專利名稱：一種培育脫病毒良種苗木的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬栽培植物良種苗木技術(shù)領(lǐng)域。
人類栽培的植物(農(nóng)作物、果樹、林木、花卉等)在其長(zhǎng)期無性繁殖過程中，大多感染并積累了多種病毒。世界各地報(bào)道的蘋果病毒有39種，梨病毒23種，葡萄病毒43種、草莓病毒25種、桃病毒39種、李病毒28種、甜櫻桃病毒36種、酸櫻桃病毒21種、杏病毒19種、柑桔病毒20種、還有香蕉病毒、馬鈴薯病毒，郁金香病毒、唐菖蒲病毒、無花果病毒等。這些病毒在植物細(xì)胞內(nèi)干擾了正常的生理代謝活動(dòng)，引起植物體生長(zhǎng)減弱，早衰，植株矮化，葉片變色、卷曲、皺縮、黃化，果實(shí)畸形，變小，不著色，含糖量降低，落花、落果，使栽培植物產(chǎn)量減產(chǎn)20％-100％，給人類的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在現(xiàn)代高效優(yōu)質(zhì)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中，栽培植物病毒病已引起全世界的高度重視。七十年代以前人們發(fā)現(xiàn)把栽培植物的枝條放置在高溫條件下進(jìn)行熱處理，可使部分病毒鈍化，暫時(shí)失去生物活性，能降低病毒病對(duì)植物體的危害程度。但這種熱處理方法并沒有徹底從植物體內(nèi)清除病毒，經(jīng)過一個(gè)較長(zhǎng)時(shí)間后病毒又會(huì)在植物體內(nèi)重新蔓延。特別是對(duì)那些多年生植物來說，這種熱處理方法效果不佳。以后人們又發(fā)現(xiàn)病毒在植物體內(nèi)分布是不均勻的。植物的莖尖和根尖的分生組織區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)這一微小區(qū)域內(nèi)沒有病毒。于是人們應(yīng)用植物組織培養(yǎng)方法，切取0.2-0.5毫米無維管束組織的莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)，獲得了脫病毒的苗木。但是這種莖尖脫病毒方法切取的莖尖很小需要在顯微解剖鏡下進(jìn)行工作，具體操作十分困難，莖尖培養(yǎng)成活率、脫毒率也很低。進(jìn)入九十年代后，人們又將熱處理方法與莖尖培養(yǎng)方法結(jié)合起來進(jìn)行脫病毒。先將要脫毒的植物莖尖(如盆栽苗木或試管苗)放置在35-40℃條件熱處理1個(gè)多月，在高溫下病毒被鈍化，使其在植物體內(nèi)的繁殖傳播速度大減。在這一高溫環(huán)境中長(zhǎng)出的新植株莖尖很可能脫掉病毒，可切取較長(zhǎng)的莖尖1-3毫米進(jìn)行培養(yǎng)，能獲得脫病毒苗木。目前生產(chǎn)中培育脫病毒良種苗木采用的是上述這種方法。在實(shí)際生產(chǎn)操作中切取較大的莖尖(如3毫米長(zhǎng))培養(yǎng)成活率高，但脫毒率很低；切取較小的莖尖(1毫米以內(nèi))脫毒率較高，但成活率很低，而且培養(yǎng)成活的脫毒試管苗還有可能發(fā)生變異，改變優(yōu)良品種的性狀。所以，在實(shí)際生產(chǎn)中這些問題始終困擾著人們培育脫病毒良種苗木的正常工作。
本發(fā)明目的就是針對(duì)上述情況，采用完全無光黑暗條件對(duì)苗木進(jìn)行熱處理培養(yǎng)，成倍的擴(kuò)大了莖尖無病毒區(qū)域，再切取莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，即能夠完全脫除病毒，提高脫毒率，又能夠切取較長(zhǎng)的莖尖，提高莖尖培養(yǎng)成活率，防止發(fā)生良種苗木的變異。為實(shí)際生產(chǎn)提供了一種新的高效率培育脫病毒良種苗木的方法。
本發(fā)明一種培育脫病毒良種苗木的方法是先將要脫病毒的苗木采用植物組織培養(yǎng)的方法，把它們培養(yǎng)成試管苗，最好是在試管內(nèi)生根階段的苗或叢生芽狀階段的苗。把這種生長(zhǎng)旺盛的試管苗放置在完全無光黑暗的條件下進(jìn)行熱處理培養(yǎng)45-60天。熱處理溫度為35-40℃。或者將要脫病毒的盆栽苗木(最好是剛經(jīng)過休眠階段的苗木)放置在完全無光黑暗的條件下進(jìn)行熱處理培養(yǎng)45-50天，熱處理溫度為35-40℃。苗木經(jīng)過45-60天的無光黑暗熱處理以后，試管苗莖尖能長(zhǎng)出1-4厘米長(zhǎng)的淡黃色的幾乎無葉片的新生莖尖；盆栽苗木能長(zhǎng)出5-10厘米的淡黃色的頂端幾乎無葉片的新生莖尖。對(duì)這些新生莖尖進(jìn)行縱向石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)試管苗新生莖尖的分生組織區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)，這些無微管束區(qū)長(zhǎng)度可達(dá)5-10毫米以上；盆栽苗木新生莖尖的分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)(無微管束區(qū))長(zhǎng)度可達(dá)10-15毫米以上。病毒在植物體內(nèi)主要就是通過微管束來傳播的，微管束能將下部成熟植物體內(nèi)的病毒傳送到微管束區(qū)與伸長(zhǎng)區(qū)交界處，莖尖分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)無微管束，所以莖尖分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)屬于植物體上無病毒區(qū)域。通過無光黑暗熱處理培養(yǎng)，阻止了植物體內(nèi)正常的光形態(tài)建成過程，使莖尖的分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)的細(xì)胞分化成微管束的過程被減慢，所以分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)這一無病毒區(qū)域被擴(kuò)大。再加上35-40℃的長(zhǎng)期熱處理，使植物體內(nèi)的病毒被鈍化，暫時(shí)失去植物活性，不能繁殖和快速傳播。所以經(jīng)過無光黑暗條件下熱處理苗木的新生莖尖，無病毒區(qū)域被擴(kuò)大。本發(fā)明的特點(diǎn)在于無光黑暗條件下長(zhǎng)期熱處理苗木，能極大地?cái)U(kuò)大新生莖尖的無病毒區(qū)域。
本發(fā)明一種培育脫病毒良種苗木的方法是第一條途徑，按照植物組織培養(yǎng)方法，在無菌條件下切取經(jīng)過無光黑暗熱處理的新生莖尖長(zhǎng)5-8毫米，接種到新配制的莖尖培養(yǎng)基上。在光照強(qiáng)度1500-3000勒克斯，溫度25-28℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使莖尖生長(zhǎng)，分化。經(jīng)過幾代反復(fù)擴(kuò)大增殖培養(yǎng)，對(duì)每一個(gè)莖尖的無性系苗木進(jìn)行病毒檢測(cè)。采用指示植物檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫法，電子顯微鏡檢測(cè)法，確定這一無性系苗木完全脫病毒后，應(yīng)用植物組培快速繁殖方法對(duì)脫病毒良種苗木進(jìn)行繁殖，為生產(chǎn)提供大批量脫病毒良種苗木。第二條途徑，經(jīng)過無光黑暗熱處理的盆栽苗木，可切取10-12毫米長(zhǎng)的莖尖，嫁接到事先準(zhǔn)備好的無病毒砧木上，每一個(gè)莖尖嫁接一個(gè)砧木。當(dāng)莖尖接穗成活生長(zhǎng)后，對(duì)每一個(gè)莖尖苗木進(jìn)行病毒檢測(cè)，確定這一莖尖苗木無病毒后，以這一脫病毒良種苗木為母體，剪取其新枝條作接穗，進(jìn)行大量嫁接繁殖脫病毒良種苗木。本發(fā)明的特點(diǎn)在于切取5-8毫米長(zhǎng)的經(jīng)過無光黑暗熱處理試管苗的莖尖，通過組培快速繁殖方法大量繁殖脫病毒良種苗木；切取10-12毫米長(zhǎng)的經(jīng)過無光黑暗熱處理的盆栽苗木莖尖，通過嫁接方法大量繁殖脫病毒良種苗木。
采用本發(fā)明方法培育脫病毒良種苗木，具有操作方法簡(jiǎn)單、易行、脫病毒率和成活率很高等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用效果良好。用本發(fā)明方法脫葡萄扇葉病毒、卷葉病毒、莖痘病毒，栓皮病毒，試管苗經(jīng)過無光黑暗熱處理培養(yǎng)后，可直接切取8毫米長(zhǎng)的莖尖，不需要在顯微解剖鏡下操作切取0.3毫米長(zhǎng)的莖尖，所以本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單易行。這樣8毫米長(zhǎng)的莖尖接種到培養(yǎng)基上成活率都在100％。用指示植物檢測(cè)病毒，結(jié)果脫病毒率為100％。因此本發(fā)明方法脫病毒率高，成活率高。培育出來的脫病毒葡萄良種苗木在生產(chǎn)中栽培結(jié)果后，葡萄果粒增大，甜度明顯提高，結(jié)果產(chǎn)量增產(chǎn)70-80％，經(jīng)濟(jì)效益顯著增加。
實(shí)施例1冬季將經(jīng)過休眠期的感染有梨石痘病毒的盆栽庫(kù)爾勒香梨，放置在完全無光黑暗條件下，在38℃±1℃的環(huán)境中熱處理培養(yǎng)60天。要定期給盆栽香梨澆水，防止因缺水造成苗木死亡。同時(shí)在溫室中，播種無病毒的杜梨種子，培養(yǎng)杜梨營(yíng)養(yǎng)缽苗作嫁接砧木。切取無光黑暗熱處理的香梨莖尖10毫米長(zhǎng)，操作時(shí)要注意刀具器械不要與莖尖下部組織相接觸，以免交叉感染病毒。采用劈接法將香梨莖尖嫁接到杜梨砧木上，2周后香梨莖尖開始萌動(dòng)、生長(zhǎng)，莖尖嫁接成活率為80％，每一個(gè)莖尖嫁接一個(gè)砧木，并按順序編號(hào)。春夏季香梨莖尖嫁接苗長(zhǎng)大后進(jìn)行病毒檢測(cè)，可采用血清學(xué)快速檢測(cè)法，檢測(cè)結(jié)果脫除梨石痘病毒的苗木為95％。將培育得到的無毒庫(kù)爾勒香梨良種苗木作為采穗母株，采其枝芽作接穗，大量繁殖脫毒香梨苗木，為生產(chǎn)栽培提供無毒良種苗木。
實(shí)施例2新疆哈密大棗感染病毒后，大棗變小，葉片出現(xiàn)明顯缺綠斑塊，落花落果嚴(yán)重，產(chǎn)量大幅下降。將感染病毒的哈密大棗，通過植物組織培養(yǎng)方法，培養(yǎng)出試管叢生芽。將這種哈密大棗試管苗放置在完全無光黑暗的條件下，在38℃±0.5℃環(huán)境中熱處理培養(yǎng)50天。這時(shí)候哈密大棗試管苗重新生長(zhǎng)出2-3厘米長(zhǎng)的淡黃色無葉片莖尖。在無菌室的凈化工作臺(tái)上，直接切取8毫米長(zhǎng)的莖尖，操作時(shí)刀具器械不要接觸莖尖下部組織，防止病毒交叉感染新莖尖組織。將每一個(gè)莖尖分別接種到一個(gè)三角瓶中的新培養(yǎng)基中，并對(duì)每一個(gè)三角瓶中的莖尖進(jìn)行編號(hào)。莖尖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1.0毫克/升的激動(dòng)素+1.0毫克/升的6-基氨基嘌呤+0.02毫克/升萘乙酸。在光照強(qiáng)度1500-3000勒克斯，溫度25-30℃條件下，培養(yǎng)1周莖尖開始萌動(dòng)、生長(zhǎng)，莖尖培養(yǎng)成活率為100％。經(jīng)過幾代的誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)，每個(gè)莖尖可以獲得許多試管叢生芽。采用酶聯(lián)免疫法對(duì)試管苗進(jìn)行病毒檢測(cè)，結(jié)果脫病毒率為100％。然后通過植物組培快速繁殖方法，大批量地生產(chǎn)脫病毒良種棗苗，為生產(chǎn)栽培提供無毒良種苗木。
權(quán)利要求
1.一種培育脫病毒良種苗木的方法，其特征在于對(duì)要脫病毒的苗木，先放置在完全無光黑暗的條件下，進(jìn)行熱處理培養(yǎng)一個(gè)時(shí)期，再切取較長(zhǎng)的莖尖，培養(yǎng)出脫病毒良種苗木。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育脫病毒良種苗木的方法，其特征是要脫病毒的苗木可以是試管苗，也可以是盆栽苗木。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育脫病毒良種苗木的方法，其特征是熱處理溫度為35-40℃，熱處理時(shí)間為40-60天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育脫病毒良種苗木的方法，其特征是切取試管苗莖尖的長(zhǎng)度為5-8毫米，切取盆栽苗莖尖的長(zhǎng)度為10-12毫米。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育脫病毒良種苗木的方法，其特征是切取的莖尖可以通過植物組織培養(yǎng)方法培育出脫病毒苗木，也可以通過將莖尖嫁接到無病毒砧木上的方法培育出脫病毒苗木。
全文摘要
本發(fā)明將感染有各種病毒的苗木放置在完全無光黑暗的條件下,進(jìn)行高溫?zé)崽幚砼囵B(yǎng),溫度35—40℃,時(shí)間40—60天。經(jīng)過無光熱處理苗木莖尖的無病毒區(qū)域被擴(kuò)大,可切取5—10毫米長(zhǎng)的莖尖,通過植物組培快速繁方法和莖尖嫁接方法,培養(yǎng)出脫病毒良種苗木。本發(fā)明方法具有操作簡(jiǎn)單、易行,脫病毒率和莖尖培養(yǎng)成活率高,而且苗木無變異,能保持良種苗木的全部?jī)?yōu)良特性等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明為培育脫病毒良種苗木提供了一個(gè)新的方法。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1255283SQ9812326
公開日2000年6月7日 申請(qǐng)日期1998年11月29日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月29日
發(fā)明者陳方, 李康 申請(qǐng)人:陳方, 李康