專利名稱：細菌發(fā)酵生產(chǎn)l－乳酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其涉及發(fā)酵生產(chǎn)有機酸的領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種用嗜熱性乳酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法。
目前，國內(nèi)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的技術(shù)全部都是用根霉發(fā)酵。但是，根霉發(fā)酵存在許多缺點。首先，根霉發(fā)酵需要通入無菌空氣，因此就要求增加空氣系統(tǒng)，而且對于發(fā)酵罐的設(shè)備要求也較高(通常要用耐溫耐壓的不銹鋼)，電和蒸汽的消耗量也就增大；其次，根霉發(fā)酵對糖的轉(zhuǎn)化率較低，均在70～80％之間；第三，根霉發(fā)酵一般用淀粉作為原料，因而原料成本增加；第四，根霉發(fā)酵溫度均在30～35℃左右，對無菌操作的要求非常嚴格，操作不慎則容易染菌。染細菌會降低L-乳酸的純度；染酵母會產(chǎn)生大量乙醇而產(chǎn)酸很低；染霉菌會產(chǎn)生大量富馬酸而造成倒罐報廢。綜上所述，目前的根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的工藝仍存在著投資成本和生產(chǎn)成本較高以及可操作性較差的缺點。
除了用霉菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸外，國外還有許多人嘗試用細菌來厭氧發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，以避免采用空氣系統(tǒng)帶來的生產(chǎn)成本較高的問題。例如，中國專利申請96121927.0公開了用凝結(jié)芽胞桿菌來發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，但是該菌是一種營養(yǎng)缺陷型菌，對培養(yǎng)基的要求較高。
另外，乳酸桿菌也能生產(chǎn)L-乳酸。目前已知能產(chǎn)L-乳酸的乳酸桿菌有很多種，包括野生乳桿菌、纖毛乳桿菌、干酪乳桿菌、蔗糖乳桿菌、凝固乳桿菌、奧拉金森小桿菌等。但是，還沒有人報道用乳酸桿菌來厭氧發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。因為這些乳酸桿菌存在一個普遍的問題，即它們的發(fā)酵溫度與產(chǎn)D型和D/L型的德氏乳酸桿菌的發(fā)酵溫度接近，因此在發(fā)酵時非常容易混入產(chǎn)D型乳酸的德氏乳酸桿菌，從而導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)生的L-乳酸的純度降低。
因此，本發(fā)明的目的是一種新的發(fā)酵生產(chǎn)高純度L-乳酸的方法。
本發(fā)明涉及一種新的發(fā)酵生產(chǎn)高純度L-乳酸的方法，該方法包括用產(chǎn)L-乳酸的嗜熱性乳酸桿菌在高溫下厭氧發(fā)酵來生產(chǎn)L-乳酸。本發(fā)明另一個較佳的實例是在發(fā)酵溫度為52℃至58℃，更佳的發(fā)酵溫度為52℃-54℃。
本文所述的產(chǎn)L-乳酸的嗜熱性乳酸桿菌例如可用以下方法獲得以發(fā)芽麥粒為原料，在液體增殖培養(yǎng)基中高溫(例如52-58℃)下厭氣培養(yǎng)數(shù)天，收集獲得產(chǎn)酸在7.0％以上、對糖轉(zhuǎn)化率高于90％、L-乳酸純度高于95％的菌株。另外還可對生產(chǎn)菌進行紫外誘變和化學誘變，以篩選出產(chǎn)L-乳酸純度更高、性能更佳的菌株。這些誘變技術(shù)均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
本文中列舉的具體例子是嗜熱性乳酸桿菌(Lactobacillus thermophilus)Lt616，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，本發(fā)明的范圍并不局限于嗜熱性乳酸桿菌Lt616，所有能在高于52℃的溫度下發(fā)酵產(chǎn)生L-乳酸的乳酸桿菌均在本發(fā)明的思路和范圍中。
本發(fā)明采用厭氧發(fā)酵。本文所用的術(shù)語“高溫”是指發(fā)酵溫度高于德氏乳酸桿菌存活的溫度，較佳的在52-58℃之間，更佳的在52-54℃之間。發(fā)酵培養(yǎng)基可含有常用于微生物培養(yǎng)的碳源、氮源和其它營養(yǎng)源。例如碳源可以選自麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、糊精、甘油等；氮源可以是牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、大豆粉、玉米漿等；其它營養(yǎng)源可選自磷酸鹽、硫酸鎂、氯化鈉、碳酸鈣。培養(yǎng)基的pH在5.5-6.5之間。
對于發(fā)酵液總糖，可采用費林式法進行測定。對于發(fā)酵液總酸，則可用E.D.T.A法測出乳酸蓋含量再換算成乳酸量。
本文所用的術(shù)語“高純度”是指L-乳酸的純度至少為95％，更佳的在97％以上。L-乳酸的純度可用紙上層析法測定，也可以用乳酸-葡萄糖分析儀或高壓液相色譜法來測定，這些方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
本發(fā)明利用嗜熱性乳酸桿菌厭氧發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法不僅不必象根霉發(fā)酵那樣有較高的投資成本和生產(chǎn)成本，而且更重要的是，該發(fā)酵工藝通過利用高溫條件抑制了產(chǎn)D型乳酸的德氏乳酸桿菌的生長，從而使得發(fā)酵產(chǎn)物的L-乳酸純度高于95％。
下面將結(jié)合實施例進一步詳細描述本發(fā)明。
實施例1嗜熱性乳酸桿菌的篩選a)培養(yǎng)基組成下面提供了用于篩選以及發(fā)酵的培養(yǎng)基的組成，其中培養(yǎng)基組分用％(重量)表示，所有試劑均為化學純。
分離培養(yǎng)基1(％)麥芽糖6，牛肉膏0.15，蛋白胨0.1，磷酸氫二鉀0.05，磷酸二氫鉀0.04，硫酸鎂0.04，氯化鈉0.02，碳酸鈣7，瓊脂4，蒸餾水定容至100ml，自然pH，于0.1Mpa滅菌20分鐘。
分離培養(yǎng)基2(％)葡萄糖1，牛肉膏0.05，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，吐溫80 0.05，碳酸鈣7，瓊脂4，蒸餾水定容至100ml，自然pH，于0.1Mpa滅菌20分鐘。
斜面培養(yǎng)基(％)麥芽糖6，牛肉膏0.3，蛋白胨0.2，酵母膏0.3，磷酸氫二鉀0.05，磷酸二氫鉀0.05，硫酸鎂0.05，氯化鈉0.02，碳酸鈣5，瓊脂3，蒸餾水定容至100ml，自然pH，于0.1Mpa滅菌15分鐘。
液體增殖培養(yǎng)基(％)麥芽糖4，牛肉膏0.3，蛋白胨0.2，酵母膏0.25，磷酸氫二鉀0.05，磷酸二氫鉀0.05，硫酸鎂0.05，氯化鈉0.05，碳酸鈣5，蒸餾水定容至100ml，自然pH，于0.1Mpa滅菌10分鐘。
種子培養(yǎng)基8％玉米粉、5％米糠。玉米粉、米糠產(chǎn)地為山東省鄒平。
發(fā)酵培養(yǎng)基12％玉米粉、3％米糠。玉米粉、米糠產(chǎn)地為山東省鄒平。
b)嗜熱性乳酸桿菌的篩選取兩種供試驗分離的樣品發(fā)芽麥粒0.5～1克分別投入裝有液體增殖培養(yǎng)基的兩支試管內(nèi)，加塞，于50±1℃培養(yǎng)二天。取出測酸，挑出試管液面不生膜、產(chǎn)酸在3.5％以上的試管樣品，然后在分離培養(yǎng)基1上做平板劃線分離，在厭氣條件下培養(yǎng)三天。選擇其中透明圈大的菌落，重復(fù)接入液體增殖培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)二天，測定產(chǎn)酸在4.0以上，紙上層析中與標準對照(美國Sigma公司結(jié)晶乳酸稀釋成2％的乳酸)相同的菌株為標準，共獲得364株。
將364株分別接入液體增殖培養(yǎng)基內(nèi)，加塞在厭氣條件下58±1℃培養(yǎng)三天，在顯微鏡下觀察菌體的外觀形態(tài)為粗壯稍彎直長桿狀，不規(guī)則，少見分段。桿狀大小0.9～1.0×7～13μm。液面特征不產(chǎn)膜，生成輪圈。以此為標準共獲得56株。
重復(fù)上述操作，并將所獲得菌株分別移入種子培養(yǎng)基中，在53±1℃、pH5.5～6.5下培養(yǎng)24～36小時，接入發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，接種量為10％。在52±1℃，pH5.5～6.5下培養(yǎng)四天，每天流加滅過菌的碳酸鈣中和生成的乳酸。收集產(chǎn)酸在7.0％以上、對糖轉(zhuǎn)化率不低于90％、L-乳酸純度不低于70％的菌株，獲得26株。
先在分離培養(yǎng)基2上涂布分離，在53±1℃，pH5.5～6.5，厭氣條件下培養(yǎng)三天。將篩選出的單菌落挑出移植到液體增殖培養(yǎng)基內(nèi)，在53±1℃，pH5.5～6.5，培養(yǎng)二天。取出5ml，再加入到15ml pH=7.0～7.2的磷酸-磷酸鈉緩沖溶液之中，搖勻后加入無水乙醇1.5ml，另外加入0.5ml硫酸二乙酯原液，混勻反應(yīng)60分鐘，取出立即加入25％的硫代硫酸鈉溶液15ml，搖均勻靜止15分鐘。將處理后的溶液，稀釋適當?shù)谋稊?shù)，直接在分離培養(yǎng)基2涂布平板分離。將篩選出的單菌落挑出移植到斜面培養(yǎng)基中，于53±1℃，pH5.5～6.5，培養(yǎng)3～4天。再進行搖瓶試驗，篩選出L-乳酸純度高于95％的菌株6株。
獲得的嗜熱性乳酸桿菌命名為Lt616，其特性如下該菌在天然培養(yǎng)基上的發(fā)酵條件厭氧發(fā)酵，溫度53±1℃，pH5.5～6.5，發(fā)酵時間3～4天；外觀形態(tài)粗狀稍彎直長桿狀，不規(guī)則，少見分段。桿狀φ:1.0～0.9μ,L:3～7μ.液面特征不產(chǎn)膜，生成輪圈；生理特性革蘭氏陽性菌，產(chǎn)L(+)-乳酸，同型乳酸發(fā)酵，無消旋酶。
實施例2發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸實施例1篩選獲得的嗜熱性乳酸桿菌53℃靜止培養(yǎng)48-72小時后可供使用或冰箱保存。
ⅰ)一級種子250ml三角瓶取250ml三角瓶，加入200ml種子培養(yǎng)基，經(jīng)過淀粉酶和糖化酶液化及糖化后，53℃靜止培養(yǎng)20-40小時，并流加無菌碳酸鈣。
ⅱ)二級種子5升自控玻璃罐在5升自控玻璃罐中加入種子培養(yǎng)基4升，經(jīng)過淀粉酶和糖化酶的液化及糖化后，接入三角瓶內(nèi)的培養(yǎng)基，接種量為10％。在轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分、53℃下培養(yǎng)20-40小時，并流加無菌碳酸鈣。
ⅲ)三級種子200升種子罐在200升種子罐中加入種子培養(yǎng)基100升，經(jīng)過淀粉酶和糖化酶的液化及糖化后，接入5升自控玻璃罐中的二級種子，接種量為10％。在轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分、53℃下培養(yǎng)20-40小時，并流加無菌碳酸鈣。
ⅳ)1000升發(fā)酵罐發(fā)酵罐裝液量為500升，接種量為20％。用自來水將原料調(diào)勻，加10～15U/克淀粉淀粉酶并升溫，在90～95℃液化15分鐘至液化完全。用水定容并冷卻至60℃，加100～150U/克淀粉糖化酶糖化48小時滅菌，在52℃后接種。在52℃、轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分下培養(yǎng)3-4天，并流加碳酸鈣。在發(fā)酵過程中，隨時流加無菌碳酸鈣調(diào)節(jié)pH5.5～6.5。當發(fā)現(xiàn)隨著時間的推移，發(fā)酵不再產(chǎn)酸或略微產(chǎn)酸即認為發(fā)酵結(jié)束。
用費林氏法測定發(fā)酵液總糖。用EDTA法測出乳酸鈣含量，再換算成乳酸量。由于篩選菌種過程中就對發(fā)酵液進行紙層析檢測，除乳酸斑點外幾乎無其他副產(chǎn)物斑點。因此可視總酸為乳酸含量。
乳酸的光學純度可用裝備了手性分析柱的高壓液相色譜儀(島津液相色譜儀LC-6A)來測定。
下表1、2和3分別列出了250ml三角瓶、5升自控玻璃罐以及1000升發(fā)酵罐的結(jié)果。
表1 250ml三角瓶試驗結(jié)果
表25升自控玻璃罐試驗結(jié)果
表3 1000升發(fā)酵罐連續(xù)三批試驗結(jié)果
從表1、2和3的結(jié)果表明，無論是小試搖瓶水平還是中試規(guī)模，L-乳酸純度均高于95％，產(chǎn)酸率達到7.0-7.5％，轉(zhuǎn)化率為90-95％。這說明該菌株Lt616的遺傳性能比較穩(wěn)定，不會隨著規(guī)模的擴大而變化，能適應(yīng)大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
本文公開和揭示的所有組合物與方法可通過借鑒本文公開內(nèi)容無需進行過多試驗而制得和實施。盡管本發(fā)明的組合物和方法已經(jīng)通過較佳實例進行了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯能在不脫離本發(fā)明的內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的組合物、方法、以及方法步驟和步驟次序作改動。更具體地，明顯可用化學和生理上相關(guān)的某些試劑代替本文所述的試劑來獲得相同或相似的結(jié)果。所有這些相似的替換和改動對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括附加權(quán)利要求定義的本發(fā)明精神、范圍和內(nèi)容中。
權(quán)利要求
1．一種新的發(fā)酵生產(chǎn)高純度L-乳酸的方法，該方法包括用產(chǎn)L-乳酸的嗜熱性乳酸桿菌高溫厭氧發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，發(fā)酵溫度為52℃-58℃。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，發(fā)酵溫度為52℃-54℃。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，發(fā)酵液中L-乳酸的純度高于95％。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，發(fā)酵液中L-乳酸的純度高于97％。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的產(chǎn)L-乳酸的嗜熱性乳酸桿菌可通過在高溫下厭氣培養(yǎng)數(shù)天后，以L-乳酸純度為標準篩選獲得。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，還可任選地進行紫外誘變篩選和化學誘變篩選。
8．根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述產(chǎn)L-乳酸的嗜熱性乳酸桿菌是嗜熱性乳酸桿菌Lt616。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的發(fā)酵生產(chǎn)高純度L－乳酸的方法,該方法包括用產(chǎn)L－乳酸的嗜熱性乳酸桿菌高溫厭氧發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸。該發(fā)酵工藝通過利用高溫條件抑制了產(chǎn)D型乳酸的德氏乳酸桿菌的生長,從而使得發(fā)酵產(chǎn)物的L－乳酸純度高于95%。
文檔編號C12P7/40GK1306091SQ0011145
公開日2001年8月1日 申請日期2000年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月17日
發(fā)明者虞東勝 申請人:上海市工業(yè)微生物研究所