本發(fā)明涉及牧草栽培領域，具體涉及一種白三葉的栽培方法。
背景技術：
白三葉(trifoliumrepens)是世界范圍內廣泛栽培的多年生豆科牧草，產草量高、品質好，各種家畜均喜采食，在草地中兼有提供優(yōu)質飼草和固定土壤氮素的雙重作用。此外，白三葉也是環(huán)境保護和生態(tài)建設中重要的水土保持和庭院綠化植物。但是，在生產中因干旱導致的減產或枯死現(xiàn)象日益突出。因此，在白三葉栽培中，急需探尋提高白三葉抗旱性的栽培措施與方法。
干旱脅迫是影響植物生長發(fā)育和產量的主要非生物逆境因子之一。因全球氣候變化，我國北方大多數(shù)地區(qū)的持續(xù)干旱形勢可能更加嚴峻，而南方的季節(jié)性和持續(xù)性干旱亦愈益凸現(xiàn)，導致我國農作物干旱受災面積逐年增加。
農業(yè)生產中，通過施用外源添加物提高作物抗旱性具有操作簡單、見效快等特點，在果樹、蔬菜、小麥等作物上已有大量報道。然而，目前有關外源添加提高植物抗逆性的研究報道絕大多數(shù)采用的是單一的添加物，而國內外通過外源添加提高白三葉抗旱性的相關研究少有報道，有效的添加組合尤其罕見。
因此，針對生產栽培中白三葉抗旱性差，對水分需求量大，干旱脅迫對白三葉生長及產量造成的損失極為嚴重，且當前缺乏能有效改善白三葉抗旱性且施用簡單的外源添加及其組合，急需探尋提高白三葉在干旱下的存活率和生長量的簡單有效手段，以期為生產中白三葉的抗旱栽培提供實用、有效的途徑和方法。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種能夠顯著提高白三葉抗旱性的白三葉的栽培方法。
本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案為：該白三葉的栽培方法，包括以下步驟：
a、選取白三葉種子，并對選取的白三葉種子進行消毒處理；
b、將經過消毒處理的白三葉種子撒入育苗盤中，并在育苗盤中加入去離子水；
c、將育苗盤放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-9天進行種子萌發(fā)，并每天更換育苗盤內的去離子水，所述培養(yǎng)箱內白天的溫度為21-25℃，培養(yǎng)箱內晚上的溫度為17-21℃，所述培養(yǎng)箱內的相對濕度為70-80％，培養(yǎng)箱內的光照強度為280-320μmol·m-2·s-1；
d、當種子萌發(fā)結束后，將育苗盤內的去離子水更換成霍格蘭氏營養(yǎng)液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)21-25天進行育苗處理，并每隔一天更換育苗盤內的霍格蘭氏營養(yǎng)液；
e、制備外源添加劑，所述外源添加劑包括溶劑和溶質，所述溶劑為霍格蘭氏營養(yǎng)液，所述溶質包括殼聚糖(cts)和精胺(spm)，所述cts的濃度為0.5g/l-1.5g/l，所述spm的濃度為50.58mg/l-151.74mg/l；
f、將制備的外源添加劑施加在白三葉幼苗的根部即可。
進一步的是，在步驟a中，所述消毒處理的過程如下所述：首先，采用0.1％氯化汞對白三葉種子進行連續(xù)消毒，所述連續(xù)消毒的時間為5分鐘，連續(xù)消毒后采用蒸餾水進行4次漂洗。
進一步的是，在步驟b中，所述育苗盤中鋪滿石英砂，育苗盤大小為長35cm、寬25cm、高10cm。
進一步的是，在步驟c中，育苗盤放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的時間為7天，所述培養(yǎng)箱內白天的溫度為23℃，培養(yǎng)箱內晚上的溫度為19℃，所述培養(yǎng)箱內的相對濕度為75％，培養(yǎng)箱內的光照強度為300μmol·m-2·s-1。
進一步的是，在步驟d中，進行育苗處理的時間為23天。
進一步的是，在步驟e中，所述cts的濃度為1g/l，所述spm的濃度為101.17mg/l。
本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明所述的白三葉的栽培方法通過對選取的白三葉種子進行消毒處理；然后將其撒入育苗盤中，并在育苗盤中加入去離子水；放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-9天進行種子萌發(fā)，當種子萌發(fā)結束后，將育苗盤內的去離子水更換成霍格蘭氏營養(yǎng)液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)21-25天進行育苗處理，育苗處理結束后，白三葉長出幼苗，然后在幼苗的根部施加外源添加劑，所述外源添加劑包括溶劑和溶質，所述溶劑為霍格蘭氏營養(yǎng)液，所述溶質包括殼聚糖(cts)和精胺(spm)，所述cts的濃度為0.5g/l-1.5g/l，所述spm的濃度為50.58mg/l-151.74mg/l；上述抗旱組合物形成的外源添加劑可以有效緩解干旱脅迫下白三葉生長受阻、葉片萎蔫，相對于單劑具有顯著的增效效應，可以顯著的提高白三葉的抗旱性。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
該白三葉的栽培方法，包括以下步驟：
a、選取白三葉種子，并對選取的白三葉種子進行消毒處理；
b、將經過消毒處理的白三葉種子撒入育苗盤中，并在育苗盤中加入去離子水；
c、將育苗盤放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-9天進行種子萌發(fā)，并每天更換育苗盤內的去離子水，所述培養(yǎng)箱內白天的溫度為21-25℃，培養(yǎng)箱內晚上的溫度為17-21℃，所述培養(yǎng)箱內的相對濕度為70-80％，培養(yǎng)箱內的光照強度為280-320μmol·m-2·s-1；
d、當種子萌發(fā)結束后，將育苗盤內的去離子水更換成霍格蘭氏營養(yǎng)液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)21-25天進行育苗處理，并每隔一天更換育苗盤內的霍格蘭氏營養(yǎng)液；
e、制備外源添加劑，所述外源添加劑包括溶劑和溶質，所述溶劑為霍格蘭氏營養(yǎng)液，所述溶質包括殼聚糖(cts)和精胺(spm)，所述cts的濃度為0.5g/l-1.5g/l，所述spm的濃度為50.58mg/l-151.74mg/l；
f、將制備的外源添加劑施加在白三葉幼苗的根部即可。
本發(fā)明所述的白三葉的栽培方法通過對選取的白三葉種子進行消毒處理；然后將其撒入育苗盤中，并在育苗盤中加入去離子水；放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-9天進行種子萌發(fā)，當種子萌發(fā)結束后，將育苗盤內的去離子水更換成霍格蘭氏營養(yǎng)液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)21-25天進行育苗處理，育苗處理結束后，白三葉長出幼苗，然后在幼苗的根部施加外源添加劑，所述外源添加劑包括溶劑和溶質，所述溶劑為霍格蘭氏營養(yǎng)液，所述溶質包括殼聚糖(cts)和精胺(spm)，所述cts的濃度為0.5g/l-1.5g/l，所述spm的濃度為50.58mg/l-151.74mg/l；上述抗旱組合物形成的外源添加劑可以有效緩解干旱脅迫下白三葉生長受阻、葉片萎蔫，相對于單劑具有顯著的增效效應，可以顯著的提高白三葉的抗旱性。
在上述實施方式中，為了保證白三葉種子的消毒處理效果，在步驟a中，所述消毒處理的過程如下所述：首先，采用0.1％氯化汞對白三葉種子進行連續(xù)消毒，所述連續(xù)消毒的時間為5分鐘，連續(xù)消毒后采用蒸餾水進行4次漂洗。
為了保證白三葉種子的發(fā)芽率，在步驟b中，所述育苗盤中鋪滿石英砂。同時，為了提高白三葉種子的發(fā)芽率，在步驟c中，育苗盤放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的時間為7天，所述培養(yǎng)箱內白天的溫度為23℃，培養(yǎng)箱內晚上的溫度為19℃，所述培養(yǎng)箱內的相對濕度為75％，培養(yǎng)箱內的光照強度為300μmol·m-2·s-1。
為了使白三葉幼苗長出健康完整的幼苗，在步驟d中，進行育苗處理的時間為23天。
為了使白三葉的抗旱性最大限度的提高，在步驟e中，所述cts的濃度為1g/l，所述spm的濃度為101.17mg/l。
對比試驗1
試驗材料：以干旱敏感型的‘拉丁諾’白三葉作為供試材料。
材料培育：種子經0.1％氯化汞消毒5分鐘，蒸餾水漂洗4次后備用。消毒后的種子0.1g均勻地撒在長35cm、寬25cm、高10cm鋪滿石英砂的育苗盤中，倒入去離子水并將育苗盤置于培養(yǎng)箱中(23/19℃，白天/黑夜；75％的相對濕度；300μmol·m-2·s-1的光照強度)讓種子進行為期7d的萌發(fā)，每天更換去離子水。待種子萌發(fā)完成后，倒出所有的去離子水更換為霍格蘭氏營養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔一天更換一次營養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)23天(2片成熟葉片)時選取長勢一致的材料用于試驗。
試驗設計：①cts濃度水平：設0g/l(對照)、0.50g/l、0.75g/l、1.00g/l、1.25g/l、1.50g/l、5個濃度梯度，共計6個處理，每處理4次重復。
外源添加及干旱脅迫處理：用培育材料的霍格蘭氏營養(yǎng)液作為溶劑分別配制上述不同濃度的cts溶液，并加入20％(w/v)聚乙二醇6000(peg-6000)滲透劑模擬干旱脅迫，現(xiàn)配現(xiàn)用。在霍格蘭氏營養(yǎng)液中加入相應濃度的cts預處理6天后，更換為含有20％(w/v)peg-6000的處理液(含相應濃度的cts)進行干旱脅迫處理。處理期間，每天更換一次處理液，每次300ml。所有材料置于智能光照培養(yǎng)箱中，條件同材料培育。從更換為含有20％(w/v)peg-6000的處理液時開始計時，調查白三葉葉片在中度脅迫(7天)和重度脅迫(14天)的萎蔫程度。所述萎蔫程度采用1、2、3、4、5、6、7、8、9表示，其中1表示萎蔫程度最輕，9表示萎蔫程度較重，結果見表1。
表1不同cts濃度根施預處理提高白三葉抗旱性效應
由表1可以看出，根施cts1.0g/l時，提高白三葉抗旱性的效果較好，與對照相比，在同等滲透脅迫強度下可延遲白三葉葉片萎蔫。
對比試驗2
試驗材料：以干旱敏感型的‘拉丁諾’白三葉作為供試材料。
材料培育：種子經0.1％氯化汞消毒5分鐘，蒸餾水漂洗4次后備用。消毒后的種子0.1g均勻地撒在長35cm、寬25cm、高10cm鋪滿石英砂的育苗盤中，倒入去離子水并將育苗盤置于培養(yǎng)箱中(23/19℃，白天/黑夜；75％的相對濕度；300μmol·m-2·s-1的光照強度)讓種子進行為期7d的萌發(fā)，每天更換去離子水。待種子萌發(fā)完成后，倒出所有的去離子水更換為霍格蘭氏營養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔一天更換一次營養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)23天(2片成熟葉片)時選取長勢一致的材料用于試驗。
試驗設計：①spm濃度水平：設0mg/l(對照)、20.23mg/l、50.58mg/l、101.17mg/l、151.74mg/l、202.34mg/l，5個濃度梯度，共計6個處理，每處理4次重復。
外源添加及干旱脅迫處理：用培育材料的霍格蘭氏營養(yǎng)液作為溶劑分別配制上述不同濃度的spm溶液，并加入20％(w/v)聚乙二醇6000(peg-6000)滲透劑模擬干旱脅迫，現(xiàn)配現(xiàn)用。在霍格蘭氏營養(yǎng)液中加入相應濃度的spm預處理6天后，更換為含有20％(w/v)peg-6000的處理液(含相應濃度的spm)進行干旱脅迫處理。處理期間，每天更換一次處理液，每次300ml。所有材料置于智能光照培養(yǎng)箱中，條件同材料培育。從更換為含有20％(w/v)peg-6000的處理液時開始計時，調查白三葉葉片在中度脅迫(7天)和重度脅迫(14天)的萎蔫程度。所述萎蔫程度采用1、2、3、4、5、6、7、8、9表示，其中1表示萎蔫程度最輕，9表示萎蔫程度較重，結果見表2。
表2不同spm濃度根施預處理提高白三葉抗旱性效應
由表2可以看出，根施spm101.17mg/l時，提高白三葉抗旱性的效果較好，與對照相比，在同等滲透脅迫強度下可延遲白三葉葉片萎蔫。
實施例
試驗材料：以干旱敏感型的‘拉丁諾’白三葉作為供試材料。
材料培育：種子經0.1％氯化汞消毒5分鐘，蒸餾水漂洗4次后備用。消毒后的種子0.1g均勻地撒在長35cm、寬25cm、高10cm鋪滿石英砂的育苗盤中，倒入去離子水并將育苗盤置于培養(yǎng)箱中(23/19℃，白天/黑夜；75％的相對濕度；300μmol·m-2·s-1的光照強度)讓種子進行為期7d的萌發(fā)，每天更換去離子水。待種子萌發(fā)完成后，倒出所有的去離子水更換為霍格蘭氏營養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔一天更換一次營養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)23天(2片成熟葉片)時選取長勢一致的材料用于試驗。
試驗設計：cts設5個濃度梯度，包括0.50g/l、0.75g/l、1.00g/l、1.25g/l和1.50g/l；spm設3個濃度梯度，50.58mg/l、101.17mg/l和151.74mg/l，兩兩組合共15個處理組，每個處理組重復4次。
外源添加及干旱脅迫處理：用培育材料的霍格蘭氏營養(yǎng)液作為溶劑分別配制上述不同濃度的處理組溶液，并加入20％(w/v)聚乙二醇6000(peg-6000)滲透劑模擬干旱脅迫，現(xiàn)配現(xiàn)用。在霍格蘭氏營養(yǎng)液中加入相應濃度的處理組預處理6天后，更換為含有20％(w/v)peg-6000的處理液(含相應濃度的處理組)進行干旱脅迫處理。處理期間，每天更換一次處理液，每次300ml。所有材料置于智能光照培養(yǎng)箱中，條件同材料培育。從更換為含有20％(w/v)peg-6000的處理液時開始計時，調查白三葉葉片在中度脅迫(7天)和重度脅迫(14天)的萎蔫程度。所述萎蔫程度采用1、2、3、4、5、6、7、8、9表示，其中1表示萎蔫程度最輕，9表示萎蔫程度較重，結果見表3。
表3外源cts與spm不同濃度組合處理提高白三葉抗旱性效應
由表3可以看出，與對照(未經預處理)相比，不同濃度cts與spm組合處理都能在一定程度上延遲干旱脅迫下白三葉葉片萎蔫。其中，效果最好的組合是1g/lcts+101.17mg/lspm，可有效減輕白三葉萎蔫程度，其它效果較好的組合還包括1g/lcts+50.58mg/lspm，1g/lcts+151.74mg/lspm，1.25g/lcts+101.17mg/lspm，1.5g/lcts+101.17mg/lspm由此可見，cts與spm組合處理的最適濃度范圍分別為1-1.5g/l與50.58-101.17mg/l。并且，結合對比試驗1和對比試驗2的試驗數(shù)據(jù)可知，濃度范圍分別為1-1.5g/l與50.58-101.17mg/l的cts與spm組合的抗旱效果顯著優(yōu)于單劑最優(yōu)施用濃度(cts1g/l、spm101.17mg/l)的效果。結果表明，本發(fā)明提供的cts與spm組合在濃度范圍分別為1-1.5g/l與50.58-101.17mg/l時具有顯著的增效效應，可以顯著的提高白三葉的抗旱性。
驗證試驗1：外源cts與spm最佳濃度組合，即1g/lcts+101.17mg/lspm，對正常條件下白三葉生理指標的影響
試驗材料：以干旱敏感型的‘拉丁諾’白三葉作為供試材料。
材料培育：種子經0.1％氯化汞消毒5分鐘，蒸餾水漂洗4次后備用。消毒后的種子0.1g均勻地撒在長35cm、寬25cm、高10cm鋪滿石英砂的育苗盤中，倒入去離子水并將育苗盤置于培養(yǎng)箱中(23/19℃，白天/黑夜；75％的相對濕度；300μmol·m-2·s-1的光照強度)讓種子進行為期7d的萌發(fā)，每天更換去離子水。待種子萌發(fā)完成后，倒出所有的去離子水更換為霍格蘭氏營養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔一天更換一次營養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)23天(2片成熟葉片)時選取長勢一致的材料用于試驗。
試驗設計：試驗共設4個處理：單一根施cts、spm，以及cts與spm組合，以霍格蘭營養(yǎng)液為對照處理(control)。用霍格蘭營養(yǎng)液溶劑分別配制1g/lcts、101.17mg/lspm以及1g/lcts+101.17mg/lspm混合溶液各300ml進行根施，現(xiàn)配現(xiàn)用，每處理4次重復。
觀測指標：處理6天后取樣測定如下指標，反映白三葉體內多胺情況的多胺含量以及s腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)活性；反映白三葉體內激素水平的脫落酸、細胞分裂素、赤霉素和生長素含量；抗氧化酶基因表達水平：鐵超氧化物歧化酶(fesod)、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶(gpox)、抗壞血酸過氧化物酶(apx)、單脫氫抗壞血酸還原酶(mdhar)、谷胱甘肽還原酶(gr)、谷胱甘肽s-轉移酶(gst)；以及與生長和抗旱相關的次生代謝物類黃酮和總酚含量。結果見表4。
表4外源cts與spm組合處理對白三葉生理指標的影響
注：同行數(shù)據(jù)上標字母相同者表示差異不顯著(p＞0.05)，同行數(shù)據(jù)上標字母不相同者表示差異顯著(p＜0.05)。
從表4可以看出，不同處理的生理指標證明了在正常條件下1g/lcts或101.17mg/lspm單一處理能有效促進白三葉生長，且1g/lcts和101.17mg/lspm組合處理比單一處理效果更為突出。
驗證試驗2：外源cts與spm最佳濃度組合對干旱脅迫下白三葉生理指標的影響
試驗材料：以干旱敏感型的‘拉丁諾’白三葉作為供試材料。
材料培育：種子經0.1％氯化汞消毒5分鐘，蒸餾水漂洗4次后備用。消毒后的種子0.1g均勻地撒在長35cm、寬25cm、高10cm鋪滿石英砂的育苗盤中，倒入去離子水并將育苗盤置于培養(yǎng)箱中(23/19℃，白天/黑夜；75％的相對濕度；300μmol·m-2·s-1的光照強度)讓種子進行為期7d的萌發(fā)，每天更換去離子水。待種子萌發(fā)完成后，倒出所有的去離子水更換為霍格蘭氏營養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔一天更換一次營養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)23天(2片成熟葉片)時選取長勢一致的材料用于試驗。
試驗設計：試驗共設5個處理：單一根施1g/lcts、101.17mg/lspm，以及1g/lcts+101.17mg/lspm，以霍格蘭營養(yǎng)液(control)和直接peg滲透脅迫為對照。
外源添加及干旱脅迫處理：用培育材料的營養(yǎng)液(hoagland全營養(yǎng)液)作為溶劑分別配制上述相應濃度的cts、spm、cts+spm溶液，預處理6天后，更換為含有20％(w/v)peg-6000的處理液(含相應濃度的cts及spm)進行干旱脅迫處理。處理期間，每天更換一次處理液，每次300ml。所有材料置于智能光照培養(yǎng)箱中，條件同材料培育。從更換為含有20％(w/v)peg-6000的處理液時開始計時，調查白三葉葉片在中度脅迫(7天)和重度脅迫(14天)的相關生理指標，每處理4次重復。
觀測指標如下：反映白三葉生長及水分狀況的相對含水量相對生長速率；反映白三葉體內多胺代謝情況的多胺含量以及s腺苷甲硫氨酸合成酶(sams)、精氨酸脫羧酶(adc)、多胺氧化酶(pao)和二胺氧化酶(dao)活性；反映白三葉體內激素水平的脫落酸、細胞分裂素、赤霉素和生長素含量；抗氧化酶基因表達水平：鐵超氧化物歧化酶(fesod)、錳超氧化物歧化酶(mnsod)、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶(gpox)、抗壞血酸過氧化物酶(apx)、單脫氫抗壞血酸還原酶(mdhar)、脫氫抗壞血酸還原酶(dhar)、谷胱甘肽還原酶(gr)、谷胱甘肽過氧化物酶(gpx)、谷胱甘肽s-轉移酶(gst)；與生長和抗旱相關的次生代謝物類黃酮和總酚含量。以及活性氧和膜穩(wěn)定性相關指標超氧陰離子、過氧化氫、丙二醛含量、相對電導率。結果見表5、6。
表5外源cts與spm組合處理對白三葉抗旱生理指標的影響(7天)
注：同行數(shù)據(jù)上標字母相同者表示差異不顯著(p＞0.05)，同行數(shù)據(jù)上標字母不相同者表示差異顯著(p＜0.05)。
表6外源cts與spm組合處理對白三葉抗旱生理指標的影響(14天)
注：同行數(shù)據(jù)上標字母相同者表示差異不顯著(p＞0.05)，同行數(shù)據(jù)上標字母不相同者表示差異顯著(p＜0.05)。
從表5和6可以看出，不同處理的生理指標證明了1g/lcts或101.17mg/lspm單一處理能有效提高白三葉抗旱性，且1g/lcts和101.17mg/lspm組合處理比單一處理效果更能有效緩解干旱脅迫。
驗證試驗3：外源添加劑施用時間對施用效果的影響
試驗材料：以干旱敏感型的‘拉丁諾’白三葉作為供試材料。
材料培育：種子經0.1％氯化汞消毒5分鐘，蒸餾水漂洗4次后備用。消毒后的種子0.1g均勻地撒在長35cm、寬25cm、高10cm鋪滿石英砂的育苗盤中，倒入去離子水并將育苗盤置于培養(yǎng)箱中(23/19℃，白天/黑夜；75％的相對濕度；300μmol·m-2·s-1的光照強度)讓種子進行為期7d的萌發(fā)，每天更換去離子水。待種子萌發(fā)完成后，倒出所有的去離子水更換為霍格蘭氏營養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔一天更換一次營養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)23天(2片成熟葉片)時選取長勢一致的材料用于試驗。
試驗設計及處理：設上午8:00、上午10:00、下午15:00、傍晚18:00，共計4個時間根施處理(1g/lcts+101.17mg/lspm)，每處理4次重復。
外源添加及干旱脅迫處理：同實例1，結果見表7。
表7外源cts與spm組合處理不同施用時間提高白三葉抗旱性效應
由表7可知，不同根施時間對cts與spm組合提高白三葉抗旱性效應無明顯影響。
以上所述的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行描述，并非對本發(fā)明的范圍進行限定。任何熟悉本領域的技術人員，在不脫離本發(fā)明的精神實質和技術方案的情況下，都可以利用上述的方法和技術內容對本發(fā)明技術方案做出許多可能的變動和修飾。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術方案的內容，依據(jù)本發(fā)明的技術實質對以上實施例所做的變動和修飾，均屬于本發(fā)明技術方案保護的范圍內。