一種利用根腐病菌粗毒素快速篩選小麥根腐病抗性品種的育種方法與流程

本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是指一種通過優(yōu)選適宜濃度的根腐病菌粗毒素處理雜交種對根腐病菌粗毒素的超敏時(shí)期-受精卵第一次分裂期、從而特異性篩選根腐病抗性小麥家系、大大提高了根腐病抗性育種的工作效率和準(zhǔn)確度的利用根腐病菌粗毒素快速篩選小麥根腐病抗性品種的育種方法。

背景技術(shù)：

小麥根腐?。╳heatrootrot）又稱根腐葉斑病或黑胚病，屬于土傳真菌病害，可在小麥的全生育期內(nèi)發(fā)病，可以危害小麥根莖部，引起根腐，也可以危害小麥的葉部，引起葉斑，亦能危害小麥籽粒，引起黑胚。該病分布在亞洲、北美洲、南美洲和歐洲等許多國家，屬于全世界性病害。在我國東北、華北、西北地區(qū)、內(nèi)蒙古等地區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，近年來不斷擴(kuò)大，廣東、福建麥區(qū)也有發(fā)現(xiàn)。

小麥根腐病癥狀因氣候條件而不同。在干旱半干旱地區(qū)，多引起莖基腐、根腐；多濕地區(qū)除以上癥狀外，還引起葉斑、莖枯、穗頸枯。小麥根腐病是小麥全生育期病害。幼苗受侵，芽鞘和根部變褐甚至腐爛；嚴(yán)重時(shí)，幼芽不能出土而枯死。在分蘗期，根莖部產(chǎn)生褐斑，葉鞘發(fā)生褐色腐爛，嚴(yán)重時(shí)也可引起幼苗死亡。成株期在葉片或葉鞘上，最初產(chǎn)生黑褐色梭形病斑，以后擴(kuò)大變?yōu)闄E圓形或不規(guī)則形褐斑，中央灰白色至淡褐色，邊緣不明顯，葉鞘上的病斑還可引起莖節(jié)發(fā)病。穗部發(fā)病，一般是個(gè)別小穗發(fā)病，小穗梗和穎片變?yōu)楹稚?，在濕度較大時(shí)，病斑表面也產(chǎn)生黑色霉?fàn)钗?，有時(shí)會發(fā)生穗枯或掉穗。種子受害時(shí)，病粒胚尖呈黑色，重者全胚呈黑色。根腐病除發(fā)生在胚部以外，也可發(fā)生在胚乳的腹背或腹溝等部分。

小麥根腐病患病田塊輕者一般減產(chǎn)5%～10%，重則減產(chǎn)20%～50%。在墨西哥，小麥根腐病部分地區(qū)發(fā)病嚴(yán)重，對麥類作物可造成減產(chǎn)高達(dá)43.2%。在贊比亞，由麥根腐離蠕孢引起的小麥根腐病造成過85%的產(chǎn)量損失。在我國，河北張家口地區(qū)小麥根腐病曾造成高達(dá)20%～30%的損失。麥類根腐病癥狀復(fù)雜，損失較大，不僅影響產(chǎn)量，還可以產(chǎn)生毒素，嚴(yán)重降低小麥的品質(zhì)和商品價(jià)值。近年來，由于秸稈持續(xù)還田等原因，小麥根腐病在北方地區(qū)的發(fā)生逐年加重，部分地區(qū)造成嚴(yán)重危害，已經(jīng)成為小麥生產(chǎn)上的重要問題。

隨著人們對小麥根腐病認(rèn)識的逐漸加深，對根腐病的防治也越來越受到重視。小麥根腐病防治措施主要包括農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治三個(gè)方面。通過耕作制度和栽培方式的改變，在一定程度上可以減輕小麥根腐病的發(fā)生及危害程度，但難以從根本上消除病害的蔓延和危害。利用科學(xué)預(yù)報(bào)，并在恰當(dāng)時(shí)段內(nèi)采用化學(xué)藥劑防治的手段，對防控小麥根腐病的發(fā)生和危害具有一定的效果，然而化學(xué)藥劑防治不僅會增加農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，降低小麥生產(chǎn)效益，還不可避免地會造成農(nóng)業(yè)環(huán)境污染。環(huán)境微生物和植物提取物也常被用來防治小麥根部病害，生物防治具有環(huán)保污染小的優(yōu)點(diǎn)，但生物防治治理效果有待提高，而且成本較高，難以產(chǎn)業(yè)化推廣。

利用抗病品種是防治小麥根腐病的主要措施之一，培育和種植小麥根腐病抗病品種是控制小麥根腐病危害最為經(jīng)濟(jì)環(huán)保的有效途徑。國內(nèi)外對麥類品種抗根腐病的研究共同表明，生產(chǎn)上推廣的小麥品種大部分表現(xiàn)為感病或高感，只有少量屬于抗病品種，高抗品種很少。隨著小麥根腐病的不斷加重，對該病的研究和防治工作亟待加強(qiáng)。而且目前該地區(qū)推廣的品種對小麥根腐病的抗性尚不明確，給利用品種抗性防治該病帶來一定困難。由于該病病原菌麥根腐離蠕孢易發(fā)生遺傳變異，容易導(dǎo)致致病力分化和強(qiáng)致病力菌株出現(xiàn)，原有抗病品種的抗性喪失，給抗病品種的篩選和新品種培育帶來了一定的困難。目前小麥根腐病抗性改良進(jìn)程較慢，難以滿足生產(chǎn)上對抗性品種的要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對目前小麥根腐病抗性鑒定工作量大、抗病育種進(jìn)程緩慢的缺陷，提供了一種通過優(yōu)選適宜濃度的根腐病菌粗毒素處理雜交種對根腐病菌粗毒素的超敏時(shí)期-受精卵第一次分裂期、從而特異性篩選根腐病抗性小麥家系、大大提高了根腐病抗性育種的工作效率和準(zhǔn)確度的利用根腐病菌粗毒素快速篩選小麥根腐病抗性品種的育種方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案解決的：

一種利用根腐病菌粗毒素快速篩選小麥根腐病抗性品種的育種方法，其特征在于：該育種方法的步驟如下：

（1）選取待改良小麥品種/系和小麥根腐病抗源，雜交獲得f1：選擇農(nóng)藝性狀優(yōu)良、根腐病抗性待改良的小麥品種/系作為雜交母本，選擇高抗根腐病的小麥根腐病抗源作為雜交父本，大田種植父母本，抽穗后雜交獲得f1；

（2）f1回交獲得bcf1：將上步收獲的f1雜交種和母本大田種植，抽穗后回交獲得bcf1雜交種；

（3）分期播種父母本和bcf1：大田正季種植雜交父本、母本和bcf1雜交種，分期播種，父母本提前播種，使父母本的抽穗期比bcf1雜交種早15～25天；

（4）梯度濃度的根腐病菌粗毒素處理父母本，選定根腐病抗性篩選壓：采用梯度濃度的根腐病菌粗毒素分別處理父本和母本抽穗期植株的小花，處理完成后將植株回栽到大田，待小麥籽粒進(jìn)入“多半仁”期時(shí)即統(tǒng)計(jì)籽粒結(jié)實(shí)率，由于父本的根腐病抗性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于母本，因此父本自交受精卵對根腐病菌粗毒素的耐性要高于母本自交受精卵，選擇母本小麥籽粒結(jié)實(shí)率為0且20%＜父本小麥籽粒結(jié)實(shí)率＜50%的濃度的根腐病菌粗毒素作為根腐病抗性篩選壓；

（5）根腐病抗性篩選壓處理bcf1，獲得bcf2：采用根腐病抗性篩選壓處理抽穗期bcf1雜交種小麥植株小花，處理完成后將植株回栽到大田，結(jié)實(shí)后收種，獲得bcf2；

（6）取bcf2進(jìn)行花藥培養(yǎng)獲得花培家系，根腐病抗性、農(nóng)藝性狀篩選獲得根腐病抗性小麥新品系：bcf2大田種植，正季農(nóng)藝性狀篩選淘汰部分bcf2（如株高不適、分蘗力差、抽穗期過遲），抽穗后取花藥進(jìn)行培養(yǎng)獲得花培家系，花培家系大田種植，以待改良小麥品種/系和小麥根腐病抗源親本為對照，根腐病抗性鑒定各家系綜合感病指數(shù)、農(nóng)藝性狀篩選獲得農(nóng)藝性狀良好且根腐病抗性得到改良的根腐病抗性小麥新品系。

所述步驟（1）中的農(nóng)藝性狀優(yōu)良、根腐病抗性待改良的小麥品種/系是指產(chǎn)量高、米質(zhì)優(yōu)良、抗倒伏、根腐病抗性有待改良的小麥品種/系；小麥根腐病抗源是指根腐病抗性鑒定試驗(yàn)中，綜合感病指數(shù)不高于抗病對照鄭麥9962感病指數(shù)的小麥品種/系。

所述的根腐病菌粗毒素的制備方法為：將小麥根腐病菌活化后轉(zhuǎn)接于pda培養(yǎng)基，28℃下暗培養(yǎng)7d，然后取菌落邊緣菌絲按照30cm²菌絲/l液體培養(yǎng)基的比例接種菌絲到改良fries液體培養(yǎng)基中，置于搖床中70r/min、28℃暗培養(yǎng)21d，待菌絲長成菌球后，用紗布過濾，濾出菌絲和菌球，然后將濾液3000r/min離心30m，棄沉淀，得毒素上清液；分別將上清液與等體積的乙酸乙酯、乙醇混合，萃取分層后，移出有機(jī)相，繼續(xù)對水相進(jìn)行萃取，連續(xù)萃取2次，將有機(jī)相和水相萃取液在38℃條件下減壓蒸餾，殘?jiān)脽o菌水溶解，定容至毒素上清液的1/100，即為根腐病菌粗毒素原液。

所述的根腐病菌粗毒素和根腐病抗性篩選壓處理抽穗期小麥植株小花的具體操作流程為：前天下午挖取小麥抽穗期植株，于當(dāng)天晚上剪掉已經(jīng)開花的小花，第2天下午開花后再剪掉未開花的幼嫩的小花，只留取當(dāng)天開花的小穗用于根腐病菌粗毒素浸泡處理，浸泡處理時(shí)間為挖取植株的第2天晚上18點(diǎn)到第3天早上8點(diǎn)，浸泡結(jié)束后將麥穗用流水沖洗10min。

所述的綜合感病指數(shù)的獲取方法為：小麥根腐病抗性鑒定試驗(yàn)中，發(fā)病盛期調(diào)查葉病情嚴(yán)重度2～3次，葉部病情嚴(yán)重度分5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)級別：

0級：旗葉無病或上部第二葉偶有小病斑，占葉面積≤5%；

l級：旗葉有個(gè)別小病斑，5%＜占葉面積≤15%；

2級：旗葉病斑較多，15%＜占葉面積≤45%；

3級：旗葉病斑很多，45%＜占葉面積≤75%，部分葉片枯死；

4級：全株病斑密集，病斑大而連片，占葉面積＞75%，葉片大部分枯死；

計(jì)算葉感病指數(shù)，葉感病指數(shù)=各級病葉數(shù)（0～4）×相應(yīng)級別的總和/（調(diào)查葉數(shù)×4）；

待鑒定小麥材料按穗收種，脫粒后調(diào)查黑胚粒率，穗部病情嚴(yán)重度按黑胚粒率分5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)級別：

0級：黑胚粒率≤2%；

l級：2%＜黑胚粒率≤10%；

2級：10%＜黑胚粒率≤25%；

3級：25%＜黑胚粒率≤45%；

4級：黑胚粒率＞45%；

計(jì)算穗感病指數(shù)，穗感病指數(shù)=各級病穗數(shù)（0～4）×相應(yīng)級別的總和/（調(diào)查穗數(shù)×4）；

然后計(jì)算綜合感病指數(shù)，綜合感病指數(shù)=1/2（葉感病指數(shù)+穗感病指數(shù)）。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明的利用根腐病菌粗毒素快速篩選小麥根腐病抗性品種的育種方法與常規(guī)育種方法相比，成功挖掘到根腐病菌粗毒素對小麥籽粒發(fā)育的超敏時(shí)期-受精卵第一次分裂期，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)小麥家系植株對根腐病菌粗毒素抗性與小麥家系受精卵第一次分裂期根腐病菌粗毒素耐性間具有良好的相關(guān)性。本發(fā)明進(jìn)一步通過優(yōu)選適宜濃度的根腐病菌粗毒素處理抽穗期受精卵第一次分裂期的雜交種植株小花，從而特異性篩選到高抗根腐病的小麥育種家系，從源頭上大大減少了篩選工作量，從而大大提高了根腐病抗性鑒定的工作效率和準(zhǔn)確度，具有較大的育種應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

附圖1為本發(fā)明的利用根腐病菌粗毒素快速篩選小麥根腐病抗性品種的育種方法的技術(shù)路線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖1與實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

如圖1的技術(shù)路線圖所示：一種利用根腐病菌粗毒素快速篩選小麥根腐病抗性品種的育種方法，其特征在于：該育種方法的步驟如下：

（1）選取待改良小麥品種/系和小麥根腐病抗源，雜交獲得f1：

選擇農(nóng)藝性狀優(yōu)良、根腐病抗性待改良的小麥品種/系，具體是指產(chǎn)量高、米質(zhì)優(yōu)良、抗倒伏、根腐病抗性有待改良的小麥品種/系，選擇其作為雜交母本；小麥根腐病抗性鑒定試驗(yàn)中，發(fā)病盛期調(diào)查葉病情嚴(yán)重度2～3次，葉部病情嚴(yán)重度分5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)級別：

0級：旗葉無病或上部第二葉偶有小病斑，占葉面積≤5%；

l級：旗葉有個(gè)別小病斑，5%＜占葉面積≤15%；

2級：旗葉病斑較多，15%＜占葉面積≤45%；

3級：旗葉病斑很多，45%＜占葉面積≤75%，部分葉片枯死；

4級：全株病斑密集，病斑大而連片，占葉面積＞75%，葉片大部分枯死；

計(jì)算葉感病指數(shù)，葉感病指數(shù)=各級病葉數(shù)（0～4）×相應(yīng)級別的總和/（調(diào)查葉數(shù)×4）；

待鑒定小麥材料按穗收種，脫粒后調(diào)查黑胚粒率，穗部病情嚴(yán)重度按黑胚粒率分5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)級別：

0級：黑胚粒率≤2%；

l級：2%＜黑胚粒率≤10%；

2級：10%＜黑胚粒率≤25%；

3級：25%＜黑胚粒率≤45%；

4級：黑胚粒率＞45%；

計(jì)算穗感病指數(shù)，穗感病指數(shù)=各級病穗數(shù)（0～4）×相應(yīng)級別的總和/（調(diào)查穗數(shù)×4）；

然后計(jì)算綜合感病指數(shù)，綜合感病指數(shù)=1/2（葉感病指數(shù)+穗感病指數(shù)）；根腐病抗性鑒定試驗(yàn)中，綜合感病指數(shù)不高于抗病對照鄭麥9962感病指數(shù)的小麥品種/系確定為小麥根腐病抗源，選擇其作為雜交父本，大田種植父母本，抽穗后雜交獲得f1；

（2）f1回交獲得bcf1：

將上步收獲的f1雜交種和母本大田種植，抽穗后回交獲得bcf1雜交種；

（3）分期播種父母本和bcf1：

大田正季種植雜交父本、母本和bcf1雜交種，分期播種，父母本提前播種，使父母本的抽穗期比bcf1雜交種早15～25天；

（4）梯度濃度的根腐病菌粗毒素處理父母本，選定根腐病抗性篩選壓：

制備根腐病菌粗毒素，具體制備方法為：將小麥根腐病菌活化后轉(zhuǎn)接于pda培養(yǎng)基，28℃下暗培養(yǎng)7d，然后取菌落邊緣菌絲按照30cm²菌絲/l液體培養(yǎng)基的比例接種菌絲到改良fries液體培養(yǎng)基中，置于搖床中70r/min、28℃暗培養(yǎng)21d，待菌絲長成菌球后，用紗布過濾，濾出菌絲和菌球，然后將濾液3000r/min離心30m，棄沉淀，得毒素上清液；分別將上清液與等體積的乙酸乙酯、乙醇混合，萃取分層后，移出有機(jī)相，繼續(xù)對水相進(jìn)行萃取，連續(xù)萃取2次，將有機(jī)相和水相萃取液在38℃條件下減壓蒸餾，殘?jiān)脽o菌水溶解，定容至毒素上清液的1/100，即為根腐病菌粗毒素原液；

父母本抽穗后，采用梯度濃度的根腐病菌粗毒素分別處理父本和母本抽穗期植株的小花，具體操作流程為：前天下午挖取小麥抽穗期植株，于當(dāng)天晚上剪掉已經(jīng)開花的小花，第2天下午開花后再剪掉未開花的幼嫩的小花，只留取當(dāng)天開花的小穗用于根腐病菌粗毒素浸泡處理，浸泡處理時(shí)間為挖取植株的第2天晚上18點(diǎn)到第3天早上8點(diǎn)，浸泡結(jié)束后將麥穗用流水沖洗10min；

處理完成后將植株回栽到大田，待小麥籽粒進(jìn)入“多半仁”期時(shí)即統(tǒng)計(jì)籽粒結(jié)實(shí)率，由于父本的根腐病抗性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于母本，因此父本自交受精卵對根腐病菌粗毒素的耐性要高于母本自交受精卵，選擇母本小麥籽粒結(jié)實(shí)率為0且20%＜父本小麥籽粒結(jié)實(shí)率＜50%的濃度的根腐病菌粗毒素作為根腐病抗性篩選壓；

（5）根腐病抗性篩選壓處理bcf1，獲得bcf2：

采用根腐病抗性篩選壓處理抽穗期bcf1雜交種小麥植株小花，處理完成后將植株回栽到大田，結(jié)實(shí)后收種，獲得bcf2；

（6）取bcf2進(jìn)行花藥培養(yǎng)獲得花培家系，根腐病抗性、農(nóng)藝性狀篩選獲得根腐病抗性小麥新品系：

bcf2大田種植，正季農(nóng)藝性狀篩選淘汰部分bcf2（如株高不適、分蘗力差、抽穗期過遲），抽穗后取花藥進(jìn)行培養(yǎng)獲得花培家系，花培家系大田種植，以待改良小麥品種/系和小麥根腐病抗源親本為對照，根腐病抗性鑒定各家系綜合感病指數(shù)、農(nóng)藝性狀篩選獲得農(nóng)藝性狀良好且根腐病抗性得到改良的根腐病抗性小麥新品系。

實(shí)施例1

2009～2010年，在江蘇省東辛農(nóng)場試驗(yàn)田分別了采用鄭麥9962（大田表現(xiàn)高抗小麥根腐病）、西農(nóng)919（大田表現(xiàn)中感小麥根腐?。⒅茺?8（大田表現(xiàn)高感小麥根腐?。┻M(jìn)行根腐病菌粗毒素處理小麥不同花藥發(fā)育時(shí)期的試驗(yàn)。2009年秋季播種，2010年正季設(shè)置了梯度濃度的根腐病菌粗毒素分別處理5個(gè)小麥不同花藥發(fā)育時(shí)期進(jìn)行試驗(yàn)，分別為未受精花粉期、受精卵第一次分裂期、受精后5天籽粒胚發(fā)育期、受精后15天籽?！岸喟肴省逼?、受精后25天籽粒灌漿期。由于不同時(shí)期對根腐病菌粗毒素的敏感度不同，因此鄭麥9962、西農(nóng)919、周麥18小麥不同花藥發(fā)育時(shí)期試驗(yàn)均設(shè)置了系列梯度濃度根腐病菌粗毒素進(jìn)行試驗(yàn)。

提前制備根腐病菌粗毒素，具體制備方法為：將小麥根腐病菌活化后轉(zhuǎn)接于pda培養(yǎng)基，28℃下暗培養(yǎng)7d，然后取菌落邊緣菌絲按照30cm²菌絲/l液體培養(yǎng)基的比例接種菌絲到改良fries液體培養(yǎng)基中，置于搖床中70r/min、28℃暗培養(yǎng)21d，待菌絲長成菌球后，用紗布過濾，濾出菌絲和菌球，然后將濾液3000r/min離心30m，棄沉淀，得毒素上清液；分別將上清液與等體積的乙酸乙酯、乙醇混合，萃取分層后，移出有機(jī)相，繼續(xù)對水相進(jìn)行萃取，連續(xù)萃取2次，將有機(jī)相和水相萃取液在38℃條件下減壓蒸餾，殘?jiān)脽o菌水溶解，定容至毒素上清液的1/100，即為根腐病菌粗毒素原液，置冰箱備用。

根腐病菌粗毒素處理未受精花粉具體操作流程為：下午挖取小麥抽穗期植株，當(dāng)天剪掉已經(jīng)開花的小花用于根腐病菌粗毒素浸泡處理，設(shè)置梯度濃度的根腐病菌粗毒素進(jìn)行花藥浸泡處理，浸泡處理時(shí)間為晚上18點(diǎn)到第2天早上8點(diǎn)，浸泡結(jié)束后將麥穗用流水沖洗10min；

根腐病菌粗毒素處理受精卵第一次分裂期花藥的具體操作流程為：前天下午挖取小麥抽穗期植株，于當(dāng)天晚上剪掉已經(jīng)開花的小花，第二天下午開花后再剪掉未開花的幼嫩的小花，只留取當(dāng)天開花的小穗用于根腐病菌粗毒素浸泡處理，浸泡處理時(shí)間為挖取植株的第2天晚上18點(diǎn)到第3天早上8點(diǎn)，浸泡結(jié)束后將麥穗用流水沖洗10min；

根腐病菌粗毒素處理受精后5天籽粒胚發(fā)育期花藥的具體操作流程為：前天下午挖取小麥抽穗期植株，于當(dāng)天晚上剪掉已經(jīng)開花的小花，第2天下午開花后再剪掉未開花的幼嫩的小花，回栽到大田，第6天挖取回來進(jìn)行根腐病菌粗毒素浸泡處理，浸泡處理時(shí)間為晚上18點(diǎn)到第2天早上8點(diǎn)，浸泡結(jié)束后將麥穗用流水沖洗10min；

根腐病菌粗毒素處理受精后15天籽?！岸喟肴省逼诨ㄋ幍木唧w操作流程為：前天下午挖取小麥抽穗期植株，于當(dāng)天晚上剪掉已經(jīng)開花的小花，第2天下午開花后再剪掉未開花的幼嫩的小花，回栽到大田，第16天挖取回來進(jìn)行根腐病菌粗毒素浸泡處理，浸泡處理時(shí)間為晚上18點(diǎn)到第2天早上8點(diǎn)，浸泡結(jié)束后將麥穗用流水沖洗10min；

根腐病菌粗毒素處理受精后25天籽粒灌漿期花藥的具體操作流程為：前天下午挖取小麥抽穗期植株，于當(dāng)天晚上剪掉已經(jīng)開花的小花，第2天下午開花后再剪掉未開花的幼嫩的小花，回栽到大田，第26天挖取回來進(jìn)行根腐病菌粗毒素浸泡處理，浸泡處理時(shí)間為晚上18點(diǎn)到第2天早上8點(diǎn)，浸泡結(jié)束后將麥穗用流水沖洗10min。

小麥結(jié)實(shí)后統(tǒng)計(jì)梯度濃度根腐病菌粗毒素處理的5個(gè)小麥不同花藥發(fā)育時(shí)期試驗(yàn)的鄭麥9962、西農(nóng)919和周麥18的籽粒結(jié)實(shí)率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下表1～表5。

由上表1中根腐病菌粗毒素處理高抗、中感、高感根腐病代表品種鄭麥9962、西農(nóng)919和周麥18未受精花粉后統(tǒng)計(jì)所處理小麥的籽粒結(jié)實(shí)率可以發(fā)現(xiàn)，高抗、中感、高感根腐病代表品種鄭麥9962、西農(nóng)919和周麥18對根腐病菌粗毒素的敏感度出現(xiàn)明顯的差異，但是浸泡的處理方式會嚴(yán)重降低小麥的籽粒結(jié)實(shí)率，因此小麥未受精花粉時(shí)期不宜采用根腐病菌粗毒素處理。

由表2到表5的對比可以發(fā)現(xiàn)，受精卵第一次分裂期、受精后5天籽粒胚發(fā)育期、受精后15天籽粒“多半仁”期和受精后25天籽粒灌漿期小麥籽粒結(jié)實(shí)率對根腐病菌粗毒素浸泡處理的敏感度迅速降低，而且高抗、中感、高感根腐病代表品種鄭麥9962、西農(nóng)919和周麥18之間根腐病菌粗毒素處理后相同水平的籽粒結(jié)實(shí)率表現(xiàn)所對應(yīng)的根腐病菌粗毒素濃度差逐漸縮小，這反映出選擇受精卵第一次分裂期小麥花藥采用根腐病菌粗毒素處理既能最大程度的節(jié)約根腐病菌粗毒素，又是區(qū)分小麥品種間對根腐病抗感性差異的最佳時(shí)期。

實(shí)施例2

2010～2011年，利用征集的研究報(bào)道過的小麥根腐病高抗材料和本單位多年田間調(diào)查篩選的高抗材料共計(jì)12份，同時(shí)選擇本單位篩選的大田表現(xiàn)中感、高感根腐病的小麥品種各4份，在江蘇省東辛農(nóng)場試驗(yàn)田進(jìn)行根腐病菌粗毒素處理試驗(yàn)，試驗(yàn)時(shí)期選為小麥?zhǔn)芫训谝淮畏至哑?。鑒于2009～2010年在小麥不同花藥發(fā)育時(shí)期進(jìn)行根腐病菌粗毒素處理試驗(yàn)中，10%稀釋比例的粗毒素原液濃度對小麥品種間根腐病抗感性差異分化顯著，因此優(yōu)選10%稀釋比例濃度的粗毒素進(jìn)行試驗(yàn)。

同期進(jìn)行大田病圃抗性鑒定試驗(yàn)，土質(zhì)為壤土，肥力中等，耕地前每畝施用小麥復(fù)合肥（n：p：k=15：15：10）40kg，將地塊分成面積為1.5m²（1.5m×1m）的小區(qū)。每個(gè)小區(qū)間隔0.8m，將用小米培養(yǎng)基擴(kuò)繁的病原菌接種物均勻地撒在麥溝里，每個(gè)小區(qū)15g，然后播種供試小麥品種。每個(gè)小區(qū)播種1個(gè)品種，種植5行，各品種重復(fù)3次。田間管理按照普通麥田管理辦法，期間不再追施肥料，在小麥蠟熟期調(diào)查各品種發(fā)病情況，計(jì)算綜合感病指數(shù)。

綜合感病指數(shù)的獲取方法為：小麥根腐病抗性鑒定試驗(yàn)中，發(fā)病盛期調(diào)查葉病情嚴(yán)重度2～3次，葉部病情嚴(yán)重度分5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)級別：

0級：旗葉無病或上部第二葉偶有小病斑，占葉面積≤5%；

l級：旗葉有個(gè)別小病斑，5%＜占葉面積≤15%；

2級：旗葉病斑較多，15%＜占葉面積≤45%；

3級：旗葉病斑很多，45%＜占葉面積≤75%，部分葉片枯死；

4級：全株病斑密集，病斑大而連片，占葉面積＞75%，葉片大部分枯死；

計(jì)算葉感病指數(shù)，葉感病指數(shù)=各級病葉數(shù)（0～4）×相應(yīng)級別的總和/（調(diào)查葉數(shù)×4）；

待鑒定小麥材料按穗收種，脫粒后調(diào)查黑胚粒率，穗部病情嚴(yán)重度按黑胚粒率分5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)級別：

0級：黑胚粒率≤2%；

l級：2%＜黑胚粒率≤10%；

2級：10%＜黑胚粒率≤25%；

3級：25%＜黑胚粒率≤45%；

4級：黑胚粒率＞45%；

計(jì)算穗感病指數(shù)，穗感病指數(shù)=各級病穗數(shù)（0～4）×相應(yīng)級別的總和/（調(diào)查穗數(shù)×4）；

然后計(jì)算綜合感病指數(shù)，綜合感病指數(shù)=1/2（葉感病指數(shù)+穗感病指數(shù)），20個(gè)品種的試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表6。

由表6的10%稀釋倍數(shù)的根腐病菌粗毒素處理20個(gè)小麥品種的受精卵第一次分裂期

花藥對籽粒結(jié)實(shí)率的影響與其大田根腐病抗性表現(xiàn)的比較可以發(fā)現(xiàn)，通過綜合感病指數(shù)調(diào)查得到的小麥根腐病大田抗性表現(xiàn)差異與根腐病菌粗毒素處理不同品種花藥受精卵第一次分裂期后籽粒結(jié)實(shí)率測定值的差異呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，大田表現(xiàn)高抗小麥根腐病的品種根腐病粗毒素處理后小麥籽粒結(jié)實(shí)率普遍較高，而較感根腐病的小麥品種花藥受精卵第一次分裂期根腐病菌粗毒素處理后籽粒結(jié)實(shí)率極低，而且對應(yīng)關(guān)系很好，這反映出采用粗毒素處理小麥花藥受精卵第一次分裂期對小麥品種間根腐病抗感性差異分化顯著，粗毒素處理小麥花藥受精卵第一次分裂期是鑒別小麥根腐病品種間抗性差異的良好方法。

實(shí)施例3

2011年到2016年，采用本發(fā)明的技術(shù)路線，優(yōu)選了望水白作為雜交父本，成功改良了育種主干親本w0962的根腐病抗性，培育出3個(gè)根腐病抗性小麥新品系。

（1）分別篩選w0962和望水白作為雜交母本和父本：

w0962是本單位多年沿用的小麥育種主干親本，具有產(chǎn)量高、米質(zhì)優(yōu)良、早熟等多種優(yōu)點(diǎn)，屬弱春性中早熟品系，苗期長勢一般，分蘗集中，抗寒性好，分蘗成穗率較高，畝成穗較多；春季返青拔節(jié)快，長相清秀，旗葉較寬上舉，株型適中，穗較大，抗寒、落黃好，籽粒半角質(zhì)，較飽滿，粒重較高。莖稈有韌性，輕度倒伏對灌漿影響不大；產(chǎn)量三要素協(xié)調(diào)，豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)性好。然而w0962根腐病抗性較差，2011年與實(shí)施例2同期進(jìn)行了10%稀釋倍數(shù)的根腐病菌粗毒素處理w0962受精卵第一次分裂期花藥測的籽粒結(jié)實(shí)率為5.8%，而大田根腐病抗性表現(xiàn)測定得綜合抗病指數(shù)為61.9，高感小麥根腐病。望水白是源于江蘇溧陽的地方品種，是公認(rèn)的小麥根腐病高抗品種，2010～2011年，利用征集的小麥根腐病高抗材料在江蘇省東辛農(nóng)場試驗(yàn)田進(jìn)行根腐病菌粗毒素處理試驗(yàn)，無論是根腐病菌粗毒素處理受精卵第一次分裂期花藥的籽粒結(jié)實(shí)率表現(xiàn)還是大田根腐病抗性試驗(yàn)測量綜合感病指數(shù)，望水白的小麥根腐病抗性表現(xiàn)均最優(yōu)，因此優(yōu)選望水白作為雜交父本，進(jìn)行w0962的根腐病抗性改良。2011年秋季大田播種w0962和望水白作為雜交母本和父本，2012年小麥抽穗后雜交配組獲得f1，2013年正季f1回交獲得bcf1。

（2）分期播種父母本和bcf1，梯度濃度的根腐病菌粗毒素處理父母本，選定根腐病抗性篩選壓：

2013年秋季大田播種雜交父本、母本和bcf1雜交種，分期播種，父母本提前播種，使父母本的抽穗期比bcf1雜交種早15～25天；2014年正季采用5%、10%、15%、20%、25%、30%稀釋比例的根腐病菌粗毒素分別處理父本和母本抽穗期植株的小花，處理完成后將植株回栽到大田，待小麥籽粒進(jìn)入“多半仁”期時(shí)即統(tǒng)計(jì)籽粒結(jié)實(shí)率，得表7；

因此我們選擇20%稀釋倍數(shù)的根腐病菌粗毒素作為根腐病抗性篩選壓，然后采用根腐病抗性篩選壓處理晚抽穗的bcf1雜交種小麥植株小花，處理完成后將植株回栽到大田，結(jié)實(shí)后收種，獲得bcf2雜交種。

（3）取bcf2進(jìn)行花藥培養(yǎng)獲得花培家系，根腐病抗性、農(nóng)藝性狀篩選獲得根腐病抗性小麥新品系：

2014年秋季bcf2大田播種，2015年正季農(nóng)藝性狀篩選淘汰部分bcf2（如株高不適、分蘗力差、抽穗期過遲），優(yōu)選農(nóng)藝性狀優(yōu)良的bcf2小麥單核晚期花藥進(jìn)行花藥培養(yǎng)，2016年正季獲得花培家系88份，2016年秋季花培家系大田種植，以w0962和望水白為對照，獲得3個(gè)農(nóng)藝性狀良好且根腐病抗性得到改良的根腐病抗性小麥新品系，命名為w1735、w1736、w1737，進(jìn)入小麥品種預(yù)試試驗(yàn)。

本發(fā)明的利用根腐病菌粗毒素快速篩選小麥根腐病抗性品種的育種方法與常規(guī)育種方法相比，成功挖掘到根腐病菌粗毒素對小麥籽粒發(fā)育的超敏時(shí)期-受精卵第一次分裂期，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)小麥家系植株對根腐病菌粗毒素抗性與小麥家系受精卵第一次分裂期根腐病菌粗毒素耐性間具有良好的相關(guān)性。本發(fā)明進(jìn)一步通過優(yōu)選適宜濃度的根腐病菌粗毒素處理抽穗期受精卵第一次分裂期的雜交種植株小花，從而特異性篩選到高抗根腐病的小麥育種家系，從源頭上大大減少了篩選工作量，從而大大提高了根腐病抗性鑒定的工作效率和準(zhǔn)確度，具有較大的育種應(yīng)用價(jià)值。

以上實(shí)施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)思想，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡是按照本發(fā)明提出的技術(shù)思想，在技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的任何改動(dòng)，均落入本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)；本發(fā)明未涉及的技術(shù)均可通過現(xiàn)有技術(shù)加以實(shí)現(xiàn)。