本發(fā)明所屬植物組織培養(yǎng)研究領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種黑松無(wú)菌快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
黑松(pinusthunbergii)原產(chǎn)日本，于上世紀(jì)20年代引種中國(guó)，因具有耐干旱瘠薄、抗海風(fēng)海煞、抗松干蚧和松毛蟲等病蟲害、樹型優(yōu)美等特點(diǎn)，成為了我國(guó)東部沿海沿防林建設(shè)中不可取代的優(yōu)勢(shì)種，北起大連、旅順南至臺(tái)灣沿海地區(qū)及內(nèi)陸部分地區(qū)均有栽培。初引種之時(shí)，黑松具有生長(zhǎng)速度較快、抗病蟲能力強(qiáng)的特點(diǎn)，但是近些年的調(diào)查數(shù)據(jù)表明，黑松在生活力、生長(zhǎng)速度、抗逆性、林木品質(zhì)、觀賞價(jià)值上都有不同程度的下降，特別是抗病性嚴(yán)重下降，容易感染黑松枝枯病和線蟲病。目前黑松苗木的培育以種子繁殖為主，種子市場(chǎng)管理混亂，導(dǎo)致黑松種子純度嚴(yán)重下降和品質(zhì)的退化，所以市場(chǎng)上的黑松苗木品質(zhì)也在逐年退化。因此，篩選野生優(yōu)良個(gè)體，并對(duì)其進(jìn)行保種繁殖成為了黑松育種的一個(gè)重要方法，組織培養(yǎng)工作者試圖對(duì)個(gè)別抗病植株進(jìn)行室內(nèi)無(wú)菌繁殖方法研究，以期在室內(nèi)短期內(nèi)獲取無(wú)毒無(wú)菌幼苗。目前黑松再生苗有成功誘導(dǎo)都以合子胚為外植體，由合子胚直接誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生或誘導(dǎo)胚性愈傷組織再形成體細(xì)胞胚，進(jìn)而發(fā)育形成無(wú)菌苗，未見有通過(guò)愈傷組織增殖再經(jīng)莖芽分化形成再生苗的技術(shù)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種黑松無(wú)菌快速繁殖方法，采用黑松針葉為外植體有效地獲得愈傷組織，并在短時(shí)間內(nèi)使愈傷組織大量增殖，后進(jìn)一步分化形成無(wú)菌苗，煉苗、移栽實(shí)現(xiàn)快速繁殖。本發(fā)明的具體步驟如下：
1)外植體的選?。河诖杭静杉瘶潺g在7年以下幼年黑松頂端的幼嫩松枝，將其上的松針連鞘拔下，清洗后在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行消毒處理，得到無(wú)菌的松針；
2)愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下將無(wú)菌松針的基部切下1cm長(zhǎng)的片段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于25℃、黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)。其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方如下：以ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加了蔗糖30g/l、瓊脂6.5g/l、6-ba2mg/l+naa0.05mg/l。培養(yǎng)15d后針葉基片段部開始產(chǎn)生愈傷組織，3周后誘導(dǎo)率為47.2％；
3)愈傷組織的增殖：將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基上，于25℃、光照強(qiáng)度為1500lux條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使愈傷組織活力增強(qiáng)并大量增殖。其中，所述增殖培養(yǎng)基是以1/2ms為基本培養(yǎng)基，ph＝6.4，并添加了蔗糖30g/l、瓊脂6.5g/l、水解酪蛋白1000mg/l、naa0.05mg/l+psk0.001mg/l。愈傷組織可2周擴(kuò)增1倍；
4)不定芽的分化培養(yǎng)：將增殖后的愈傷組織轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基上，于25℃、光照強(qiáng)度為2500lux條件下進(jìn)行培養(yǎng)，促使愈傷組織分化為不定芽。所述分化培養(yǎng)基是以1/4ms為基本培養(yǎng)基，ph＝6.4，并添加了蔗糖30g/l、瓊脂6.5g/l、水解酪蛋白500mg/l、naa0.01mg/l+psk0.002mg/l。4周分化率為88.2％；
5)生根培養(yǎng)：將芽高大于1.5cm的不定芽切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，于25℃、光照強(qiáng)度為2500lux條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)不定芽生根。所述分化培養(yǎng)基是以1/2ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，ph＝6.4，并添加蔗糖30g/l、naa0.25mg/l+iba0.25mg/l時(shí)，30天生根率為71.8％。
6)煉苗和移栽：當(dāng)種苗擴(kuò)繁到一定數(shù)量后，選取2.5cm以上的小植株進(jìn)行煉苗移栽，60天后小植株成活率可達(dá)到90％以上。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：提供了一套完整的黑松無(wú)菌快速繁殖技術(shù)，從針葉誘導(dǎo)出活力強(qiáng)的愈傷組織、在短時(shí)間內(nèi)可將愈傷組織大量增殖(兩周倍增)，再由愈傷組織分化成綠苗，經(jīng)煉苗和移栽后成為種苗。從愈傷組織誘導(dǎo)至成苗僅需4個(gè)月，由于愈傷組織可實(shí)現(xiàn)兩周倍增，因此該技術(shù)大大加快了黑松育苗速度。本發(fā)明為黑松優(yōu)良個(gè)體的保種和擴(kuò)繁提供了一條新的可行方法，可為黑松進(jìn)一步人工規(guī)?；敝澈驮耘嗪谒商峁﹥?yōu)質(zhì)種苗。
具體實(shí)施方式
一種黑松的無(wú)菌快速繁殖方法，通過(guò)以下步驟來(lái)進(jìn)行：
1、外植體的選取
于春季采集樹齡在7年以下的黑松頂端幼嫩松枝，將其上的松針拔下，流水沖洗后在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行消毒處理，75％酒精消毒30秒，無(wú)菌水洗滌2-3次，再用20％過(guò)氧化氫消毒17-18分鐘，期間不時(shí)進(jìn)行搖晃，無(wú)菌水洗滌2-3次，得到無(wú)菌的松針；
2、愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)
在無(wú)菌條件下將無(wú)菌松針的基部切下1cm長(zhǎng)的片段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于25℃、黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)。采用兩因素設(shè)計(jì)法對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行激素用量的篩選：以ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，ph＝6.4，并添加了蔗糖30g/l、瓊脂6.5g/l和不同濃度配比的激素組合，其中，生長(zhǎng)素選用naa，其濃度為0mg/l、0.05mg/l、0.1mg/l、0.5mg/l，細(xì)胞分裂素選用6-ba，其濃度為0mg/l、1mg/l、2mg/l、4mg/l，兩種激素濃度兩兩組合，共16個(gè)處理，每個(gè)處理接種30個(gè)松針片斷，重復(fù)3次，篩選確定影響黑松愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織質(zhì)量的激素最佳濃度配比。3周后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，愈傷組織誘導(dǎo)率＝產(chǎn)生愈傷組織的接種松針數(shù)/未污染的接種松針數(shù)×100％；
表1不同激素組合條件下愈傷組織的誘導(dǎo)率(％)
***：表示愈傷組織顏色活力最強(qiáng)，**：表示愈傷組織顏色活力強(qiáng)，**：表示愈傷組織顏色活力弱
培養(yǎng)15d后針葉基部開始產(chǎn)生愈傷組織，3周后，不同激素組合愈傷組織誘導(dǎo)率如表1所示。雖然黑松基部切段誘導(dǎo)率在6-ba2mg/l+naa0.1mg/l時(shí)最高，為60.7％，但愈傷組織易于褐化，而6-ba2mg/l+naa0.05mg/l激素組合誘導(dǎo)出的愈傷組織顏色鮮綠，松散，活力最強(qiáng)，且愈傷組織誘導(dǎo)率也較高(47.2％)，因此采用該愈傷組織作為增殖對(duì)象；
3、愈傷組織的增殖
將活力最佳的愈傷組織轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基上，于25℃、光照強(qiáng)度為1500lux條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使愈傷組織活力增強(qiáng)并大量增殖。采用單因素設(shè)計(jì)法對(duì)增殖培養(yǎng)基進(jìn)行以下三方面的篩選：基本培養(yǎng)基、水解酪蛋白濃度和激素濃度。每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接愈傷組織1g左右，以確定最佳增殖培養(yǎng)基配方。接種3周后測(cè)愈傷組織生長(zhǎng)量并記錄其顏色狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)其增殖率，增殖率＝(21天時(shí)愈傷組織的質(zhì)量-初始接種質(zhì)量)/初始接種質(zhì)量×100％；
3.1基本培養(yǎng)基篩選
選用四種基本培養(yǎng)基：ms、1/2ms、gd、b5培養(yǎng)基無(wú)機(jī)元素+1/2ms培養(yǎng)基有機(jī)物，ph＝6.4，并添加了蔗糖30g/l、瓊脂6.5g/l、naa0.05mg/l+6-ba2mg/l。21天后增殖率最大者為1/2ms(94.5％)，因此，以下增殖實(shí)驗(yàn)均采用1/2ms為基本培養(yǎng)基；
3.2水解酪蛋白篩選
以1/2ms為基本培養(yǎng)基，選用水解酪蛋白四個(gè)梯度：0mg/l、100mg/l、500mg/l、1000mg/l，ph＝6.4，并添加了蔗糖30g/l、瓊脂6.5g/l、naa0.05mg/l+6-ba2mg/l；21天后增殖率最大者為1000mg/l者(113.7％)，因此，以下增殖實(shí)驗(yàn)均添加水解酪蛋白1000mg/l；
3.3激素篩選
以1/2ms為基本培養(yǎng)基，選用激素五個(gè)組合梯度：naa0.05mg/l+psk0.001mg/l、naa0.05mg/l+psk0.002mg/l、naa0.05mg/l+psk0.003mg/l、naa0.05mg/l+psk0.004mg/l和naa0.05mg/l+psk0.005mg/l，ph＝6.4，并以naa0.05mg/l+6-ba2mg/l為對(duì)照，培養(yǎng)基中還添加了蔗糖30g/l、瓊脂6.5g/l、水解酪蛋白1000mg/l。21天后增殖率最大者為naa0.05mg/l+psk0.001mg/l者(153.4％)，且結(jié)果與其它組具有顯著性差異；
因此，最佳增殖培養(yǎng)基配方為：以1/2ms為基本培養(yǎng)基，ph＝6.4，并添加了蔗糖30g/l、瓊脂6.5g/l、水解酪蛋白1000mg/l、naa0.05mg/l+psk0.001mg/l，此時(shí)愈傷組織2周增殖1倍；
4、不定芽的分化培養(yǎng)
將增殖后的愈傷組織挑取顏色鮮綠、生長(zhǎng)旺盛者，轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基上，于25℃、光照強(qiáng)度為2500lux條件下進(jìn)行培養(yǎng)，促使愈傷組織分化為不定芽。分別采用單因素設(shè)計(jì)法和兩因素設(shè)計(jì)法對(duì)增殖培養(yǎng)基進(jìn)行以下兩方面的篩選：基本培養(yǎng)基和激素濃度。每個(gè)處理接10瓶，每瓶中接黃豆粒大的愈傷組織5塊，4周后統(tǒng)計(jì)不定芽分化率，不定芽分化率＝分化的不定芽數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù)×100％；
4.1激素的篩選
以1/2ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，ph＝6.4，并添加了蔗糖30g/l、水解酪蛋白500mg/l、瓊脂6.5g/l，選用激素naa(0mg/l和0.01mg/l)和psk(0.001mg/l、0.002mg/l、0.005mg/l)，兩種激素濃度兩兩組合，共形成6個(gè)處理。4周后不定芽分化率最高者為naa0.01mg/l+psk0.002mg/l，分化率為68.3％；
4.2基本培養(yǎng)基篩選
選用四種基本培養(yǎng)基：ms、1/2ms、gd、1/4ms，ph＝6.4，并添加了蔗糖30g/l、瓊脂6.5g/l、水解酪蛋白500mg/l、naa0.01mg/l+psk0.002mg/l。4周后分化率最大者為1/4ms(88.2％)，因此，最佳分化培養(yǎng)基配方為：以1/4ms為基本培養(yǎng)基，ph＝6.4，并添加了蔗糖30g/l、瓊脂6.5g/l、水解酪蛋白500mg/l、naa0.01mg/l+psk0.002mg/l；
5、生根培養(yǎng)
將芽高大于1.5cm的不定芽從基部切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，于25℃、光照強(qiáng)度為2500lux條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)不定芽生根。所述分化培養(yǎng)基是以1/2ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，ph＝6.4，并添加蔗糖30g/l、激素設(shè)九個(gè)梯度：naa0.5mg/l、naa1.0mg/l、naa2.0mg/l、iba0.5mg/l、iba1.0mg/l、iba2.0mg/l、naa0.25mg/l+iba0.25mg/l、naa0.5mg/l+iba0.5mg/l、naa1.0mg/l+iba1.0mg/l，30天后統(tǒng)計(jì)生根率，生根率＝生根的不定芽數(shù)/轉(zhuǎn)接的不定芽數(shù)×100％；統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中激素為naa0.25mg/l+iba0.25mg/l時(shí)，生根率最高，為71.8％。
6、煉苗和移栽
將生根的小綠苗繼續(xù)培養(yǎng)20天，當(dāng)根長(zhǎng)至1.5cm以上時(shí)，進(jìn)行煉苗移栽。先將培養(yǎng)瓶打開，在培養(yǎng)室適應(yīng)2天后轉(zhuǎn)移到溫室中煉苗，輕輕地將小苗取出，用清水洗掉殘留培養(yǎng)基，移栽至穴盤中，穴盤內(nèi)裝有育苗基質(zhì)，其配方為：1/4細(xì)沙土+1/4蛭石+1/2腐殖土，基質(zhì)用0.3-0.5％kmno4消毒。期間要保持溫室內(nèi)濕度70％、光照為自然光的70％，溫度為25±2℃，20天后進(jìn)行常規(guī)管理，60天后成活率為大于90％。