一種轉(zhuǎn)基因青蒿的環(huán)境安全評(píng)價(jià)方法與流程

本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物的安全評(píng)價(jià)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)基因青蒿的環(huán)境安全評(píng)價(jià)方法。

背景技術(shù)：

瘧疾(malaria)是由瘧原蟲(chóng)所致的蟲(chóng)媒傳染病。瘧疾流行于102個(gè)國(guó)家和地區(qū)，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，有20億人口居住在疾病區(qū)，特別是在非洲、東南亞和中、南美洲的一些國(guó)家，惡性瘧死亡率極高。非洲地區(qū)的世界衛(wèi)生組織(WHO)對(duì)這種疾病的負(fù)擔(dān)是最重的，估計(jì)所有死亡中有90％的人死于瘧疾，而5歲以下的兒童占因瘧疾死亡的78％。

目前，對(duì)瘧疾最有效的治療方法是以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法。青蒿素是從青蒿中分離出的倍半萜內(nèi)脂藥物，但青蒿的青蒿素含量很低，而青蒿素的人工合成則成本高，價(jià)格昂貴。

利用基因工程方法是一種很有望提高青蒿素產(chǎn)量的方法，近年來(lái)，青蒿素生物合成的分子調(diào)控機(jī)制研究取得了顯著性進(jìn)展，青蒿素的生物合成途徑中的幾種編碼關(guān)鍵酶基因，包括ADS，AaWRKY1，CYP71AV1和CPR，已經(jīng)從青蒿中克隆。如：在唐克軒教授實(shí)驗(yàn)室，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)入CYP71AV1和CPR基因，獲得了轉(zhuǎn)基因青蒿GYR，該品系顯著增加了青蒿素的含量。在商業(yè)化之前，轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)該在環(huán)境釋放實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行環(huán)境安全評(píng)價(jià)。

然而，轉(zhuǎn)基因(GM)植物的培育中，由于其潛在的生態(tài)及人類健康風(fēng)險(xiǎn)而受到關(guān)注，雖然在基因工程中只插入了一小段外源DNA序列，但是由此產(chǎn)生的新型的有機(jī)體可能導(dǎo)致雜草化或者環(huán)境生存的不耐受性，并且影響到生態(tài)環(huán)境等。因此，轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性和生存能力的問(wèn)題，必須進(jìn)行系統(tǒng)的環(huán)境安全評(píng)價(jià)。轉(zhuǎn)基因植物在環(huán)境釋放和商業(yè)化中仍有許多問(wèn)題還沒(méi)有答案。

我國(guó)農(nóng)業(yè)部(MOA)在1996年實(shí)施了轉(zhuǎn)基因法規(guī)，在商業(yè)化前，所有實(shí)驗(yàn)研究、田間試驗(yàn)和環(huán)境釋放的相關(guān)的生物安全評(píng)價(jià)都要求由轉(zhuǎn)基因生物安全委員會(huì)進(jìn)行評(píng)估。

到目前為止，許多的轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)進(jìn)行了田間試驗(yàn)，并且，有些已經(jīng)商業(yè)化；然而，評(píng)估轉(zhuǎn)基因青蒿在環(huán)境釋放中的實(shí)驗(yàn)仍未見(jiàn)報(bào)道研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因青蒿的環(huán)境安全評(píng)價(jià)方法，從形態(tài)學(xué)差異性、抗逆性以及基因漂移三個(gè)方面建立評(píng)估參數(shù)體系，本發(fā)明從以上三個(gè)方面建立的評(píng)價(jià)體系操作簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)，直觀性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確性高，為轉(zhuǎn)基因青蒿品種的商業(yè)化種植及評(píng)估提供了技術(shù)支撐。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種轉(zhuǎn)基因青蒿的環(huán)境安全評(píng)價(jià)方法，包括以下步驟：

1)農(nóng)藝性狀形態(tài)學(xué)測(cè)定

將轉(zhuǎn)基因青蒿植株從溫室內(nèi)移栽至大田種植區(qū)域內(nèi)，移植3-4個(gè)月后，測(cè)定植株的形態(tài)學(xué)參數(shù)，同時(shí)，以野生型青蒿作對(duì)照；

2)抗逆性評(píng)價(jià)

在溫室中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因青蒿的鹽脅迫、干旱脅迫、除草劑耐受以及越冬能力評(píng)價(jià)，同時(shí)，以野生型青蒿作對(duì)照；

3)基因漂移測(cè)定

設(shè)置矩形實(shí)驗(yàn)場(chǎng)來(lái)進(jìn)行基因漂移試驗(yàn)，其面積不低于5畝，含外源基因的轉(zhuǎn)基因青蒿種植于中心點(diǎn)及其4-7個(gè)同心圓中，同心圓的半徑從內(nèi)到外以0.8-1.4m逐個(gè)增加，矩形實(shí)驗(yàn)場(chǎng)的最短邊長(zhǎng)應(yīng)是同心圓最大半徑的4-9倍，同心圓外種植野生型青蒿，同時(shí)，在該矩形實(shí)驗(yàn)場(chǎng)周圍設(shè)置物理隔離區(qū)；

在野生型受體青蒿種植區(qū)內(nèi)，沿同心圓的8個(gè)以上方向設(shè)置不少于72個(gè)測(cè)試點(diǎn)，呈米字形，收獲各測(cè)試點(diǎn)的青蒿種子，測(cè)定種子發(fā)芽率、并進(jìn)行卡那霉素抗性篩選，對(duì)于抗卡那霉素的植株利用PCR方法進(jìn)一步驗(yàn)證其是否含有插入的外源基因。

進(jìn)一步，步驟1)所述的生長(zhǎng)形態(tài)參數(shù)為株高、冠幅、莖粗、種子發(fā)芽率、葉片干重、千粒重和葉片形狀。

又進(jìn)一步，所述步驟1)中的生長(zhǎng)形態(tài)參數(shù)中，對(duì)于株高、冠幅和莖粗，在植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)早期和中期分別測(cè)定；對(duì)于種子發(fā)芽率的測(cè)定過(guò)程為：取等量的轉(zhuǎn)基因青蒿種子，清洗后分別播種至基質(zhì)、水以及無(wú)菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7-15天，按下式統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率；

種子發(fā)芽率＝(發(fā)芽種子數(shù)/播種種子數(shù))×100。

又，步驟1)所述農(nóng)藝性狀形態(tài)學(xué)參數(shù)中，千粒重的測(cè)定過(guò)程為：收集30-50株植株的種子，數(shù)出1000粒并測(cè)定種子的千粒重。

進(jìn)一步，步驟2)中，鹽脅迫測(cè)定中，測(cè)定了葉片的相對(duì)含水量、過(guò)氧化物酶活性、游離脯氨酸和丙二醛含量；干旱脅迫實(shí)驗(yàn)在添加了PEG脅迫中進(jìn)行，測(cè)定干旱脅迫中青蒿葉片中的游離脯氨酸、株高和復(fù)葉數(shù)差值；除草劑耐受性中所述的除草劑為非選擇性除草劑和選擇性除草劑。

優(yōu)選地，步驟3)中所述的矩形實(shí)驗(yàn)場(chǎng)的寬度不低于長(zhǎng)度的1/2，在該矩形實(shí)驗(yàn)場(chǎng)周圍種植玉米隔離帶作為物理隔離區(qū)。

進(jìn)一步，步驟3)中，一個(gè)方向由內(nèi)到外設(shè)置8～14個(gè)測(cè)試點(diǎn)，其中，測(cè)試點(diǎn)1～5之間每?jī)牲c(diǎn)間隔0.8m，測(cè)試點(diǎn)6～10之間每?jī)牲c(diǎn)間隔2.4m，測(cè)試點(diǎn)11～14之間每?jī)牲c(diǎn)間隔4.8米。

又優(yōu)選地，步驟3)中，收獲的青蒿種子來(lái)自植株的頂部、中部和下部，均勻采收。

進(jìn)一步，步驟3)中，抗卡那霉素的植株被移植到穴盤壯苗后，生長(zhǎng)15-25天后，從每株幼苗上選取3-5片葉片進(jìn)行DNA的提取。

進(jìn)一步，步驟3)中，導(dǎo)入了外源基因CYP71AV1和CPR的轉(zhuǎn)基因青蒿的基因漂移距離為29.2m。

通過(guò)基因工程提高青蒿中青蒿素的含量時(shí)，使參與青蒿素生物合成的限速酶基因進(jìn)行過(guò)量表達(dá)是必不可少的，在提高了青蒿素產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因青蒿植物中，CYP71AV1和CPR基因進(jìn)行了過(guò)量表達(dá)，然而，轉(zhuǎn)基因青蒿對(duì)于環(huán)境的影響是未知的，因此，本發(fā)明從農(nóng)藝性狀、抗逆性以及基因漂移等幾個(gè)方面，來(lái)探討轉(zhuǎn)基因青蒿GYR和野生型受體是否具有相似的生存競(jìng)爭(zhēng)能力。

本發(fā)明中，依據(jù)個(gè)案分析原則，設(shè)置了形態(tài)學(xué)農(nóng)藝性狀差異性比較、耐鹽性、耐旱性、耐除草劑、越冬能力，以及基因漂移方法測(cè)定，系統(tǒng)的評(píng)價(jià)了轉(zhuǎn)基因青蒿的環(huán)境釋放后帶來(lái)的問(wèn)題，設(shè)置的參數(shù)涵蓋了轉(zhuǎn)基因青蒿和其野生型受體差異性的各指標(biāo)，為轉(zhuǎn)基因青蒿的環(huán)境釋放建立了模型，在說(shuō)明兩者實(shí)質(zhì)等同性上具有重要意義，評(píng)估結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)基因青蒿和其野生型受體具有實(shí)質(zhì)等同性，為其商業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

青蒿是異花授粉植物且自交的不親和性，使得外源基因是很容易被檢測(cè)出來(lái)。因此，轉(zhuǎn)基因和傳統(tǒng)植物之間的基因漂移應(yīng)該同時(shí)評(píng)估。

本發(fā)明的評(píng)估方法中，在基因漂移方法的測(cè)定中，將轉(zhuǎn)基因青蒿植株作為一個(gè)花粉源栽培在圓圈中，可以有效捕捉由于風(fēng)力或昆蟲(chóng)的攜帶等帶來(lái)的各個(gè)方向的基因漂移，在監(jiān)測(cè)基因漂移距離上有很好的示范作用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因青蒿和其野生型受體的形態(tài)學(xué)差異性、生存競(jìng)爭(zhēng)能力、以及基因漂移等幾個(gè)方面進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為轉(zhuǎn)基因藥用植物青蒿的環(huán)境安全評(píng)價(jià)平臺(tái)的建立提供了參考。

本發(fā)明涵蓋了轉(zhuǎn)基因青蒿從實(shí)驗(yàn)室層次進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)的環(huán)境釋放這個(gè)必經(jīng)過(guò)程，并且，在進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)的過(guò)程中，遵從了轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全評(píng)價(jià)的原則。即進(jìn)一步評(píng)價(jià)了轉(zhuǎn)基因青蒿對(duì)環(huán)境的影響；又根據(jù)個(gè)案分析原則，評(píng)價(jià)了其形態(tài)學(xué)農(nóng)藝性狀差異性、與環(huán)境適應(yīng)能力、生存競(jìng)爭(zhēng)能力、成為雜草的可能性以及其外源基因遺傳物質(zhì)向其他植物發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性及其后果。為其它轉(zhuǎn)基因植物的安全性評(píng)價(jià)體系的建立，提供了有益的參考模型，旨在為轉(zhuǎn)基因青蒿環(huán)境安全性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)基因青蒿與野生型受體青蒿的株高評(píng)價(jià)結(jié)果。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)基因青蒿與野生型受體青蒿的莖粗評(píng)價(jià)結(jié)果。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)基因青蒿與野生型受體青蒿的冠幅評(píng)價(jià)結(jié)果。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)基因青蒿與野生型受體青蒿的發(fā)芽率評(píng)價(jià)結(jié)果。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)基因青蒿與野生型受體青蒿的葉片干重評(píng)價(jià)結(jié)果。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)基因青蒿與野生型受體青蒿的種子千粒重評(píng)價(jià)結(jié)果。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)基因青蒿與野生型受體青蒿的鹽脅迫下葉片含水量的測(cè)定結(jié)果。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)基因青蒿與野生型受體青蒿的鹽脅迫下過(guò)氧化物酶含量的測(cè)定結(jié)果。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)基因青蒿與野生型受體青蒿的鹽脅迫下丙二醛的測(cè)定結(jié)果。

圖10為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)基因青蒿與野生型受體青蒿的鹽脅迫下脯氨酸含量的測(cè)定結(jié)果。

圖11為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)基因青蒿與野生型受體青蒿的干旱脅迫下脯氨酸含量的測(cè)定結(jié)果。

圖12為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)基因青蒿與野生型受體青蒿的干旱脅迫下復(fù)葉數(shù)差值的測(cè)定結(jié)果。

圖13為本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)基因青蒿與野生型受體青蒿的干旱脅迫下株高差值的測(cè)定結(jié)果。

圖14為本發(fā)明實(shí)施例中的基因漂移種植圖。

圖15為本發(fā)明實(shí)施例中的外源基因漂移點(diǎn)電泳圖。

圖16為本發(fā)明實(shí)施例中的基因漂移距離頻率圖。

圖17為本發(fā)明實(shí)施例中的基因漂移距離圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

轉(zhuǎn)基因青蒿GYR品系由上海交通大學(xué)的唐克軒教授友情提供，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的青蒿由唐教授的實(shí)驗(yàn)室采自重慶(Wang et al.,2012)，并且，野生型受體的青蒿野生型受體被用作對(duì)照。

轉(zhuǎn)基因青蒿GYR和野生型受體種于在上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院的白鶴轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境釋放試驗(yàn)基地，對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)部授權(quán)的。該基地位于上海的西北部青浦地區(qū)。它有亞熱帶季風(fēng)氣候，四季分明，充足的日照和雨量，適合青蒿植株的生長(zhǎng)。該基地周圍有混凝土墻，確保物理隔離。

溫室部分在上海農(nóng)業(yè)部的轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心進(jìn)行試驗(yàn)，并且溫度維持在25℃。土壤介質(zhì)包含比例為7：2：1的有機(jī)質(zhì)、蛭石和珍珠巖。在這個(gè)溫室中沒(méi)有其它的轉(zhuǎn)基因植物。整個(gè)實(shí)驗(yàn)室由一名保安進(jìn)行監(jiān)督，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后燒毀所有的實(shí)驗(yàn)材料。

實(shí)施例一種轉(zhuǎn)基因青蒿的環(huán)境安全評(píng)價(jià)方法，包括以下步驟：

1.準(zhǔn)備農(nóng)藝性狀評(píng)估用實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地

按照中國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)估法規(guī)，青蒿被種植在一個(gè)矩形實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地中，覆蓋面積約0.3公頃，其中長(zhǎng)100m，寬30m；野生型受體玉米被種植在每個(gè)區(qū)域的周圍用來(lái)隔離GYR和野生型受體；所有植物在相應(yīng)區(qū)域根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行栽培，每個(gè)區(qū)域約種2304株(行間距為1.25m)。

2.檢測(cè)農(nóng)藝性狀

轉(zhuǎn)基因青蒿GYR和野生型受體在溫室生長(zhǎng)2個(gè)月，然后移植至大田內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng)，移植后，對(duì)死亡幼苗的數(shù)量進(jìn)行計(jì)算。移植三個(gè)月后，對(duì)轉(zhuǎn)基因青蒿GYR和野生型受體植株的生長(zhǎng)和形態(tài)進(jìn)行比較，記錄其株高、冠幅、莖粗、發(fā)芽率、葉片干重、千粒重和葉片形狀，具體如下：

2.1株高、冠幅和莖粗

對(duì)青蒿的田間試驗(yàn)，采用一個(gè)完全隨機(jī)區(qū)組的單因素設(shè)計(jì)。在每個(gè)區(qū)域中隨機(jī)抽取40株青蒿，用來(lái)確定營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)早期和中期階段(兩個(gè)階段間隔1個(gè)月)的株高、冠幅和莖粗。

兩種青蒿在田間環(huán)境下移栽后基本上都順利成活，移栽存活率無(wú)顯著差異。轉(zhuǎn)基因青蒿GYR品系移栽后的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程與其野生型受體相似，均可分為緩苗期、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)盛期、花芽分化與初蕾期、盛蕾與初花期、盛花期和結(jié)實(shí)期6個(gè)階段。

兩種青蒿在八月份九月份生長(zhǎng)最快，在青蒿營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)后期，株高、冠幅、莖粗均快速增長(zhǎng)，參見(jiàn)圖1-圖3。

由圖1-圖3可以看出，GYR的株高顯著高于野生型受體，莖粗顯著低于其野生型受體。然而，這兩個(gè)品種的生長(zhǎng)趨勢(shì)是一致的。

2.2發(fā)芽率

發(fā)芽率的測(cè)定過(guò)程為：將兩種青蒿品種的種子先用洗滌劑洗，再用蒸餾水徹底沖洗，轉(zhuǎn)基因青蒿和野生型受體青蒿各取100粒種子，播種在裝有基質(zhì)的托盤中(所述基質(zhì)為：土壤：蛭石：珍珠巖＝7：3：1)，另取100粒種子播種在蒸餾水中，并且，還有100粒種子播種在無(wú)菌培養(yǎng)基中。在25℃培養(yǎng)7天后，用下式計(jì)算不同發(fā)芽環(huán)境下每個(gè)品種的發(fā)芽率：

種子發(fā)芽率(％)＝(發(fā)芽種子數(shù)/全部種子數(shù))×100。

結(jié)果參見(jiàn)圖4，可見(jiàn)，三種方式的發(fā)芽試驗(yàn)中無(wú)菌培養(yǎng)發(fā)芽率最低，水培和土培高于無(wú)菌發(fā)芽方式，均在85％以上。但同一種培養(yǎng)方式下，轉(zhuǎn)基因青蒿的發(fā)芽率與其受體的發(fā)芽率相似的，無(wú)差異性。

2.3葉片干重

葉片干重的測(cè)定為：在開(kāi)花階段，隨機(jī)挑選10片植物頂端的葉片，然后放在105℃烘箱中0.5h，迅速烘干水分。最后，葉片在70℃被干燥得到一個(gè)恒定的重量，并記錄這一干重?cái)?shù)，這個(gè)步驟重復(fù)3次，參見(jiàn)圖5。

由圖5可見(jiàn)，兩種植物的葉片干重有明顯的差異，GYR葉片干重遠(yuǎn)高于野生型受體，可能是由于GYR葉片較肥厚且大的原因造成的。兩種類型的青蒿葉片形狀均為三回櫛齒狀羽狀分裂，并且葉片的形態(tài)學(xué)沒(méi)有改變。

2.4千粒重

為了比較種子的千粒重，將30株植物的種子收集起來(lái)進(jìn)行測(cè)定，因?yàn)榍噍锏姆N子太小以至于很難收集，故使用20目的篩網(wǎng)進(jìn)行雜質(zhì)過(guò)濾，再進(jìn)行沖洗，最后進(jìn)行千粒重?cái)?shù)測(cè)，參見(jiàn)圖6。

由圖6可知，兩株植物間的千粒重并無(wú)明顯差異。

農(nóng)藝性狀測(cè)試結(jié)果說(shuō)明，轉(zhuǎn)基因青蒿GYR和傳統(tǒng)的野生型受體植物間在形態(tài)學(xué)(株高，冠幅，莖粗)方面沒(méi)有明顯的不同，可以推斷插入的基因沒(méi)有改變青蒿的農(nóng)藝性狀。

3.測(cè)試抗逆性

在在溫室中進(jìn)行抗逆性實(shí)驗(yàn)，對(duì)轉(zhuǎn)基因青蒿進(jìn)行鹽脅迫、干旱脅迫、除草劑耐受性以及越冬能力測(cè)定，同時(shí)，以野生型受體青蒿作對(duì)照，具體如下：

3.1鹽脅迫測(cè)試

設(shè)置五個(gè)脅迫組，每組6個(gè)植株，在植株5周時(shí)開(kāi)始，用添加了NaCl的鹽溶液進(jìn)行澆灌，濃度為0，0.4，0.8，1.2和1.6％(w/w)，9天之后，用下述公式對(duì)兩組脅迫中的植物葉片的相對(duì)含水量進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果參見(jiàn)圖7：

葉片相對(duì)含水量(％)＝[(鮮重-干重)/鮮重]×100。

從圖7可以看出，轉(zhuǎn)基因青蒿GYR和野生型受體兩種青蒿葉片的相對(duì)含水量(RWC)均比較高，范圍在94％～87％內(nèi)。增加鹽濃度，相對(duì)含水量沒(méi)有改變。用濃度0.8％(W/W)NaCl處理時(shí)，兩種青蒿葉片的葉片含水量最低，然而，鹽脅迫1.6％(W/W)時(shí)，GYR較野生型受體高。相對(duì)含水量的結(jié)果和葉片干重相吻合。

由此說(shuō)明，鹽處理使這兩種青蒿均產(chǎn)生了一定的生理脅迫。大部分青蒿的葉片呈現(xiàn)出不同程度的萎蔫現(xiàn)象。兩種葉片的含水量在鹽脅迫下均無(wú)差異性。

過(guò)氧化物酶(POD)活性、游離脯氨酸和丙二醛(MDA)含量也被測(cè)定，測(cè)定結(jié)果參見(jiàn)圖8-圖10。

圖8中，隨著NaCl濃度的升高，兩種轉(zhuǎn)基因青蒿POD含量出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在1.2％NaCl時(shí)，POD含量最高，并且GYR的POD含量明顯低于野生型受體植物的含量(高達(dá)4600OD mg^-1.FW.min^-1)。然而，當(dāng)NaCl低于0.4％時(shí)，GYR青蒿的POD含量顯著高于野生型受體。

從圖9可以看出，兩種轉(zhuǎn)基因青蒿的MDA含量出現(xiàn)先逐漸上升的趨勢(shì)，然而沒(méi)有明顯的差異，其中1.6％的NaCl脅迫時(shí)MDA含量是無(wú)脅迫的2.5倍，兩種青蒿葉片的MDA含量差異極顯著(P＜0.001)。這可能與模式過(guò)氧化程度不一樣相關(guān)。

脯氨酸能夠提高植物的吸水能力，這是植物在逆境下的一種自我調(diào)節(jié)機(jī)制，但是，當(dāng)鹽濃度超過(guò)其自身調(diào)節(jié)范圍，其植物體內(nèi)的平衡也將打破，從而導(dǎo)致植物萎蔫。

由圖10可見(jiàn)，兩種轉(zhuǎn)基因青蒿的脯氨酸含量出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。兩種青蒿在沒(méi)有鹽脅迫時(shí)，雖然GYR的脯氨酸含量高于野生型受體，但差異并不顯著。鹽脅迫存在時(shí)，觀察到的結(jié)果相反。在0.4-1.6％Nacl時(shí)，GYR脯氨酸的含量低于野生型受體，并且，當(dāng)NaCl增加到1.6％時(shí)明顯不同。

3.2干旱脅迫測(cè)試

因PEG6000的分子量大，從而很難被完好無(wú)損的根系吸收，因此是干旱脅迫試驗(yàn)中常用的脅迫劑，本實(shí)施例測(cè)定了在PEG模擬干旱脅迫下葉片脯氨酸的含量。

選取5周齡的植物來(lái)評(píng)估干旱脅迫影響，PEG6000添加到營(yíng)養(yǎng)液中誘導(dǎo)干旱脅迫，每個(gè)青蒿品種的6株植物被濃度分別為0g/L、50g/L、100g/L、150g/L和300g/L的PEG6000進(jìn)行脅迫，對(duì)干旱脅迫植物的游離脯氨酸含量、植物株高和復(fù)葉數(shù)差值行了測(cè)量，參見(jiàn)圖11-圖13。

由圖11可以看出，在無(wú)PEG脅迫時(shí)，GYR的脯氨酸含量高于野生型受體，差異不顯著。在PEG脅迫5天后，隨著PEG濃度的增加，青蒿葉片中的脯氨酸含量只有少許增加。15天后，脯氨酸整體水平升高，高濃度的PEG脅迫，脯氨酸含量升高顯著。其中，PEG濃度為300g/L時(shí)，GYR的脯氨酸含量高于野生型受體，但并不顯著(P>0.05)，且是200g/L野生型受體的2.7倍。15-25天期間，脯氨酸含量變化不明顯。25d時(shí)，在300g/L PEG脅迫下，GYR葉片的脯氨酸含量達(dá)到532.598μg/g(W/FW)，是未受脅迫時(shí)的7.97倍。在野生型受體植物中，高達(dá)8.51倍。整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)期，兩種葉片的脯氨酸含量差異均不顯著。

高濃度PEG(300g/L)處理25d后，可以明顯看到植株底部的葉片出現(xiàn)葉片發(fā)黃、卷縮、枝干萎縮的現(xiàn)象，甚至底部枯死。但是低中濃度PEG(100和200g/L)處理后，并未顯著影響青蒿的生長(zhǎng)，說(shuō)明青蒿是一種較為耐旱的植物。

圖12-圖13顯示，沒(méi)有脅迫時(shí)，兩種青蒿植物表現(xiàn)出了相似的株高差值和復(fù)葉數(shù)差值，并都能夠保持自己的平衡。隨著PEG濃度的增加，株高差值表現(xiàn)出不同，生物量與復(fù)葉也不同。然而，在脅迫耐受性中轉(zhuǎn)基因青蒿GYR沒(méi)有表現(xiàn)出比野生型受體更強(qiáng)的生長(zhǎng)勢(shì)，并且沒(méi)有顯著差異。當(dāng)PEG濃度增加到300g/L時(shí)，株高和復(fù)葉增量下降。

3.3除草劑耐性

兩種除草劑購(gòu)買于先正達(dá)公司(上海，中國(guó))，非選擇性除草劑百草枯和選擇性芽前除草劑金都爾，用在青蒿的幼葉時(shí)期(真葉數(shù)≥15)。將百草枯噴到5周齡的植物上，金都爾被噴灑到播種3天后的GYR和野生型受體上。

在噴灑百草枯兩小時(shí)內(nèi)，所有的轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植物都被殺死。金都爾是選擇性的芽前除草劑，并且在種子萌發(fā)前噴灑。兩種青蒿都沒(méi)有發(fā)芽，然而，沒(méi)有噴灑金都爾的對(duì)照組青蒿發(fā)芽，并且幼苗長(zhǎng)勢(shì)很好。不管是否噴灑金都爾，轉(zhuǎn)基因和對(duì)照植物的表現(xiàn)是相似的，這表明，對(duì)于兩種常見(jiàn)的除草劑，轉(zhuǎn)基因組和對(duì)照組的耐受性是相同的。

3.4越冬能力觀察

在冬季，將轉(zhuǎn)基因青蒿和野生型受體青蒿種子播種在室外(最低溫度-8℃)，進(jìn)行越冬性實(shí)驗(yàn)觀察，比較下一代幼苗的生存率和在冬季生存的競(jìng)爭(zhēng)力。

盡管GYR的越冬能力稍弱于野生型受體植物，但可以在上海的初冬環(huán)境下順利越冬(2℃-5℃)。這可以說(shuō)明插入的基因?qū)η噍锏脑蕉芰](méi)有影響。

4.測(cè)試基因漂移

在長(zhǎng)80m，寬50m的矩形實(shí)驗(yàn)場(chǎng)內(nèi)進(jìn)行基因漂移實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)基因青蒿種植于中心點(diǎn)及其5個(gè)同心圓中，同心圓的半徑從內(nèi)到外以1.2m逐個(gè)增加，其余面積用來(lái)種植青蒿野生型受體植株，當(dāng)青蒿被種植后，將玉米種植在實(shí)驗(yàn)場(chǎng)區(qū)的周圍作為物理隔離區(qū)，參見(jiàn)圖14。

在野生型受體青蒿種植區(qū)內(nèi)，沿同心圓的8個(gè)方向設(shè)置98個(gè)測(cè)試點(diǎn)，呈米字形，一個(gè)方向上設(shè)置8～14個(gè)測(cè)試點(diǎn)，其中，測(cè)試點(diǎn)1～5之間每?jī)牲c(diǎn)間隔0.8m，測(cè)試點(diǎn)6～10之間每?jī)牲c(diǎn)間隔2.4m，測(cè)試點(diǎn)11～14之間每?jī)牲c(diǎn)間隔4.8米，參見(jiàn)表1。

采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)用SPSS 16.0和GraphPadPrism v5.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。

測(cè)試種子發(fā)芽率：收獲各測(cè)試點(diǎn)的青蒿種子，青蒿種子收獲自植物的頂部，中部和更低的地方，將每個(gè)點(diǎn)上收獲的種子混合并帶到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)分析。

從試驗(yàn)地點(diǎn)隨機(jī)抽取100粒種子，在培養(yǎng)皿中萌發(fā)。重復(fù)3次，10天后，用SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，參見(jiàn)表2。

從表2中可以看出，發(fā)芽率比較均勻，且相對(duì)較高，可能是新采收種子營(yíng)養(yǎng)充分，具有較高的發(fā)芽率，整個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均發(fā)芽率為82.7％。

測(cè)試卡那霉素抗性：對(duì)于每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，將發(fā)芽后的種子隨機(jī)選取100棵放入帶有卡那霉素的1/2MS(Murashige和Skoog)培養(yǎng)基中，進(jìn)行苗期抗性篩選鑒定試驗(yàn)。在對(duì)卡那霉素抗性濃度由25-150mg/L篩選后，發(fā)現(xiàn)100mg/L的濃度對(duì)青蒿具有較好的選擇性，故選用100mg/L作為篩選濃度，將發(fā)芽的100棵青蒿幼苗放入1/2MS固體培養(yǎng)基上3d后，幼苗出現(xiàn)不同程度的變黃，6d后，葉子邊緣開(kāi)始出現(xiàn)枯死，10d時(shí)最終整株腐爛，可以斷定枯死的幼苗為野生型受體幼苗。統(tǒng)計(jì)每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)100棵中未枯死幼苗數(shù)量(統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3)，得到卡那霉素抗性篩選后成活率。

通過(guò)PCR進(jìn)行分子鑒定：存活的抗卡那霉素的植株被移植到穴盤壯苗，生長(zhǎng)20天后，從每株幼苗上選取3-5片葉片進(jìn)行DNA提取，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物條帶580bp，即為轉(zhuǎn)基因青蒿，參見(jiàn)圖15和表4。

當(dāng)花粉源的距離增加時(shí)，在轉(zhuǎn)基因青蒿中的外源基因漂移頻率迅速下降，基因漂移距離急劇下降，轉(zhuǎn)基因青蒿GYR品系的基因漂移頻率隨距離的增加呈線性下降，參見(jiàn)圖16-17。

由圖16可以看出，在6.8m處基因漂移頻率最大，為2.5％，下風(fēng)口(西方)只有在距離花粉源24.4m處(C-10)能夠檢測(cè)出，但到達(dá)29.2m處時(shí)則任何一個(gè)方向均不能檢測(cè)到基因漂移。

圖17中，測(cè)試點(diǎn)C-11的基因漂移是最高的，比頻率最低的測(cè)試點(diǎn)G-3高7倍，這和秋季上海青浦地區(qū)經(jīng)常刮東北風(fēng)有關(guān)。

由于在距離24.4m的點(diǎn)可以檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因青蒿，29.2m處則不能檢測(cè)到，因此，可以推出轉(zhuǎn)基因青蒿GYR品系最遠(yuǎn)漂移距離為24.4m。

通過(guò)本發(fā)明，可以得知，隨著轉(zhuǎn)基因花粉源的距離增加，空氣中花粉的密度逐漸降低，同時(shí)，野生型受體花粉源的存在大大稀釋了轉(zhuǎn)基因花粉源，這也可能導(dǎo)致基因漂移頻率快速下降。此外，一些物理因素也可以影響基因漂移頻率，包括花粉的運(yùn)動(dòng)，風(fēng)向，風(fēng)速和縱向分散系數(shù)。

同時(shí)，在不同的方向，基因漂移的頻率是不同的，轉(zhuǎn)基因青蒿可以被栽培在下風(fēng)口或者使用隔離區(qū)隔離，以限制基因漂移。

此外，可以通過(guò)調(diào)整轉(zhuǎn)基因和野生型受體植物的開(kāi)花期，使這兩種植物不同時(shí)開(kāi)花，大大減少發(fā)生基因漂移的可能性，對(duì)于轉(zhuǎn)基因青蒿的大規(guī)模商業(yè)化種植，需要使用物理和生物的隔離來(lái)防止花粉的傳播。