一種新的人過氧化物酶體雙烯酰輔酶a還原酶及其編碼序列的制作方法

專利名稱：一種新的人過氧化物酶體雙烯酰輔酶a還原酶及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、酶學(xué)、生理學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種在人類肝癌旁組織中表達(dá)的hpx-2，4-DCR蛋白及其核酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白和核酸序列的制備方法和用途。
過氧化物酶體雙烯酰輔酶A還原酶(peroxisomal 2，4-dienoyl CoA reductase，px-2，4-DCR)屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族(short-chain dehydrogenase/reductasefamily)，對NADP(H)有很強(qiáng)的輔助功能，參與體內(nèi)多種進(jìn)程的氧化還原反應(yīng)而具有重要的生理意義。(J Biochem(Tokyo)1996 Aug；120(2)257-63)。
本發(fā)明中，我們在人類肝癌旁組織中克隆到挪威鼠(Rattus norvegicus)px-2，4-DCR基因的同源基因hpx-2，4-DCR。
在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中提及的人類hpx-2，4-DCR蛋白序列及其核酸序列。
本發(fā)明的第一目的就是提供一種新的人基因hpx-2，4-DCR(Genbank AccessionNo.AF212234)，該基因是一個人hpx-2，4-DCR蛋白基因。
本發(fā)明的第二目的是提供一種新的人蛋白hpx-2，4-DCR。
本發(fā)明的第三目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)上述的新的人hpx-2，4-DCR蛋白和核酸序列的方法。
本發(fā)明還提供了這種人hpx-2，4-DCR蛋白多肽和編碼序列的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有人hpx-2，4-DCR蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-970位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-970位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-970位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離出的人hpx-2，4-DCR蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在一個實例中該宿主細(xì)胞是大腸桿菌；在另一實例中，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種產(chǎn)生具有人hpx-2，4-DCR蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，其步驟如下(1)將編碼具有人hpx-2，4-DCR蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人hpx-2，4-DCR蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-970位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人hpx-2，4-DCR蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)人hpx-2，4-DCR蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有人hpx-2，4-DCR蛋白活性的多肽。
較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.6中第2-970位的序列。
本發(fā)明還提供了與hpx-2，4-DCR蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人hpx-2，4-DCR蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人hpx-2，4-DCR蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.6中第2-970位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.6序列的編碼框第2-970位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.6中第2-970位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.7所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-970位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-970位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的人hpx-2，4-DCR相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.6中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人hpx-2，4-DCR蛋白或多肽”指具有人hpx-2，4-DCR蛋白活性的SEQ ID NO.7序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然人hpx-2，4-DCR相同功能的、SEQ ID NO.7序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人hpx-2，4-DCR蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的人hpx-2，4-DCR多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與人hpx-2，4-DCR DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人hpx-2，4-DCR多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人hpx-2，4-DCR多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括人hpx-2，4-DCR多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人hpx-2，4-DCR多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
在本發(fā)明中，“人hpx-2，4-DCR保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.7的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更
>發(fā)明還包括人hpx-2，4-DCR蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人hpx-2，4-DCR多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的人hpx-2，4-DCR多肽時，可以將人hpx-2，4-DCR編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成人hpx-2，4-DCR蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
本發(fā)明還提供了對人hpx-2，4-DCR特異性結(jié)合的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。
在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對人hpx-2，4-DCR特異的抗體。例如，將提純的人hpx-2，4-DCR基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人hpx-2，4-DCR或它的抗原片段的細(xì)胞也可以用來對動物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可以用雜交瘤技術(shù)制備(例如，Kohler et al.，Nature 256495，1975；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6292，1976)。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑人hpx-2，4-DCR功能的抗體，也可以是不影響人hpx-2，4-DCR功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人hpx-2，4-DCR基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人hpx-2，4-DCR基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的人hpx-2，4-DCR基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以通過用在原核細(xì)胞例如E.coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以通過用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的來免疫動物而得到。
本發(fā)明的人hpx-2，4-DCR抗體可以用來鑒定表達(dá)人hpx-2，4-DCR蛋白或多肽的細(xì)胞，如Jurkat T細(xì)胞。例如，可以用一種可檢測的分子例如熒光素異硫氰酸(FITC)來標(biāo)記人hpx-2，4-DCR特異抗體，然后讓人hpx-2，4-DCR特異抗體與細(xì)胞樣品接觸，再用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測出與人hpx-2，4-DCR特異抗體結(jié)合的細(xì)胞。
除了在細(xì)胞表面檢測人hpx-2，4-DCR外，還可以用Western印跡技術(shù)分析該蛋白質(zhì)。細(xì)胞裂解液可以從培養(yǎng)細(xì)胞或取自病人的組織標(biāo)本如肝癌旁組織中提取，并溶解在含有去污劑的裂解緩沖液中。然后用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞提取物(同時將提純的人hpx-2，4-DCR多肽作為陽性對照)，接著通過電泳雜交將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。為了用Western印跡免疫探測人hpx-2，4-DCR多肽，可以使用典型的抗體結(jié)合檢測方法，例如放射自顯影或堿性磷酸酶檢測方法。并可使用免疫接種血清或不相關(guān)的單克隆抗體作為非特異反應(yīng)的對照。
還可用Nothern印跡法技術(shù)分析人hpx-2，4-DCR基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析人hpx-2，4-DCR的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
人hpx-2，4-DCR DNA的Nothern印跡分析和人hpx-2，4-DCR特異抗體的Western印跡分析可以聯(lián)合使用，以證實人hpx-2，4-DCR在生物樣本中的表達(dá)。人hpx-2，4-DCR DNA還可以用于Southern印跡分析或原位雜交分析，以將該基因定位于染色體上，并可進(jìn)行遺傳連鎖分析以找出其它可能的疾病相關(guān)基因。
此外，本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人hpx-2，4-DCR核苷酸編碼序列的8-100個連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼人hpx-2，4-DCR的核酸分子。
本發(fā)明還提供了檢測樣品中是否存在人hpx-2，4-DCR核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于人hpx-2，4-DCR核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的人hpx-2，4-DCR核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選人hpx-2，4-DCR同源基因或同源蛋白。
為了得到與人hpx-2，4-DCR基因相關(guān)的人cDNAs或基因組DNAs的點陣，可以用DNA探針篩選人cDNA或基因組DNA文庫，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用32P對人hpx-2，4-DCR的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自人肝癌旁組織的文庫。來自參與內(nèi)分泌的其它人體組織或特定人體細(xì)胞株的cDNA文庫也可用于篩選目的。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識別與人hpx-2，4-DCR相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。
根據(jù)核苷酸相似性篩選人hpx-2，4-DCR同源物可以按如下方法完成。人體肝癌旁組織cDNA文庫，例如Clontech Cat.#74XX(Clontech，Palo Alto，Cal.)可以使用一段包含人hpx-2，4-DCR基因序列的全部或部分的隨機(jī)引物化DNA探針篩選。要完成對與人hpx-2，4-DCR序列至少有70％同源性的DNA插入序列的克隆的鑒定，可以使用雜交溫度為55℃的雜交液，然后用0.5×SSC和0.1％SDS清洗。用這種方法識別的克隆的DNA插入序列可以進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測序來評價它與人hpx-2，4-DCR基因的相似性。組織表達(dá)的分布可以用上述的Northern印跡法技術(shù)分析。
人hpx-2，4-DCR同源物也可以用針對人hpx-2，4-DCR蛋白或多肽的抗體來識別。例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)的方法對商品化的或者用已知方法構(gòu)建的，來自細(xì)胞或者組織例如肝癌旁組織的表達(dá)文庫進(jìn)行篩選。將文庫倒入平皿，菌落轉(zhuǎn)移到一張硝化纖維素膜上，使表達(dá)的重組蛋白結(jié)合到膜上。然后就可以用特異性的人hpx-2，4-DCR抗體進(jìn)行典型的抗體結(jié)合和檢測。用這種方法所識別出克隆中的DNA插入序列，可以進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測序進(jìn)行分析以評價它與人hpx-2，4-DCR基因的相似性。新識別的基因的組織表達(dá)分布可以同樣地按上述方法進(jìn)行分析。
本發(fā)明的人hpx-2，4-DCR核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工化學(xué)合成的方法來合成有關(guān)序列。在本申請之前，現(xiàn)有技術(shù)已完全可以通過先合成多個多核苷酸小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得編碼本發(fā)明人hpx-2，4-DCR蛋白的核酸序列。然后，可將該核酸序列引入本領(lǐng)域中各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH FreemanCo.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進(jìn)行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
本發(fā)明蛋白的編碼序列可用于基因定位。例如，通過熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，將cDNA克隆與分裂中期的染色體進(jìn)行雜交，可以準(zhǔn)確地進(jìn)行染色體定位。該技術(shù)可以使用短至約500bp的cDNA；也可以使用長至約2000bp或者更長的cDNA。對于該技術(shù)，可參見Verma等人，Human ChromosomesA Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位于染色體上的某個精確位置，將可以將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些遺傳圖譜數(shù)據(jù)是可以獲得的，例如通過孟德爾(Mendelian)人遺傳數(shù)據(jù)庫(可通過Johns Hopkins University Welch Medical Library在網(wǎng)上獲得)。然后，通過連鎖分析來鑒定基因與已定位于同一染色體區(qū)域的疾病之間的相關(guān)性。
接著，有必要確定患病個體和健康個體之間的cDNA或基因組序列方面的差異。如果某一突變存在于部分或全部患病個體但不存在于正常個體，那么該突變可能就是該疾病的致病因素。
利用本發(fā)明的人hpx-2，4-DCR蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與人hpx-2，4-DCR發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明人hpx-2，4-DCR蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常為約5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
以本發(fā)明的人hpx-2，4-DCR蛋白為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的人hpx-2，4-DCR蛋白可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重—約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
當(dāng)本發(fā)明的人hpx-2，4-DCR蛋白多肽被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽施用于哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重—約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
表2為本發(fā)明的人hpx-2，4-DCR蛋白與挪威鼠px-2，4-DCR蛋白的核苷酸序列(GenBank Accession No.AF021854)的同源比較(FASTA)表。
表3為本發(fā)明的人hpx-2，4-DCR蛋白與挪威鼠px-2，4-DCR蛋白的氨基酸序列(GenPept Accession No.AAF14047)的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出，相似的氨基酸用“+”標(biāo)出。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人hpx-2，4-DCR基因的克隆1.組織分離(肝癌旁組織isolation)肝癌旁組織來源于5個正常成年男性供體，在死后四小時內(nèi)取出肝癌旁組織，立即置于液氮中冷凍保存。
2.mRNA的分離(mRNA isolation)取出組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。用帶Oligo d(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA，定量。
3.cDNA文庫的構(gòu)建(Construction of cDNA library)以mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物見SEQ ID NO.1。補(bǔ)平末端后，加含EcoRI切點的接頭，接頭序列分別見SEQ ID NO.2和3。磷酸化EcoRI末端后，用XhoI限制性內(nèi)切酶消化1.5小時，再進(jìn)行片段分離。過柱篩選長度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，無菌水溶解，連接至Uni-ZAP XR載體(Stratagene，CA9203，USA)，以Zap-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(Stratagene，CA9203，USA)進(jìn)行包裝，宿主菌使用XL 1-Blue MRF(Stratagene，CA9203，USA)細(xì)菌。涂板并測定滴度。
4.測序及數(shù)據(jù)庫建立(Seqencing and Database Constructing)挑選文庫中有外源片段插入的克隆，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作為3’端和5’端的通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行EST大規(guī)模測序。測序結(jié)果用FACTURA軟件去除載體序列，傳輸?shù)絊UN Ultra 450 Server上進(jìn)行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，將無同源性或同源性低于95％的序列視為新基因建立數(shù)據(jù)庫。
5.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎(chǔ)上，進(jìn)行cDNA全長克隆，分兩階段進(jìn)行(1)“電子克隆”(Electronic Cloning)以新基因片段序列作為探針?biāo)褜bEST數(shù)據(jù)庫，將重疊序列＞50bp，同源性在98％以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tag，簡稱“EST”)序列認(rèn)為同一序列(consensus sequence)，取出并用AUTOASSEMBLER軟件進(jìn)行拼接，部分EST可以延伸探針序列。再用STRIDER軟件分析被延伸的序列是否具有完整的開放閱讀框架(Open Reading Frame，ORF)，用BLAST搜尋Genbank或SwissProt以確定該序列在核苷酸和氨基酸水平上是否與其他物種有同源性，以幫助判別所得到的基因全長完整性如何。通過電子克隆的方法，通?？色@取人hpx-2，4-DCR基因的全長序列。
(2)cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)如果通過“電子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全長，則在已有序列的5’或3’端設(shè)計引物，在人類肝癌旁組織Marathon-Ready cDNA文庫(Clontech Lab，Inc，USA)中進(jìn)行長距離PCR反應(yīng)。然后對PCR產(chǎn)物克隆、測序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER軟件分析被延長的序列有無完整的ORF，如無，重復(fù)上述過程直至獲得全長。
(3)RT-PCR對于5’和3’端已知的序列，如果中間尚有一段間隙(gap)無法從已有的公共數(shù)據(jù)庫或自身數(shù)據(jù)庫獲得，可考慮采用RT-PCR的方法。在序列5’端設(shè)計引物，3’端引物采用Oligo-dT，在肝癌旁組織總RNA庫中進(jìn)行擴(kuò)增。然后對產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序。最后拼接并獲得全長。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的人hpx-2，4-DCR蛋白的全長編碼序列。在拼接得到全長(至少包含完整的開放讀框)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計引物R15’-AATGTCCCTGAGACCCAGAAG-3’(SEQ ID NO.4)為正向引物，寡核苷酸R25’-CCTCAAGATGTGAAGGCACTG-3’(SEQ ID NO.5)為反向引物，以肝癌旁組織的總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，R1/R2的PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃30秒、57℃30秒和72℃1分鐘進(jìn)行35個循環(huán)，最后以72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長度為1020bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序，獲得SEQ ID NO.6所示的序列。
實施例2人hpx-2，4-DCR基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的人hpx-2，4-DCR全長cDNA(GenBank Accession No.AF212234。在本申請之前未公開過)的長度為1020bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.6，其中開放讀框位于2-970位核苷酸。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出人hpx-2，4-DCR的氨基酸序列，共322個氨基酸殘基，分子量34660.87，pI為9.22。詳細(xì)序列見SEQ ID NO.7。
將hpx-2，4-DCR的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與挪威鼠的px-2，4-DCR基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它與挪威鼠px-2，4-DCR基因的mRNA全編碼序列(GenBank Accession No.AF021854)有76.4％的相同性(附表2)，在氨基酸水平上，它與挪威鼠px-2，4-DCR蛋白(GenPeptAccession No.AAF14047)的第1-304位氨基酸殘基有71.9％的相同性和91.3％的相似性(附表3)。由上可見，hpx-2，4-DCR基因與挪威鼠px-2，4-DCR基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，可以認(rèn)為兩者在功能上也有很高相似性。
本發(fā)明的人hpx-2，4-DCR除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明的人hpx-2，4-DCR還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明的人hpx-2，4-DCR蛋白的N端與挪威鼠px-2，4-DCR蛋白的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明人hpx-2，4-DCR的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人hpx-2，4-DCR核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人hpx-2，4-DCR的表達(dá)水平或者抑制人hpx-2，4-DCR的過度表達(dá)。本發(fā)明的人hpx-2，4-DCR蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人hpx-2，4-DCR缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
由于本發(fā)明的人hpx-2，4-DCR蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與來源于其他物種(如挪威鼠)的同族蛋白相比，預(yù)計在施用于人時將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內(nèi)的免疫原性更低或沒有)。
實施例3人hpx-2，4-DCR蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究1.將人hpx-2，4-DCR蛋白的氨基酸序列在blocks數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址為http//www.blocks.fhcrc.org)中檢索結(jié)構(gòu)域，得到以下結(jié)果
表16聯(lián)合使用三種類型的保存劑時乳酸桿菌Lactobacillus clearans存活率的改變
*以保存劑相對于活細(xì)胞重量比表示表達(dá)GST-hpx-2，4-DCR重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的DH5α-pGEX-2T-hpx-2，4-DCR工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過夜，按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時，至OD600達(dá)0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續(xù)于37℃分別培養(yǎng)0，1，2，3小時。取培養(yǎng)時間不同的1ml菌液離心，在細(xì)菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細(xì)菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時間增加而增加的菌株即為表達(dá)GST-hpx-2，4-DCR融合蛋白的工程菌。
GST-hpx-2，4-DCR融合蛋白的提取純化按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)GST-hpx-2，4-DCR融合表達(dá)蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-hpx-2，4-DCR。誘導(dǎo)后的細(xì)菌離心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重懸細(xì)菌，超聲破碎細(xì)菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結(jié)合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉淀結(jié)合了GST-hpx-2，4-DCR的谷胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗兩次，而后按每毫升超聲液所得沉淀加入10μl還原型谷胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重復(fù)洗脫兩次。洗脫的上清保存于-80℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。在35kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為人hpx-2，4-DCR蛋白。
實施例6人hpx-2，4-DCR蛋白或多肽在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)1.人hpx-2，4-DCR桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞株根據(jù)人hpx-2，4-DCR的全長編碼序列(SEQ ID NO.6)，設(shè)計擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將人hpx-2，4-DCR cDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pVL1392載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑒定好的表達(dá)載體3μg，野生型線性桿狀病毒DNA(BaculoGoldTMACMNPV DNA，Pharmingen，San Diego，CA)1μg 和Lipofection(Gibco-BRL，NY)25μl，加入1ml無血清的昆蟲培養(yǎng)基中，振蕩15秒混勻，室溫孵育15分鐘備用。取1ml(2×106)Sf9昆蟲細(xì)胞懸液于60mm組織培養(yǎng)板中，貼壁1小時后換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，室溫孵育15分鐘后棄培養(yǎng)基，加入前面制備好的DNA載體轉(zhuǎn)染混合物，Parafilm密封培養(yǎng)板，于室溫27℃振搖培養(yǎng)4小時，而后換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，收集上清備用。
2.轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體的昆蟲細(xì)胞株的篩選鑒定轉(zhuǎn)染3天后的昆蟲細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液(2×106/1ml)，取1ml細(xì)胞懸液置于60mm組織培養(yǎng)皿中，加入3ml培養(yǎng)基，100μl收集的培養(yǎng)上清，貼壁1小時，棄2ml培養(yǎng)基，繼續(xù)室溫培養(yǎng)1小時，棄去所有的培養(yǎng)基，加入預(yù)熱的含20μl4％X-gal的3ml半固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)5-7天后挑取白色細(xì)胞克隆于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3-5天，而后吸取上清感染Sf9昆蟲細(xì)胞。
收集感染的細(xì)胞進(jìn)行Western鑒定。將細(xì)胞裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后的膠于Pharmacia的Multiphor II半干電轉(zhuǎn)移儀中將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜置于封閉液中封閉1小時，而后于抗人hpx-2，4-DCR的抗體溶液中封閉1小時，TBS液振搖清洗5分鐘共2次，而后將膜置于生物素標(biāo)記的抗人hpx-2，4-DCR一抗的第二抗體溶液中振搖1小時，TBS清洗，加入親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物反應(yīng)30分鐘，TBS清洗2次，加入新鮮配制的顯色液顯色觀察蛋白條帶。
挑取高表達(dá)人hpx-2，4-DCR的Sf9細(xì)胞克隆。
3.人hpx-2，4-DCR蛋白的提取純化用高表達(dá)人hpx-2，4-DCR的Sf9細(xì)胞克隆的上清大量感染Sf9細(xì)胞，感染48小時后收集細(xì)胞，PBS洗滌。每2×108細(xì)胞加入20ml細(xì)胞裂解液(0.5％ Triton X-100，20mM Na3PO4(磷酸鈉，pH7.8)，500mM NaCl，1mM Na3VO4(釩酸鈉)，1mM Pefabloc，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破細(xì)胞，12000×g離心20min去除細(xì)胞碎片，上清按每2×108的細(xì)胞加入2ml NTA-瓊脂糖(Qiagen，Germany)，4℃吸附1小時。而后用含100nM咪唑的His緩沖液洗滌兩次，用含20mM N，N’-二哌嗪，500mM NaCl，300mM咪唑的緩沖液洗脫以得到純化的蛋白。洗脫液保存于4℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測提取的人hpx-2，4-DCR蛋白的純度。在35kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為人hpx-2，4-DCR蛋白。
實施例7抗人hpx-2，4-DCR抗體的制備1.免疫小鼠和脾細(xì)胞的制備將實施例5和實施例6中獲得的人hpx-2，4-DCR蛋白用層析法進(jìn)行分離后備用，也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中割下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。取6-8周齡Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量再加強(qiáng)免疫一次，3-5天后用于融合。其中，脾細(xì)胞制備見鄂征主編，《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》，北京出版社，第210頁。
2.按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上)，第371頁中的方法，制備飼養(yǎng)細(xì)胞。
3.按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上)，第213頁中的方法，進(jìn)行細(xì)胞融合。
4.抗體的檢測在細(xì)胞融合10-15天后，需逐孔進(jìn)行檢查，一旦發(fā)現(xiàn)旺盛的雜交細(xì)胞集落生長，就應(yīng)用人hpx-2，4-DCR蛋白做抗體活性的初步篩選，常用的方法有免疫熒光試驗、發(fā)射免疫試驗(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。檢查出抗體活性的孔后，立刻進(jìn)行克隆培養(yǎng)，并分離出抗體。
本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度50bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.1GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 50(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度13bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.2
AATTCGGCAC GA G 13(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度9bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3GCCGTGCTC9(4)SEQ ID NO.4的信息(i).序列特征(A)長度21bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.4AATGTCCCTGAGACCCAGAAG 21(5)SEQ ID NO.5的信息(i).序列特征(A)長度21bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.5CCTCAAGATGTGAAGGCACTG 21(6)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度1020bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.61 AATGTCCCTG AGACCCAGAA GGGCCTGCGC TCAGCTGCTC TGGCACCCCG51 CTGCAGGGAT GGCCTCCTGG GCTAAGGGCA GGAGCTACCT GGCGCCTGGT101 TTGCTGCAGG GCCAAGTGGC CATCGTCACC GGCGGGGCCA CGGGCATCGG151 AAAAGCCATC GTGAAGGAGC TCCTGGAGCT GGGGAGTAAT GTGGTCATTG201 CATCCCGTAA GTTGGAGAGA TTGAAGTCTG CGGCAGATGA ACTGCAGGCC251 AACCTACCTC CCACAAAGCA GGCACGAGTC ATTCCCATAC AATGCAACAT301 CCGGAATGAG GAGGAGGTGA ATAATTTGGT CAAATCTACC TTAGATACTT351 TTGGTAAGAT CAATTTCTTG GTGAACAATG GAGGAGGCCA GTTTCTTTCC401 CCTGCTGAAC ACATCAGTTC TAAGGGATGG CACGCTGTGC TTGAGACCAA451 CCTGACGGGT ACCTTCTACA TGTGCAAAGC AGTTTACAGC TCCTGGATGA501 AAGAGCATGG AGGATCTATC GTCAATATCA TTGTCCCTAC TAAAGCTGGA551 TTTCCATTAG CTGTGCATTC TGGAGCTGCA AGAGCAGGTG TTTACAACCT601 CACCAAATCT TTAGCTTTGG AATGGGCCTG CAGTGGAATA CGGATCAATT651 GTGTTGCCCC TGGAGTTATT TATTCCCAGA CTGCTGTGGA GAACTATGGT701 TCCTGGGGAC AAAGCTTCTT TGAAGGGTCT TTTCAGAAAA TCCCCGCTAA751 ACGAATTGGT GTTCCTGAGG AGGTCTCCTC TGTGGTCTGC TTCCTACTGT801 CTCCTGCAGC TTCCTTCATC ACTGGACAGT CGGTGGATGT GGATGGGGGC851 CGGAGTCTCT ATACTCACTC GTATGAGGTA CCAGATCATG ACAACTGGCC901 CAAGGGAGCA GGGGACCTTT CTGTTGTCAA AAAGATGAAG GAGACCTTTA951 AGGAGAAAGC TAAGCTCTGA GCTGAGGAAA CAAGGTGTCC TCCATCCCCC1001 AGTGCCTTCA CATCTTGAGG(7)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長度322氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(iii)序列描述SEQ ID NO.71 MSLRPRRACA QLLWHPAAGM ASWAKGRSYL APGLLQGQVA IVTGGATGIG51 KAIVKELLEL GSNVVIASRK LERLKSAADE LQANLPPTKQ ARVIPIQCNI101 RNEEEVNNLV KSTLDTFGKI NFLVNNGGGQ FLSPAEHISS KGWHAVLETN151 LTGTFYMCKA VYSSWMKEHG GSIVNIIVPT KAGFPLAVHS GAARAGVYNL201 TKSLALEWAC SGIRINCVAP GVIYSQTAVE NYGSWGQSFF EGSFQKIPAK251 RIGVPEEVSS VVCFLLSPAA SFITGQSVDV DGGRSLYTHS YEVPDHDNWP301 KGAGDLSVVK KMKETFKEKA KL表276.4％ identity in 977 nt overlap203040506070h.seq AGAAGGGCCTGCGCTCAGCTGCTCTGGCACCCCGCTGCAGGGATGGCCTCCTGGGCTAAG| | |||| | ||||| ||| ||| |r.seq GTCTGACTTTAGCGAGACCTGAAGGACAGACTCTCTGCTGCGATGGGCTCTTGGAAGAGT60708090 100 1108090 100 110 120 130h.seq GGCAGGAGCTACCTGGCGCCTGGTTTGCTGCAGGGCCAAGTGGCCATCGTCACCGGCGGG|| ||||||||| ||| | || ||||||||| ||||||||| | ||||||||||||r.seq GGTCAGAGCTACCTAGCGGCCGGGTTGCTGCAGAACCAAGTGGCGGTGGTCACCGGCGGG120 130 140 150 160 170140 150 160 170 180 190h.seq GCCACGGGCATCGGAAAAGCCATCGTGAAGGAGCTCCTGGAGCTGGGGAGTAATGTGGTC||| | ||||| |||||||||||| |||||||||| | |||||| |||| ||||||r.seq GCCACAGGCATTGGAAAAGCCATCTCCCGGGAGCTCCTGCACCTGGGGTGTAACGTGGTC180 190 200 210 220 230200 210 220 230 240 250h.seq ATTGCATCCCGTAAGTTGGAGAGATTGAAGTCTGCGGCAGATGAACTGCAGGCCAACCTA||||| ||||| || |||| ||||| | |||| | ||||||||| ||| |r.seq ATTGCTTCCCGGAAACTGGACAGATTAACCGCTGCTGTGGATGAACTGAGAGCCTCTCAG240 250 260 270 280 290260 270280 290 300 310h.seq CCTCCCACAAAGCAG-GCACGAGTCATTCCCATACAATGCAACATCCGGAATGAGGAGGA|||||| | ||||| | | ||||| ||||||| ||||| ||| |||| || || ||r.seq CCTCCCTC-CAGCAGCACTCAAGTCACCGCCATACAGTGCAATATCAGGAAAGAAGAAGA300310 320 330 340 350
320 330 340 350 360 370h.seqGGTGAATAATTTGGTCAAATCTACCTTAGATACTTTTGGTAAGATCAATTTCTTGGTGAA||||||||||||||||||||||||||||| || | ||| |||||||| |||||||||||r.seqGGTGAATAATTTGGTCAAATCTACCTTAGCTAAATATGGGAAGATCAACTTCTTGGTGAA360 370 380 390 400 410380 390 400 410 420 430h.seqCAATGGAGGAGGCCAGTTTCTTTCCCCTGCTGAACACATCAGTTCTAAGGGATGGCACGC||| | ||| |||||||| | | ||||||||| |||||| | | ||||||||||| ||r.seqCAACGCAGGGGGCCAGTTCATGGCTCCTGCTGAAGACATCACTGCGAAGGGATGGCAAGC420 430 440 450 460 470440 450 460 470 480 490h.seqTGTGCTTGAGACCAACCTGACGGGTACCTTCTACATGTGCAAAGCAGTTTACAGCTCCTG|||| |||| ||||||||||| || |||||||||||||||||||||||||||| |||||r.seqTGTGATTGAAACCAACCTGACTGGCACCTTCTACATGTGCAAAGCAGTTTACAATTCCTG480 490 500 510 520 530500 510 520 530 540 550h.seqGATGAAAGAGCATGGAGGATCTATCGTCAATATCATTGTCCCTACTAAAGCTGGATTTCC||||||||| ||||| || ||||| |||||||||||||||| | ||||| |||||r.seqGATGAAAGACCATGGCGGCTCTATTGTCAATATCATTGTCCTTCTTAACAACGGGTTTCC540 550 560 570 580 590560 570 580 590 600 610h.seqATTAGCTGTGCATTCTGGAGCTGCAAGAGCAGGTGTTTACAACCTCACCAAATCTTTAGC| ||| | ||| |||||| |||||||||||||||||||||||||| ||| | | ||r.seqAACAGCCGCGCACAGTGGAGCGGCAAGAGCAGGTGTTTACAACCTCACGAAAACCATGGC600 610 620 630 640 650620 630 640 650 660 670h.seqTTTGGAATGGGCCTGCAGTGGAATACGGATCAATTGTGTTGCCCCTGGAGTTATTTATTC|||| |||||| |||| ||| | ||||||| |||||||| |||||||||| ||r.seqTTTGACGTGGGCCAGCAGCGGAGTGAGGATCAACTGTGTTGCTCCTGGGACCATTTACTC660 670 680 690 700 710680 690 700 710 720 730h.seqCCAGACTGCTGTGGAGAACTATGGTTCCTGGGGACAAAGCTTCTTTGAAGGGTCTTTTCA|||||||||||| || |||||||| |||||| | | | ||||| | | || |r.seqCCAGACTGCTGTTGACAACTATGGCGAACTGGGACAGACCATGTTTGAGATGGCCTTCGA720 730 740 750 760 770740 750 760 770 780 790h.seqGAAAATCCCCGCTAAACGAATTGGTGTTCCTGAGGAGGTCTCCTCTGTGGTCTGCTTCCT||| ||||| ||||| || |||| | || |||||| ||||| || |||| ||||||||r.seqGAATATCCCAGCTAAGCGTGTTGGACTCCCCGAGGAGATCTCCCCTCTGGTGTGCTTCCT780 790 800 810 820 830800 810 820 830 840 850h.seqACTGTCTCCTGCAGCTTCCTTCATCACTGGACAGTCGGTGGATGTGGATGGGGGCCGGAG|||||| || ||||| ||||||||||||||||||| | ||||||| || |||| |r.seqACTGTCCCCCGCAGCATCCTTCATCACTGGACAGTTAATCAATGTGGACGGAGGCCAGGC840850 860 870 880 890860 870 880 890 900 910h.seqTCTCTATACTCACTCGTATGAGGTACCAGATCATGACAACTGGCCCAAGGGAGCAGGGGA
||| || |||| | || |||||||||||||||||||||| |||||| |||||r.seqTCTGTACACTCGCAACTTCACGATACCAGATCATGACAACTGGCCTGTGGGAGCTGGGGA900 910 920 930 940 950920 930 940 950 960 970h.seqCCTTTCTGTTGTCAAAAAGATGAAGGAGACCTTTAAGGAGAAAGCTAAGCTCTGAGCTGA| |||| || |||| ||| ||||||| | || ||| || |||| | ||||| ||| |r.seqCTCTTCTTTTATCAAGAAGGTGAAGGAATCTTTGAAGAAGCAAGCCAGGCTCTAAGCCAA960 970 980 990 1000 1010980 990 1000 1010 1020h.seqGGAAACA---AGGTGTCCTCCATCCCCCAGTGCCTTCACATCTTGAGG||| ||| || | ||| | ||||||| || || ||||r.seqGGAGACAGCCACCCATTGTGTTTCCTGC-GTGCCTTAACGTCCTGAGAATGTTCGTACTT1020 1030 1040 1050 1060 1070h.seq人hpx-2，4-DCR蛋白的核酸序列(GenBank Accession No.AF212234)r.seq挪威鼠px-2，4-DCR蛋白的核酸序列(GenBank Accession No.AF021854)表371.9％ identity in 303 aa overlap，91.3％ similarity in 303 aa overlap102030405060h.pepMSLRPRRACAQLLWHPAAGMASWAKGRSYLAPGLLQGQVAIVTGGATGIGKAIVKELLEL|+|| +|+|||| ||||+|||+|||||||||||| +|||+|r.pep MGSWKSGQSYLAAGLLQNQVAVVTGGATGIGKAISRELLHL10203040708090 100 110 120h.pepGSNVVIASRKLERLKSAADELQANLPPTKQARVIPIQCNIRNEEEVNNLVKSTLDTFGKI| |||||||||+|| +|+|||+|+ ||+++++| ||||||+|||||||||||| +|||r.pepGCNVVIASRKLDRLTAAVDELRASQPPSSSTQVTAIQCNIRKEEEVNNLVKSTLAKYGKI5060708090 100130 140 150 160 170 180h.pepNFLVNNGGGQFLSPAEHISSKGWHAVLETNLTGTFYMCKAVYSSWMKEHGGSIVNIIVPT||||||+||||++||| |++|||+||+|||||||||||||||+||||+||||||||||r.pepNFLVNNAGGQFMAPAEDITAKGWQAVIETNLTGTFYMCKAVYNSWMKDHGGSIVNIIVLL110 120 130 140 150 160190 200 210 220 230 240h.pepKAGFPLAVHSGAARAGVYNLTKSLALEWACSGIRINCVAPGVIYSQTAVENYGSWGQSFF+ ||| |+||||||||||||||++|| || ||+||||||||+|||||||+||| ||++|r.pepNNGFPTAAHSGAARAGVYNLTKTMALTWASSGVRINCVAPGTIYSQTAVDNYGELGQTMF170 180 190 200 210 220250 260 270 280 290 300h.pepEGSFQKIPAKRIGVPEEVSSVVCFLLSPAASFITGQSVDVDGGRSLYTHSYEVPDHDNWP| +|++|||||+|+|||+| +||||||||||||||| ++||||++|||+++ +|||||||r.pepEMAFENIPAKRVGLPEEISPLVCFLLSPAASFITGQLINVDGGQALYTRNFTIPDHDNWP230 240 250 260 270 280
310 320h.pepKGAGDLSVVKKMKETFKEKAKL|||| | +||+||++|++|+|r.pepVGAGDSSFIKKVKESLKKQARL290 300h.pep人hpx-2，4-DCR蛋白氨基酸序列r.pep挪威鼠px-2，4-DCR蛋白氨基酸序列(GenBank Accession No.AAF14047)
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人hpx-2，4-DCR蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-970位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-970位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-970位的核苷酸序列。
4.一種分離出的人hpx-2，4-DCR蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其特征在于它包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。
8.一種產(chǎn)生具有人hpx-2，4-DCR蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，特征在于其步驟如下(1)將編碼具有人hpx-2，4-DCR蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人hpx-2，4-DCR蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-970位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人hpx-2，4-DCR蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)人hpx-2，4-DCR蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有人hpx-2，4-DCR蛋白活性的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求7所述的人hpx-2，4-DCR蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體，其特征在于它包括多克隆抗體和單克隆抗體。
10.一種核酸分子，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
11.一種用于檢測樣品中是否存在人hpx-2，4-DCR核苷酸序列的方法，其特征在于它包括用權(quán)利要求10所述探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于人hpx-2，4-DCR核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間，引物長度為15～50個核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在人體正常肝癌旁組織中表達(dá)的新的人hpx－2,4－DCR蛋白及其編碼序列,本發(fā)明還提供了該蛋白和核酸序列的制備方法,以及在樣品中檢測人hpx－2,4－DCR核酸序列和多肽的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1265424SQ0011495
公開日2000年9月6日 申請日期2000年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月17日
發(fā)明者李能干, 高國鋒, 彭永德, 李月彬, 顧彥杰, 陳竺, 韓澤廣 申請人:國家人類基因組南方研究中心