一種培育無刺黑果枸杞的方法與流程

本發(fā)明屬于一種植物培育方法，具體涉及一種黑果枸杞無刺植株的培育。
背景技術(shù)：
：黑果枸杞(lyciumruthenicummurr.)為茄科枸杞屬多年生多棘刺灌木。植物棘刺分為莖刺(枝刺)、葉刺、皮刺、刺齒等。黑果枸杞棘刺為莖刺。它由腋芽變態(tài)發(fā)育而成，為枝的變態(tài)。莖刺也稱為枝刺，它與莖的維管束相連，堅硬不易折斷和剝離。野生黑果枸杞常以灌叢狀生于鹽堿荒地、鹽化沙地、鹽湖岸邊、路旁等各種鹽漬化土壤或荒漠環(huán)境，具有防風固沙和改善土質(zhì)的作用。并且黑果枸杞果實保健價值和價格遠超普通紅果枸杞。黑果枸杞是用于治理和開發(fā)利用沙化土地及鹽堿地的優(yōu)良生態(tài)經(jīng)濟型樹種。因此，荒漠和沙化土地營造黑果枸杞經(jīng)濟防護林具有重要的社會、經(jīng)濟和生態(tài)意義。但是黑果枸杞堅硬且牢固的莖刺不但增加造林和日常管理(尤其是采果)難度，而且降低了人工林的經(jīng)濟效益。莖刺表型是采果類經(jīng)濟樹種的重要性狀之一。參照無刺沙棘的生產(chǎn)表現(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)同等條件下的無刺類型無疑更宜作經(jīng)濟型林木栽培。綜上，培育優(yōu)良無刺黑果枸杞是一個很值得研究的課題。我們前期研究已經(jīng)建立了以黑果枸杞葉片和莖段為外植體的高效離體再生體系，并且相關(guān)研究已經(jīng)申請國家發(fā)明專利(201610206401.1)。借鑒上述專利的方法，以有刺黑果枸杞為最初材料供體，通過離體快速繁殖獲得無性系。進而通過盆栽控水處理聯(lián)合澆灌營養(yǎng)液的方法獲得了無棘刺的黑果枸杞無性系，本方法的無刺黑果枸杞得率高達100％。本方法為培育黑果枸杞無刺品種、調(diào)控黑果枸杞株型和產(chǎn)量打下基礎(chǔ)，為培育其它木本植物的無刺類型提供借鑒。此外，本研究可以豐富植物抗旱理論、植物表型可塑性理論、填補國內(nèi)外莖刺相關(guān)研究的空缺，并為最終闡明黑果枸杞莖刺發(fā)育機理奠定基礎(chǔ)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了搞清黑果枸杞的莖刺發(fā)育機理，提供了一種培育無刺黑果枸杞的方法，進而為培育黑果枸杞無刺品種奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：(1)無性系組培苗的獲得以有刺黑果枸杞的莖或成熟種子為原始供體材料，采用莖或葉為外植體培養(yǎng)獲得無菌組培苗；(2)壯苗培養(yǎng)將上步獲得的組培苗接種于改良的1/4或1/2ms固體培養(yǎng)基，置于自然日光下進行壯苗培養(yǎng)；上述改良1/4ms固體培養(yǎng)基，是除了kh2po4和kno3的含量與ms培養(yǎng)基一樣，其它大量元素、微量元素、鐵鹽及有機物質(zhì)含量均為ms培養(yǎng)基1/4的一種培養(yǎng)基；而改良的1/2ms固體培養(yǎng)基是除了kh2po4和kno3的含量與ms培養(yǎng)基一樣，其它大量元素、微量元素、鐵鹽及有機物質(zhì)含量均為ms培養(yǎng)基1/2的一種培養(yǎng)基；改良的1/4和1/2ms固體培養(yǎng)基的蔗糖濃度為15～20g/l,瓊脂濃度為4.3～7.0g/l,ph值為5.4～5.8；(3)煉苗及移栽生根完整小植株在壯苗培養(yǎng)之后進行移栽馴化；移栽介質(zhì)采用菜園土、腐殖土、沙子、草炭其一或其兩種以上混合物；移栽介質(zhì)121℃高壓滅菌30min～2h；將壯苗之后的帶根植株沖洗干凈，并迅速置于多菌靈或甲基托布津工作液中浸泡5～10min；之后將苗栽植于盆缽中的移栽介質(zhì)中，澆透蒸餾水之后覆蓋帶孔塑料膜或帶孔保鮮膜保濕。剛移栽的組培苗要置于散射光下，避免日光直射；定期澆蒸餾水使栽培介質(zhì)的含水量保持在100％田間持水量，從移栽第5～10天開始逐漸揭去保鮮膜或塑料膜；待植株明顯開始生長之時再逐漸挪到自然日光下；整個過程的盆土含水量均要保持在80％～100％田間持水量，環(huán)境溫度保持在18～28℃；(4)盆栽控水處理及澆灌營養(yǎng)液對移栽馴化成活的健康盆栽組培苗進行控水處理并定期澆灌1/8改進的ms營養(yǎng)液或1/4改進的ms營養(yǎng)液：每日澆水，使土壤含水量保持在75％～100％田間持水量；間隔10～30天澆灌一次營養(yǎng)液，澆灌營養(yǎng)液的同時要保證土壤含水量與原先設(shè)置的相同，即75％～100％田間持水量；盆苗置于日光下，環(huán)境溫度保持在18～28℃。此步提到的改進的ms營養(yǎng)液不含蔗糖和瓊脂；其大量元素及鐵鹽含量與ms培養(yǎng)基相同；不含硫酸銅和氯化鈷,但其它微量元素的含量為ms培養(yǎng)基的1/2；不含肌醇和甘氨酸，但其它有機物質(zhì)的含量與ms培養(yǎng)基相同。1/8改進的ms營養(yǎng)液的各種物質(zhì)含量為改進的ms營養(yǎng)液的1/8。1/4改進的ms營養(yǎng)液的各種物質(zhì)含量為改進的ms營養(yǎng)液的1/4。本發(fā)明的積極效果：可用有莖刺黑果枸杞作為起始材料，成功培育出大量無刺黑果枸杞植株，且無刺植株生長發(fā)育良好。本發(fā)明證明黑果枸杞莖刺屬于植物誘導(dǎo)防御范疇，而非組成型防御。本發(fā)明為研究黑果枸杞響應(yīng)土壤干旱脅迫的莖刺發(fā)育機理提供了基礎(chǔ)實驗材料，并為培育無刺黑果枸杞新品種奠定基礎(chǔ)。附圖說明圖1本發(fā)明的技術(shù)路線示意圖。圖2黑果枸杞移栽小植株及無刺植株圖；a移栽成活的黑果枸杞植株；b無刺黑果枸杞植株；c有刺黑果枸杞莖；d無刺黑果枸杞莖。具體實施方式下面將結(jié)合圖1-2和實際操作對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明的范圍并不局限于以下的實施例。實施例1：1.培育黑果枸杞組培苗按照專利(201610206401.1)的方法，切取無菌種苗或再生植株的健康幼嫩葉片為直徑5mm的小塊，橫向平接到含6-ba0.1mg/l+naa0.1mg/l+4.5g/l瓊脂+40g/l的蔗糖的ms固體培養(yǎng)基上。25℃下置于微弱散射光下培養(yǎng)2周，之后轉(zhuǎn)到14w的led等光下培養(yǎng)，每天光照8h。上述ms固體培養(yǎng)基121℃高壓滅菌15min之前用1mol/lkoh溶液將ph值調(diào)節(jié)到5.4。外植體接種4周時進行繼代，將培養(yǎng)材料轉(zhuǎn)接到相同的培養(yǎng)基上。此時多數(shù)葉片外植體形成愈傷的表面出現(xiàn)大量芽叢。待芽長到高度3cm以上時剪下，插入不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的ph值為5.4的1/2ms固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根。1/2ms固體培養(yǎng)基除了瓊脂含量與上述ms固體培養(yǎng)基一致，其它蔗糖、大量元素、微量元素、鐵鹽和有機物質(zhì)的含量均為ms培養(yǎng)基的1/2。誘導(dǎo)生根的光周期為12光照/12h黑暗。2.壯苗培養(yǎng)將生根小植株接種到玻璃瓶內(nèi)的改良1/4ms固體培養(yǎng)基，改良1/4ms固體培養(yǎng)基是除了kh2po4和kno3的含量與ms培養(yǎng)基一樣，其它大量元素、微量元素、鐵鹽及有機物質(zhì)含量均為ms培養(yǎng)基1/4的一種培養(yǎng)基，培養(yǎng)基121℃高壓滅菌15min之前用1mol/l的koh溶液將ph值調(diào)節(jié)到5.4。培養(yǎng)基添加20g/l的蔗糖和7.0g/l的瓊脂粉。接種完后將玻璃瓶置于自然日光下培養(yǎng)。可以放在房屋南面的窗臺上。培養(yǎng)溫度保持在25℃，光周期遵從自然日升日落規(guī)律。待組培苗莖干粗壯(木質(zhì)化)且葉片變厚呈深綠色時方可進行移栽。3.煉苗及移栽移栽介質(zhì)為重量比3:2的腐殖土和細河沙。移栽介質(zhì)121℃高壓滅菌2h，涼透的介質(zhì)可用于移栽。將壯苗之后的帶根植株進行移栽。開瓶之后立即將苗取出，放于網(wǎng)眼框內(nèi)置于自來水龍頭下沖洗。整個沖洗過程要盡量避免傷害植株根系。將沖洗干凈的組培苗迅速置于多菌靈工作液中浸泡5min。之后將苗栽植于盆缽中的移栽介質(zhì)中，澆透蒸餾水之后覆蓋帶孔保鮮膜保濕。剛移栽的組培苗要置于散射光下，避免日光直射。定期澆蒸餾水保持盆土含水量為100％田間持水量，從移栽第5天開始逐漸揭去保鮮膜。具體方法是先將保鮮膜與盆缽之間揭開較小縫隙，如果24小時之后發(fā)現(xiàn)小苗尚未萎蔫，則繼續(xù)將保鮮膜與盆缽之間的縫隙擴大；擴大縫隙之后再觀察24小時，如果小苗仍未萎蔫，再繼續(xù)擴大保鮮膜與盆缽之間的空隙，直到保鮮膜完全揭開為止。待植株明顯開始生長之時再逐漸挪到自然日光下。整個過程都要定期澆蒸餾水保持盆土含水量為90％～100％田間持水量。環(huán)境溫度保持在25℃。4.盆栽控水處理及澆灌營養(yǎng)液挑選健康且長勢良好的移栽植株用于盆栽控水處理。每日澆水使盆土含水量保持在80％田間持水量，盆苗置于自然日光下，環(huán)境溫度保持在25℃。在控水的同時，每隔15天澆灌一次過濾除菌(0.22μm濾膜)的1/8改進的ms營養(yǎng)液。注意澆灌營養(yǎng)液當天也要保證盆土含水量是80％田間持水量。此步提到的改進的ms營養(yǎng)液不含蔗糖和瓊脂、含有等量的ms大量元素和ms鐵鹽、含有除去硫酸銅和氯化鈷以外的半量ms微量元素、含有除去肌醇和甘氨酸以外的等量ms有機物質(zhì)。1/8改進的ms營養(yǎng)液的各種物質(zhì)含量為改進的ms營養(yǎng)液的1/8(表1)。此方法可以使整株黑果枸杞植株無一棘刺(莖刺)，無刺植株獲得率可達100％。此方法獲得的無刺植株均生長發(fā)育良好(圖2b和2d)。實施例2：1.培育黑果枸杞組培苗按照專利(201610206401.1)的方法，以無菌種苗莖段或再生植株的莖段為外植體進行組織培養(yǎng)。將去葉的無菌嫩莖剪切為0.5～2cm的小段，下端朝下插入含6-ba0.2mg/l+5.0g/l瓊脂+35g/l的蔗糖的ph值為5.6的ms固體培養(yǎng)基上。24℃下每天光照10h。接種4周時，將材料繼代到相同的培養(yǎng)基培養(yǎng)。當培養(yǎng)材料產(chǎn)生的葉腋叢生芽或愈傷不定芽高度達4cm的時候，將其剪下插入不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2ms固體培養(yǎng)誘導(dǎo)生根。2.壯苗培養(yǎng)將生根小植株接種到玻璃瓶內(nèi)的改良1/2ms固體培養(yǎng)基。改良的1/2ms固體培養(yǎng)基是除了kh2po4和kno3的含量與ms培養(yǎng)基一樣，其它大量元素、微量元素、鐵鹽及有機物質(zhì)含量均為ms培養(yǎng)基1/2的一種培養(yǎng)基。培養(yǎng)基121℃高壓滅菌15min之前用1mol/l的naoh溶液將ph值調(diào)節(jié)到5.8。培養(yǎng)基添加20g/l的蔗糖和4.3g/l的瓊脂粉。接種完后將玻璃瓶置于自然日光下培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度保持在26℃，光周期遵從自然日升日落規(guī)律。待組培苗莖干粗壯(木質(zhì)化)且葉片變厚呈深綠色時方可進行移栽。3.煉苗及移栽移栽介質(zhì)為重量比3:2的菜園土和細河沙。移栽介質(zhì)121℃高壓滅菌1h，涼透的介質(zhì)可用于移栽。將壯苗之后的帶根植株進行移栽。開瓶之后立即將苗取出，放于網(wǎng)眼框內(nèi)置于自來水龍頭下沖洗。整個沖洗過程要盡量避免傷害植株根系。將沖洗干凈的組培苗迅速置于多菌靈工作液中浸泡5min。之后將苗栽植于盆缽中的移栽介質(zhì)中，澆透蒸餾水之后覆蓋帶孔塑料膜保濕。剛移栽的組培苗要置于散射光下，避免日光直射。定期澆蒸餾水保持盆土含水量為100％田間持水量，從移栽第10天開始可逐漸揭去保鮮膜，具體方法同實施例1。待植株明顯開始生長之時再逐漸挪到自然日光下。整個過程都要使盆土含水量保持在80％～100％田間持水量。環(huán)境溫度保持在26℃。4.盆栽控水處理及澆灌營養(yǎng)液挑選健康且長勢良好的移栽植株用于盆栽控水處理實驗。每日澆水使盆土含水量保持在90％田間持水量，盆苗置于自然日光下，環(huán)境溫度保持在26℃。在控水的同時，每隔20天澆灌一次過濾除菌(0.22μm濾膜)的1/8改進的ms營養(yǎng)液(表1)。注意澆灌營養(yǎng)液當天也要保證盆土含水量是90％田間持水量。實施例3：1.培育黑果枸杞組培苗采集溫室內(nèi)的有菌有刺黑果枸杞莖。在無菌超凈工作臺用75％(體積/體積)酒精浸泡莖段30s，再用0.12％(質(zhì)量/體積)的氯化汞水溶液浸泡3min，無菌水沖洗4遍。將2cm長的帶葉腋莖段接種到添加6-ba0.3mg/l的1/2ms固體培養(yǎng)基上，23℃每天12小時光照培養(yǎng)。待接種的莖段腋芽萌發(fā)出嫩枝之后，采集嫩枝的葉片和莖段為外植體。參照專利201610206401.1的方法，嫩莖段外植體接種到含6-ba0.05mg/l+naa0.05mg/l的ms固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷和芽叢；葉片外植體接種到含6-ba0.4mg/l+naa0.05mg/l的ms固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷和芽叢?；蛘邔⑷~腋萌生嫩枝剪下插入不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2ms培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，然后采集生根植株的幼嫩莖和葉為外植體獲得無性系。也可以繼續(xù)采集無菌無性系的幼嫩莖和葉為外植體，通過離體培養(yǎng)獲得次生無性系。此步用到的1/2ms固體培養(yǎng)基添加蔗糖20g/l，瓊脂0.45g/l。121℃高壓滅菌15min之前用1mol/l的koh溶液將ph值調(diào)節(jié)到5.6。2.壯苗培養(yǎng)將上步獲得的無菌無性系或無菌次生無性系小植株接種到玻璃瓶內(nèi)的改良1/4ms固體培養(yǎng)基，改良1/4ms固體培養(yǎng)基是除了kh2po4和kno3的含量與ms培養(yǎng)基一樣，其它大量元素、微量元素、鐵鹽及有機物質(zhì)含量均為ms培養(yǎng)基1/4的一種培養(yǎng)基。培養(yǎng)基121℃高壓滅菌20min之前用1mol/l的koh溶液將ph值調(diào)節(jié)到5.6。培養(yǎng)基添加20g/l的蔗糖和6.0g/l的瓊脂粉。接種完后將玻璃瓶置于自然日光下培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度保持在23℃，光周期遵從自然日升日落規(guī)律。待組培苗莖干粗壯(木質(zhì)化)且葉片變厚呈深綠色時方可進行移栽。3.煉苗及移栽移栽介質(zhì)為重量比2:1的腐殖土和草炭。移栽介質(zhì)121℃高壓滅菌30min，涼透的介質(zhì)可用于移栽。將壯苗之后的帶根植株進行移栽。開瓶之后立即將苗取出，放于網(wǎng)眼框內(nèi)置于自來水龍頭下沖洗。整個沖洗過程要盡量避免傷害植株根系。將沖洗干凈的組培苗迅速置于甲基托布津工作液中浸泡7min。之后將苗栽植于盆缽中的移栽介質(zhì)中，澆透蒸餾水之后覆蓋帶孔保鮮膜保濕。剛移栽的組培苗要置于散射光下，避免日光直射。定期澆蒸餾水保持盆土含水量為100％田間持水量，從移栽第7天開始可逐漸揭去保鮮膜，具體方法同實施例1。待植株明顯開始生長之時再逐漸挪到自然日光下。整個過程都要定期澆蒸餾水保持盆土含水量為90％～100％田間持水量。環(huán)境溫度保持在23℃。4.盆栽控水處理及澆灌營養(yǎng)液挑選健康且長勢良好的移栽植株用于盆栽控水處理。每日澆水使盆土含水量保持在75％田間持水量，盆苗置于自然日光下，環(huán)境溫度保持在23℃。在控水的同時，每隔30天澆灌一次過濾除菌(0.22μm濾膜)的1/4改進的ms營養(yǎng)液。1/4改進ms營養(yǎng)液各成分的含量是1/8改進ms營養(yǎng)液(表1)的2倍。注意澆灌營養(yǎng)液當天也要保證盆土含水量是75％田間持水量。表1.1/8改進的ms營養(yǎng)液成分表成分使用濃度(mg/l)硝酸銨(nh4no3)206.25(1/8ms)硝酸鉀(kno3)237.50(1/8ms)氯化鈣(cacl2·2h2o)55.00(1/8ms)硫酸鎂(mgso4·7h2o)46.25(1/8ms)磷酸二氫鉀(kh2po4)21.25(1/8ms)碘化鉀(ki)0.05(1/16ms)硼酸(h3bo3)0.39(1/16ms)硫酸錳(mnso4·4h2o)1.39(1/16ms)硫酸鋅(znso4·7h2o)0.54(1/16ms)鉬酸鈉(na2moo4·2h2o)0.02(1/16ms)硫酸亞鐵(feso4·7h2o)3.48(1/8ms)乙二胺四乙酸二鈉(na2-edta·2h2o)4.66(1/8ms)煙酸(vb5或vpp)0.06(1/8ms)鹽酸吡哆醇(vb6)0.06(1/8ms)鹽酸硫胺素(vb1)0.01(1/8ms)最佳實施方案：1.培育黑果枸杞組培苗以無菌幼嫩黑果枸杞(種苗、組培苗或組培萌枝)的莖段或葉片為外植體，經(jīng)過愈傷階段形成再生芽。待芽生長到4cm高時，剪下帶頂芽嫩莖接種到不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2ms固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根。此處的1/2ms固體培養(yǎng)基是添加4.5g/l的瓊脂粉(濟南中天組培園藝用品有限公司)+20g/l分析純蔗糖+1/2ms大量元素+1/2ms微量元素+1/2ms鐵鹽+1/2ms有機物質(zhì)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基121℃高壓滅菌15min之前用1mol/l的koh將ph值調(diào)節(jié)為5.6。培養(yǎng)室溫度25℃。葉片外植體在散射光下誘導(dǎo)出愈傷組織之后置于12光照/12黑暗的光周期條件下培養(yǎng)。光照由14w的led燈管(3根一組)提供。此外，值得一提的是大部分莖外植體插入培養(yǎng)基的一端會產(chǎn)生結(jié)節(jié)樣愈傷組織，愈傷組織經(jīng)過培養(yǎng)會產(chǎn)生不定芽；而莖外植體的沒有插入培養(yǎng)基一端的葉腋處會產(chǎn)生叢生芽。取愈傷組織不定芽用于后續(xù)實驗，效果好于葉腋叢生芽。2.壯苗培養(yǎng)將生根小植株接種到玻璃瓶內(nèi)的改良1/4ms固體培養(yǎng)基，改良1/4ms固體培養(yǎng)基是除了kh2po4和kno3的含量與ms培養(yǎng)基一樣，其它大量元素、微量元素、鐵鹽及有機物質(zhì)含量均為ms培養(yǎng)基1/4的一種培養(yǎng)基。培養(yǎng)基121℃高壓滅菌(15min)之前用1mol/l的koh溶液將ph值調(diào)節(jié)到5.6。改良1/4ms培養(yǎng)基添加20g/l的蔗糖和5.0g/l的瓊脂粉。接種完后將玻璃瓶置于房屋南面的窗臺上，讓其接受自然光照，光周期遵從自然日升日落規(guī)律。培養(yǎng)溫度保持在25℃。待組培苗莖干粗壯(木質(zhì)化)、根系發(fā)達且葉片變厚呈深綠色時方可進行移栽。此方法的壯苗成功率為100％。3.煉苗及移栽移栽介質(zhì)為重量比3:2的腐殖土和草炭。移栽介質(zhì)121℃高壓滅菌40min，涼透的介質(zhì)可用于移栽。開瓶之后立即將壯苗連同培養(yǎng)基一起取出，放于網(wǎng)眼框內(nèi)置于自來水龍頭下沖洗。邊沖洗邊從上往下擠壓培養(yǎng)基，注意一定不要左右擠壓培養(yǎng)基，以避免傷害植株根系。將沖洗干凈的組培苗迅速置于多菌靈工作液中浸泡5min。之后將苗栽植于盆缽中的移栽介質(zhì)中，澆透蒸餾水之后覆蓋帶孔保鮮膜保濕。剛移栽的組培苗要置于散射光下，避免日光直射。定期澆蒸餾水保持盆土含水量為100％田間持水量，從移栽第10天開始可逐漸揭去保鮮膜，具體方法同實施例1。待植株明顯開始生長之時再逐漸挪到自然日光下。整個過程的環(huán)境溫度保持在25℃，并要定期澆灌蒸餾水以保持盆土含水量為90％～100％田間持水量。此方法的移栽成活率為96.2～100％。4.盆栽控水處理及澆灌營養(yǎng)液挑選健康且長勢良好的移栽植株用于盆栽控水處理。每日澆水使盆土含水量保持在85％田間持水量，盆苗置于自然日光下，環(huán)境溫度保持在25℃。在控水的同時，每隔15天澆灌一次過濾除菌(0.22μm濾膜)的1/8改進的ms營養(yǎng)液(表1)。注意澆灌營養(yǎng)液當天也要保證盆土含水量是85％田間持水量。在整個控水和澆灌營養(yǎng)液的過程中要保證植株不受其他生物或非生物脅迫，比如病蟲害、枝條折斷和火燒等。在此前提下，本方法的無刺植株得率可達100％。當前第1頁12