、豆味有關(guān)。因此，人們期望從含異黃酮和蛋白質(zhì)的植物原料中分離和回收去除了異黃酮的愉快味道的蛋白質(zhì)原料和具保健作用的異黃酮。
現(xiàn)有技術(shù)中已知有從含蛋白質(zhì)和異黃酮的植物材料中分離異黃酮的方法。例如，U.S.專利5,679,806提供了一種從植物材料中提取、分離和純化異黃酮的方法，該方法用醇溶劑提取植物材料以便從植物材料中提取異黃酮；讓含異黃酮的醇提取物吸附在反相基質(zhì)上，接著通過梯度洗脫從基質(zhì)中進(jìn)行特定的異黃酮解吸，其中異黃酮從回收的洗脫液中結(jié)晶。JP專利1-258669提供了一種方法，將大豆浸泡在溫水中讓異黃酮轉(zhuǎn)變成其糖苷配基的形式；然后用含水醇從大豆原料中回流提取糖苷配基異黃酮；將提取的液體冷凝并且干燥；將干燥的原料溶解于醇并吸附于反相樹脂；并且用含水醇從樹脂中洗脫異黃酮。
這些方法盡管令人滿意地從植物材料中分離和純化了異黃酮，但沒有提供從這些含異黃酮和蛋白質(zhì)二者的植物材料中回收純化的蛋白質(zhì)原料和異黃酮的方法。上述兩方法均使用了醇溶劑從植物材料中提取異黃酮。植物蛋白例如大豆蛋白是基本上不溶于醇溶液的，并且被作為與其它醇不溶性植物材料如植物纖維材料一同作為醇提取的副產(chǎn)品殘余物留下。
U.S.專利4,428,876(’876專利)提供了一種從含黃烷酮類化合物(flavanoid)和蛋白質(zhì)的植物材料中分離植物蛋白和黃烷酮類化合物包括異黃酮在內(nèi)的方法。用堿水溶液提取植物材料，形成含黃烷酮類化合物和蛋白質(zhì)的提取物，并且將提取物與不可提取的和不溶的植物材料分離。將提取物就此或者經(jīng)過酸化后加至非極性或弱極性吸附劑樹脂上，以便將黃烷酮類化合物吸附在樹脂上。酸化造成蛋白質(zhì)從提取物中沉淀。如果經(jīng)過酸化，則在將提取物施加至樹脂上之前從提取物中分離出沉淀的蛋白質(zhì)。將提取物施加至樹脂上之后，用水洗脫樹脂，并且收集洗脫液得到含碳水化合物的洗脫液，如果提取物沒有經(jīng)過酸化，則洗脫液中還含有蛋白質(zhì)。如果在施加至樹脂之前沒有從提取物中沉淀和分離蛋白質(zhì)，則將該水洗脫液酸化，沉淀和分離蛋白質(zhì)。然后通過用諸如甲醇或乙醇的極性溶劑洗脫樹脂，并且收集和濃縮洗脫液，來從樹脂中分離黃烷酮類化合物。
使用’876專利的方法，由于異黃酮的性質(zhì)和本方法所用樹脂和洗脫劑，異黃酮和碳水化合物/蛋白質(zhì)沒有徹底分開。如式1和2所示，異黃酮是具相對(duì)極性的化合物，特別是其天然配糖體或配糖體共軛物的形式。因其極性，異黃酮微弱地吸附到非極性或弱極性樹脂上。在含水環(huán)境中，蛋白質(zhì)和碳水化合物也是具相對(duì)極性的化合物，其與樹脂的結(jié)合性不很強(qiáng)。因此，異黃酮、碳水化合物和蛋白質(zhì)與樹脂的吸附，其本身并不能有效達(dá)到用溶劑洗脫樹脂時(shí)化合物的良好分離，因?yàn)榛衔锶菀讖臉渲兄脫Q出來，并且它們與樹脂的相互作用彼此沒有特別的差異。
由于異黃酮在洗脫劑中有相對(duì)的溶解性，’876專利的方法可將一些異黃酮與蛋白質(zhì)和碳水化合物分離。例如，如果最初使用的洗脫劑是水，提取物是大豆的提取物(其中包含異黃酮染料木黃酮和黃豆苷)，則染料木黃酮會(huì)隨蛋白質(zhì)和碳水化合物少量地洗脫出來，因?yàn)槿玖夏军S酮僅微溶于水，而黃豆苷會(huì)隨蛋白質(zhì)和碳水化合物洗脫出來，因?yàn)辄S豆苷可溶于水。
因此，現(xiàn)在所需要的是一種從含異黃酮和蛋白質(zhì)的植物材料中徹底分離和回收蛋白質(zhì)和異黃酮的有效的、工業(yè)上可行的方法。
本發(fā)明提供一種從植物材料中分離和收集異黃酮和蛋白質(zhì)的改進(jìn)的方法，該方法可有效和經(jīng)濟(jì)地以工業(yè)規(guī)模進(jìn)行。該方法涉及分離和收集異黃酮和植物蛋白，通過將含異黃酮和蛋白質(zhì)的澄清的植物蛋白提取物與極性離子交換樹脂接觸；讓異黃酮與極性離子交換樹脂結(jié)合；從離子交換樹脂中分離和回收去除了異黃酮的蛋白質(zhì)提取物；并且從離子交換樹脂中分離和回收異黃酮。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離和回收的異黃酮被轉(zhuǎn)變成其糖苷配基形式。
本發(fā)明的一個(gè)重要特點(diǎn)是通過將澄清的植物蛋白提取物與極性離子交換樹脂接觸來從植物蛋白中分離異黃酮，而不是與非極性或弱極性的樹脂接觸。使用極性離子交換樹脂大大有助于徹底分離和收集蛋白質(zhì)和異黃酮，因?yàn)楫慄S酮因其極性而穩(wěn)固吸附在極性樹脂上，并且當(dāng)提取物通過樹脂洗脫時(shí)很好地與蛋白質(zhì)區(qū)分開。
本發(fā)明的另一個(gè)重要特點(diǎn)在于同時(shí)收集到去除異黃酮的蛋白質(zhì)原料和異黃酮，而不僅僅是其中一種物質(zhì)。本發(fā)明使用澄清的蛋白質(zhì)提取物作為要與極性離子交換樹脂接觸的底物。澄清的蛋白提取物，與含異黃酮和蛋白質(zhì)的植物材料醇提取物不同，同時(shí)含有大量的蛋白質(zhì)和異黃酮。由于可以同時(shí)分離和回收植物材料中的兩種所需的物質(zhì)，本發(fā)明的方法可以取得明顯的經(jīng)濟(jì)效益。
本發(fā)明方法所用的澄清植物蛋白提取物的制備可以是通過用pH大于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的含水提取劑提取含蛋白和異黃酮的植物材料來制備，從而使蛋白質(zhì)和異黃酮溶解到提取劑中。然后，將含溶解異黃酮和蛋白質(zhì)的液體提取劑與不溶于提取劑的植物物質(zhì)(如木酚素、纖維素、植物纖維和不溶性半纖維素)分離，形成澄清的提取物。優(yōu)選，通過過濾或通過離心并且從不溶物中傾析上清提取物來將澄清的提取物與不溶植物物質(zhì)分離。所得的澄清蛋白提取物中含有來自植物材料的可溶蛋白質(zhì)、和至少一種選自染料木黃酮、黃豆苷原、黃豆黃素、生原禪寧A、芒柄花黃素、及其天然配糖體和配糖體共軛物的異黃酮化合物，并且基本上不含不溶性蛋白質(zhì)物質(zhì)。這里所說的異黃酮配糖體是指包括葡萄糖部分的化合物，其中所說的葡萄糖部分與糖苷配基異黃酮部分共價(jià)鍵合，并且異黃酮配糖體共軛物是指異黃酮配糖體酯，并且包括化合物6”-O-Mal染料木苷、6”-O-Ac染料木苷、6”-O-Mal黃豆苷、6”-O-Ac黃豆苷和6”-O-Mal大豆異黃酮。
可用于形成澄清提取物的含蛋白質(zhì)和異黃酮的植物材料包括但不限于以下植物原料的一種或幾種大豆、鷹嘴豆、落花生、marama豆、刀豆、洋刀豆(jack bean)、海濱刀豆、carao豆、簇豆(cluster)、眉豆、草豆(grass pea)、四季豆、金可豆(djenko bean)、四棱豆(goa bean)、豆薯、蠶豆、earth pea、小扁豆、跳豆(jumping bean)、絨毛豆(velvetbean)、非洲角豆、其它豆類，以及這些植物原料的衍生物，包括脫脂大豆坯、大豆粉、大豆面。首選的植物原料是大豆原料或大豆的衍生物，首選的可商購獲得的是脫脂大豆坯，因?yàn)榇蠖怪写嬖诟吆康牡鞍踪|(zhì)和異黃酮。
在一個(gè)首選的實(shí)施方案中，制備用于本發(fā)明方法的澄清大豆蛋白提取物。使用可商購獲得的大豆粉、大豆面、大豆粗粉或脫脂大豆坯作為起始原料。優(yōu)選，大豆原料經(jīng)過亞硫酸鹽如亞硫酸鈉處理過，以便具有改進(jìn)的流動(dòng)性和改進(jìn)的微生物控制性。用pH為約6-約12的水溶液提取大豆原料，優(yōu)選pH為約8-約11的氫氧化鈉水溶液。提取劑與大豆原料的重量比為約3∶1至約20∶1，優(yōu)選約8∶1至約16∶1。優(yōu)選通過過濾、或者通過離心和從不溶物質(zhì)中傾析提取物，從不溶大豆原料中分離澄清大豆蛋白提取物。
根據(jù)本發(fā)明的方法，將澄清的蛋白提取物與極性離子交換樹脂接觸，以便讓提取物中的異黃酮與樹脂結(jié)合。優(yōu)選，將樹脂裝入具有入口端和出口端的柱中，其中通過從柱的入口端將提取物填充到樹脂上來使提取物與樹脂接觸，并且在柱的出口端從樹脂中收集洗脫的提取物。
優(yōu)選，本方法使用陰離子交換樹脂，首選Ⅱ型大孔強(qiáng)堿陰離子交換樹脂，也可以使用弱堿陰離子交換樹脂。這里所說的Ⅱ型強(qiáng)堿陰離子交換樹脂定義為季銨型樹脂，其中氮原子上的四個(gè)取代基為乙醇基、兩個(gè)甲基和聚合芐基可商購獲得的Ⅱ型強(qiáng)堿陰離子交換樹脂包括Rohm& Haas的IRA 910,Independence Mall West,Philadelphia,PA 19105；Dow化學(xué)公司U.S.A.的Dowex 22,2040 Willard H.Dow Center,Midland MI 48674；和Sybron的Ionac A651,Sybron化學(xué)部，Birmingham Road,Birmingham,NJ08011?？捎糜诒景l(fā)明方法的可商購獲得的弱堿陰離子交換樹脂是Rohm& Haas的Duolite A-7。
調(diào)節(jié)極性陰離子交換樹脂的適宜方法見U.S.專利5,248,804，該專利引入作為參考。調(diào)節(jié)陰離子交換樹脂的優(yōu)選技術(shù)是將樹脂暴置于可剝離樹脂表面殘余物并將樹脂轉(zhuǎn)變成氫氧化物形式的試劑中，之后將樹脂暴置于可將樹脂轉(zhuǎn)變成氯化物形式或硫酸鹽形式的試劑中，之后將樹脂暴置于可將至少一些強(qiáng)堿部位轉(zhuǎn)變成碳酸鹽形式和將弱堿部位轉(zhuǎn)變成游離堿形式的試劑中。剝離樹脂表面殘余物并將樹脂轉(zhuǎn)變成氫氧化物形式的適宜試劑是氫氧化鈉溶液，將樹脂轉(zhuǎn)變成氯化物形式的適宜試劑是鹽酸，優(yōu)選1％鹽酸溶液，并且將樹脂轉(zhuǎn)變成硫酸鹽形式的適宜試劑是硫酸，優(yōu)選1％硫酸溶液。將至少一些強(qiáng)堿部位轉(zhuǎn)變成碳酸鹽形式和將弱堿部位轉(zhuǎn)變成游離堿形式的適宜試劑的實(shí)例包括碳酸鈉、碳酸氫鈉和氫氧化銨。
在澄清蛋白提取物與離子交換樹脂接觸以便讓異黃酮與樹脂結(jié)合之后，從離子交換樹脂中分離和收集去除異黃酮的蛋白提取物，優(yōu)選通過用調(diào)整至提取物pH的水溶液洗脫樹脂，并且收集洗脫液。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，澄清提取物中至少大部分的蛋白質(zhì)原料被收集在洗脫液中，成為去除異黃酮的蛋白提取物。首選，澄清提取物中基本上所有的蛋白質(zhì)原料被收集在洗脫液中，作為去除了異黃酮的蛋白質(zhì)提取物，這里“基本上所有”定義為至少80％，更優(yōu)選至少90％。如果需要，可以通過將提取物噴霧干燥，從提取物中回收去除異黃酮的蛋白原料。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以由從離子交換樹脂分離和回收的、含去除異黃酮的蛋白質(zhì)的提取物中沉淀去除異黃酮的蛋白原料。將提取物pH調(diào)整至約蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，以便沉淀蛋白質(zhì)。如果提取物中的蛋白質(zhì)是大豆蛋白，則可以將提取物調(diào)整至pH為約4-約5來沉淀蛋白質(zhì)。然后，可以通過將含沉淀蛋白的提取物的pH整至約7，來中和沉淀的蛋白質(zhì)。然后，沉淀的蛋白質(zhì)，無論中和過與否，通過常規(guī)方式從提取物的液體部分中分離出來，優(yōu)選通過過濾，或者通過離心并從蛋白質(zhì)沉淀中傾析掉提取物的液體部分。然后通過常規(guī)方式將分離的去除異黃酮的蛋白原料干燥，優(yōu)選通過噴霧干燥。
在從離子交換樹脂中分離含去除異黃酮的蛋白質(zhì)的提取物之后，從樹脂中分離和收集異黃酮，優(yōu)選通過用溶劑洗脫樹脂，所說的溶劑選自甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、異丁醇、丁醇、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、上述溶劑的含水混合物、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、或上述溶劑的任意混合物，并且收集含異黃酮的洗脫液。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在含異黃酮的洗脫液中從離子交換樹脂收集到澄清蛋白提取物中的至少大部分的異黃酮，并且更優(yōu)選在含異黃酮的洗脫液中收集到澄清蛋白提取物中的基本上所有的異黃酮，這里“基本上所有”定義為至少80％、更優(yōu)選至少90％。
通過濃縮含異黃酮的洗脫液，可以從由樹脂分離的含異黃酮的洗脫液中回收異黃酮。在一個(gè)實(shí)施方案中，將含異黃酮的洗脫液真空濃縮、加熱或者同時(shí)真空和加熱進(jìn)行濃縮，以除去溶劑，得到濃縮的異黃酮剩余物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將洗脫液真空濃縮、加熱或者同時(shí)進(jìn)行真空和加熱濃縮至原體積的約10-25％。然后向濃縮的洗脫液添加至少等體積的水，優(yōu)選冷卻至約2-約15℃的水，以便沉淀異黃酮。然后，可以通過過濾或離心從洗脫液/水混合物中回收沉淀的異黃酮。
在一個(gè)首選的實(shí)施方案中，對(duì)含收集的異黃酮的洗脫液中的異黃酮進(jìn)行處理，以便洗脫液中基本上所有的異黃酮是糖苷配基異黃酮。據(jù)發(fā)現(xiàn)，糖苷配基異黃酮比其天然配糖體或配糖體共軛物形式在保健效果中明顯更具生物活性，因此，回收其糖苷配基形式的異黃酮是可取的。糖苷配基異黃酮還比其配糖體或配糖體共軛物形式較不溶于水，因此糖苷配基異黃酮可以更容易從含異黃酮的洗脫液中分離。
通過在可有效產(chǎn)生轉(zhuǎn)變的溫度和pH下將含異黃酮的洗脫液處理一段時(shí)間，可以將含異黃酮洗脫液中的異黃酮配糖體共軛物轉(zhuǎn)變成異黃酮配糖體。用于含異黃酮洗脫液中異黃酮配糖體共軛物轉(zhuǎn)變成異黃酮配糖體的pH范圍是約6至約13.5。應(yīng)當(dāng)將含異黃酮洗脫液的pH調(diào)整至所需的pH值，如果必要，用適宜的堿性或酸性試劑來調(diào)整。據(jù)發(fā)現(xiàn)，異黃酮配糖體共軛物轉(zhuǎn)變成異黃酮配糖體是堿催化的，所以首選使用高pH來達(dá)到快速轉(zhuǎn)變。用于異黃酮配糖體共軛物轉(zhuǎn)變成異黃酮配糖體的首選pH值是約9-約11。
用于含異黃酮洗脫液中異黃酮配糖體共軛物轉(zhuǎn)變成異黃酮配糖體的溫度范圍是約2至約121℃。轉(zhuǎn)變?nèi)菀装l(fā)生的溫度范圍取決于含異黃酮洗脫液的pH。當(dāng)含異黃酮的洗脫液pH相對(duì)高時(shí)轉(zhuǎn)變?cè)谳^低溫度下發(fā)生。例如，在pH約11時(shí)溫度為約5-約50℃下轉(zhuǎn)變快速而有效地發(fā)生。在pH約9時(shí)，轉(zhuǎn)變?cè)诩s45-約75℃的溫度范圍內(nèi)容易發(fā)生。當(dāng)含異黃酮的洗脫液pH相對(duì)低時(shí)轉(zhuǎn)變?cè)谳^高溫度下發(fā)生。例如，在pH約6時(shí)發(fā)生轉(zhuǎn)變的溫度范圍為約80-約121℃。在一個(gè)首選的實(shí)施方案中，在pH約11且溫度約35℃下進(jìn)行轉(zhuǎn)變。
異黃酮配糖體共軛物轉(zhuǎn)變成異黃酮配糖體所需要的時(shí)間期限主要取決于進(jìn)行轉(zhuǎn)變所用的pH和溫度范圍。轉(zhuǎn)變時(shí)間為約15分鐘至數(shù)小時(shí)或更長。轉(zhuǎn)變?cè)谳^高pH和在較高溫度下較快發(fā)生。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，在pH約11且溫度約35下于約30分鐘至約1小時(shí)間，基本上所有的異黃酮配糖體共軛物轉(zhuǎn)變成異黃酮配糖體。
通過在選定的溫度和pH下用β-葡糖苷酶與含異黃酮洗脫液中的異黃酮配糖體接觸一段時(shí)間，可以將含異黃酮洗脫液中的異黃酮配糖體轉(zhuǎn)變成其相應(yīng)的糖苷配基異黃酮，優(yōu)選在異黃酮配糖體共軛物轉(zhuǎn)變成異黃酮配糖體之后，其中β葡糖苷酶可有效分解1,4-糖苷鍵。這種酶可以得自例如黑曲霉、米曲霉、乳酸克魯維酵母、和脆壁克魯維酵母。有效用于異黃酮配糖體轉(zhuǎn)變成糖苷配基異黃酮的特別優(yōu)選的可商購酶是Biopectinase 100L(優(yōu)選在pH約3-約6下使用)、Biopectinase 300L(最佳pH約3-約6)、Biopectinase OK70L(最佳pH約3-約6)、Biolactase 30,000(最佳pH約3-約6)和NeutralLactase(最佳pH約6-約8)，所有均購自Quest International,1833 57thStreet,Post Office Box 3917,Sarasota,Florida 34243。還特別優(yōu)選Lactase F(優(yōu)選使用pH約4-約6)、和Lactase 50,000(最佳pH約4-約6)，兩者購自Amano International Enzyme Co.,Inc.,Post Office Box 1000,Troy,Virginia 22974。其它特別優(yōu)選的酶包括Lactozyme 3000L(優(yōu)選使用pH約6-約8)、α-Gal 600L(優(yōu)選使用pH約4-約6.5)，購自Novo NordiskBioindustrials Inc.,33 Turner Road,Danbury,Connecticut 06813；Maxilact L2000(優(yōu)選使用pH約4-約6)，購自Gist Brocades FoodIngredients Inc.,King of Prussia,Pennsylvania,19406；NeutralLactase(優(yōu)選使用pH約6-約8)，購自Pfizer Food Science Group,205East 42nd Street,New York,New York 10017；以及Enzeco FungalLactase Concentrate(優(yōu)選使用pH約4-約6)，購自Enzyme DevelopmentCorporation,2 Penn Plaza,Suite 2439,New York,New York 10121?？梢允褂媚承┢咸堑矸勖竵砣〈蛘吒郊佑谇笆龅拿浮Ｄ苓M(jìn)行轉(zhuǎn)變的可商購獲得的葡糖淀粉酶是可購自Enzyme Development Corporation的G-ZymeG990(優(yōu)選在pH約4-約6下使用)。優(yōu)選，向含異黃酮的洗脫液添加約0.1wt％-約10wt％的酶原料，來進(jìn)行轉(zhuǎn)變。
用于含異黃酮洗脫液中異黃酮配糖體轉(zhuǎn)變成糖苷配基異黃酮的pH范圍是約3至9。所用的pH主要取決于所用酶的類型，并且應(yīng)當(dāng)依此進(jìn)行選擇。一般來說，酶在約6-8的中性pH范圍內(nèi)、或在約3-6的酸性pH范圍內(nèi)具活性?？梢杂贸Ｒ?guī)的酸性或堿性試劑將含異黃酮洗脫液的pH調(diào)整至適合的pH范圍。
用于異黃酮配糖體轉(zhuǎn)變成糖苷配基異黃酮的溫度范圍是約5-約75℃。溫度明顯地影響著酶的活性，因此影響轉(zhuǎn)變速率，較高溫度增加轉(zhuǎn)變的速率。酶可以在70℃以上具活性，例如α-Gal 600L在75℃下有活性，然而優(yōu)選在較低溫度下進(jìn)行轉(zhuǎn)變，優(yōu)選約50-約65℃，以避免酶的失活。
進(jìn)行異黃酮配糖體轉(zhuǎn)變成糖苷配基異黃酮所需要的時(shí)間取決于酶有關(guān)的因素，具體說是酶活性和濃度，以及系統(tǒng)的溫度和pH。優(yōu)選，在5小時(shí)內(nèi)基本上所有的異黃酮配糖體轉(zhuǎn)變成糖苷配基異黃酮，更優(yōu)選約1-2小時(shí)。
所得的糖苷配基異黃酮可以如上所述從含異黃酮的洗脫液中分離。用冷卻水更容易從含濃縮異黃酮的洗脫液中分離糖苷配基異黃酮，因?yàn)樘擒张浠慄S酮較相應(yīng)的異黃酮配糖體共軛物或異黃酮配糖體不易溶于水。
在不背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以顯而易見地作出如這里所述本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的各種改變，本發(fā)明的范圍將由以下權(quán)利要求書定義。
權(quán)利要求
1．一種從含蛋白質(zhì)和異黃酮的植物材料中分離和回收異黃酮和植物蛋白的方法，該方法包括將含異黃酮的澄清植物蛋白提取物與極性離子交換樹脂接觸，讓所述異黃酮與該離子交換樹脂接觸并結(jié)合由此在蛋白質(zhì)提取物中去除所說的異黃酮，從離子交換樹脂中分離和回收去除了異黃酮的含蛋白質(zhì)提取物，并且從所述離子交換樹脂中分離和回收所述異黃酮。
2．一種從含蛋白質(zhì)和異黃酮的植物材料中分離和回收異黃酮和植物蛋白的方法，該方法包括制備含溶解植物蛋白和異黃酮的澄清蛋白質(zhì)提取物，該提取物基本上不含不溶性蛋白原料；將澄清蛋白質(zhì)提取物與極性離子交換樹脂接觸；讓所述異黃酮與所述離子交換樹脂結(jié)合，由此在所說的蛋白質(zhì)提取物中去除所說的異黃酮；從所述離子交換樹脂中分離和回收所述去除了異黃酮的蛋白質(zhì)提取物；并且從所述離子交換樹脂中分離和回收所述異黃酮。
3．權(quán)利要求2的方法，其中所說的澄清蛋白質(zhì)提取物的制備優(yōu)選通過用pH大于所說蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的含水提取劑提取含蛋白質(zhì)和異黃酮的植物材料，從而使所說的蛋白質(zhì)和所說的異黃酮溶解到所說的提取劑中；之后將含溶解蛋白和異黃酮的液體提取劑與不溶性植物物質(zhì)分離。
4．權(quán)利要求3的方法，其中所說的植物材料選自大豆坯、大豆粉、大豆面、大豆粗粉、大豆或其混合物；所說的含水提取劑的pH為約6-約12；并且所說的澄清蛋白質(zhì)提取物是大豆蛋白質(zhì)提取物。
5．權(quán)利要求1或2的方法，還包括將所說去除了異黃酮的含蛋白質(zhì)提取物的pH調(diào)整至約蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的步驟，由此使蛋白質(zhì)沉淀。
6．權(quán)利要求5的方法，其中所說的蛋白質(zhì)是大豆蛋白，并且pH值調(diào)整至約4-約5來沉淀蛋白質(zhì)。
7．權(quán)利要求5的方法，其中從提取物的液體部分分離沉淀的蛋白質(zhì)。
8．權(quán)利要求7的方法，其中將從提取物液體部分分離的沉淀蛋白質(zhì)中和。
9．權(quán)利要求7的方法，其中將從提取物液體部分分離的沉淀蛋白質(zhì)干燥。
10．權(quán)利要求1或2的方法，其中極性離子交換樹脂是陰離子交換樹脂。
11．權(quán)利要求10的方法，其中陰離子交換樹脂是選自弱堿和強(qiáng)堿陰離子交換樹脂的Ⅱ型大孔陰離子交換樹脂。
12．權(quán)利要求1或2的方法，其中，在將澄清的蛋白質(zhì)提取物與離子交換樹脂接觸之前，通過將樹脂置于將樹脂轉(zhuǎn)變成氫氧化物形式的試劑中，用將氫氧化物形式的樹脂轉(zhuǎn)變成氯化物形式或硫酸鹽形式的試劑處理氫氧化物形式的樹脂，并且用將樹脂的至少一些強(qiáng)堿部位轉(zhuǎn)變成碳酸鹽形式的試劑處理氯化物或硫酸鹽形式的樹脂，來調(diào)節(jié)離子交換樹脂。
13．權(quán)利要求1或2的方法，其中所說的異黃酮包括選自染料木黃酮、黃豆苷原、黃豆黃素、生原禪寧A、芒柄花黃素、及其天然配糖體和配糖體共軛物的至少一種異黃酮化合物。
14．權(quán)利要求1或2的方法，其中在從所說的離子交換樹脂中分離和收集所說的去除了異黃酮的含蛋白提取物之后，從所說的離子交換樹脂中分離和收集所說的異黃酮。
15．權(quán)利要求14的方法，其中從所說的離子交換樹脂中分離所說的異黃酮是通過用溶劑從所說的樹脂中洗出所說的異黃酮，所說的溶劑選自甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、異丁醇、丁醇、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳或其混合物。
16．權(quán)利要求1或2的方法，還包括在有效將異黃酮配糖體共軛物轉(zhuǎn)變成異黃酮配糖體的溫度和pH下處理所說的分離異黃酮一段時(shí)間。
17．權(quán)利要求1或2的方法，還包括在有效將異黃酮配糖體轉(zhuǎn)變成糖苷配基異黃酮的溫度和pH下將所說的分離異黃酮與β葡糖苷酶接觸一段時(shí)間。
18．權(quán)利要求1或2的方法，其中在所說的去除了異黃酮的含蛋白質(zhì)提取物中從所說的離子交換樹脂分離和回收所說澄清植物蛋白提取物中的至少大部分所說蛋白質(zhì)。
19．權(quán)利要求18的方法，其中在所說的去除了異黃酮的含蛋白質(zhì)提取物中從所說的離子交換樹脂分離和回收所說澄清植物蛋白提取物中的基本上所有所說的蛋白質(zhì)。
20．權(quán)利要求1或2的方法，其中從所說的離子交換樹脂中分離和回收所說澄清植物蛋白提取物中的至少大部分所說的異黃酮。
21．權(quán)利要求20的方法，其中從所說的離子交換樹脂中分離和回收所說澄清植物蛋白提取物中的基本上所有的所說異黃酮。
全文摘要
一種從含蛋白質(zhì)和異黃酮的植物材料中分離和收集異黃酮和蛋白質(zhì)的改進(jìn)的方法。制備植物材料的澄清蛋白提取物,并且與極性離子交換樹脂接觸,讓提取物中的異黃酮與極性離子交換樹脂結(jié)合,并且去除異黃酮的提取物。從離子交換樹脂中分離去除了異黃酮的蛋白質(zhì)提取物,并且從去除了異黃酮的提取物中回收去除了異黃酮的蛋白質(zhì)原料。在從樹脂中除去去除了異黃酮的提取物之后,從離子交換樹脂中分離和回收異黃酮?；厥盏漠慄S酮配糖體和異黃酮配糖體共軛物可以轉(zhuǎn)變成其相應(yīng)的糖苷配基異黃酮形式。
文檔編號(hào)A23J1/14GK1321640SQ0011805
公開日2001年11月14日 申請(qǐng)日期2000年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月19日
發(fā)明者G·A·貝茨, B·A·布瑞恩 申請(qǐng)人:蛋白質(zhì)技術(shù)國際公司