一種植物源鼠類復(fù)合不育劑的制備方法與流程

本發(fā)明涉及一種鼠類不育劑及制備方法，特別是涉及一種鼠類不育劑農(nóng)大-1號(hào)的制備方法，屬于藥物復(fù)方技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

不育控制是國(guó)際上興起的控制害鼠新技術(shù)之一，其原理是通過減少鼠類的繁殖以控制鼠類種群數(shù)量。通過模型，發(fā)現(xiàn)在1萬只鼠類群體中，如連續(xù)3代，殺滅70％的個(gè)體，其種群經(jīng)過26代后仍可恢復(fù)到原有水平；但若使70％的個(gè)體連續(xù)3代不育，經(jīng)過19代則可使種群滅絕。因此，使用不育控制比傳統(tǒng)的滅鼠更能達(dá)到防治的目的。不育控制還具有操作安全及不易對(duì)環(huán)境造成污染等特點(diǎn)。當(dāng)前，我國(guó)已在不育劑的篩選、藥效作用、藥理機(jī)制等方面進(jìn)行大量的探索，并取得令人矚目的成效。

鑒于傳統(tǒng)化學(xué)滅鼠措施會(huì)產(chǎn)生超補(bǔ)償生殖作用(breeding compensation effect)，使用不育劑來控制鼠害已成為當(dāng)今學(xué)者研究的熱點(diǎn)。不育控制即借助某種技術(shù)和方法使鼠類的雄性或雌性絕育，或阻礙胚胎著床發(fā)育，甚至使幼體阻斷生長(zhǎng)發(fā)育，以降低其生育率，從而達(dá)到降低種群數(shù)量的目的，實(shí)質(zhì)上就是通過控制生育率來控制鼠類。因此，與傳統(tǒng)的滅鼠方法相比，使用有效的不育技術(shù)更可能達(dá)到有效防治鼠害的目的，且具有操作安全，不易對(duì)環(huán)境造成污染，成本低和效果持久等優(yōu)點(diǎn)。

鼠類不育控制在國(guó)內(nèi)外已有較多的研究，取得了一些成果，主要集中在對(duì)不育劑的篩選、實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)以及對(duì)部分野生種群的初步控制應(yīng)用方面，理論上主要以生態(tài)學(xué)模型探討不育控制下害鼠種群動(dòng)態(tài)規(guī)律。而科學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)集中在如何選擇出無污染、無公害環(huán)保型的不育劑，并且對(duì)害鼠種群數(shù)量能夠?qū)崿F(xiàn)可持續(xù)的控制。植物源不育劑成為了主要選擇對(duì)象。國(guó)內(nèi)也已將雷公藤、棉酚、蕓香、油茶皂素、蓖麻油、天花粉、秋水仙素、蓖麻、莪術(shù)醇、印楝油等植物源不育劑應(yīng)用于害鼠的不育控制，均具有一定的效果，但是均不理想。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過提取新疆紫草(Arnebia euchroma)根的提取物紫草素(Shikonin)與雌激素炔雌醚(Quinestrol)進(jìn)行混合，從而制備出一種效果顯著且能夠可持續(xù)控制小型鼠類繁殖的復(fù)合藥劑。

一種鼠類不育劑農(nóng)大-1號(hào)的制備方法，其特征在于，所述不育劑由下述原料制成：紫草素100重量份，炔雌醚10重量份，所述不育劑的紫草素、炔雌醚按比例混合均勻，按照用量配比加入食用油，加熱到30℃-35℃搖勻20分鐘，靜置10分鐘，得到所述不育劑。

進(jìn)一步，所述制備方法包括：所述紫草素來源于新疆紫草的根，并且利用有機(jī)溶劑石油醚提取。

進(jìn)一步，所述石油醚的用量為所述中藥原料重量的10倍。

進(jìn)一步，所述石油醚的溫度為50℃，提取時(shí)間為1小時(shí)。

進(jìn)一步，所述石油醚第一次提取后，提取液分出，重新加入與第一次等量的石油醚進(jìn)行二次提取，重復(fù)上述提取的制備方法。

進(jìn)一步，向得到的所述石油醚提取液中加入2％氫氧化鈉，在40℃下，轉(zhuǎn)化1小時(shí)。

進(jìn)一步，1小時(shí)后，加入濃鹽酸至產(chǎn)生沉淀，靜置2小時(shí)。

進(jìn)一步，沉淀用蒸餾水洗至中性，在50℃下烘干。

進(jìn)一步，使用HZ-806大孔吸附樹脂吸附。

進(jìn)一步，在分離柱內(nèi)，加入HZ-g06大孔吸附樹脂及相當(dāng)于其體積0.4-0.5倍的95％乙醇，浸泡24小時(shí)。

進(jìn)一步，24小時(shí)后，用二倍柱體積的95％乙醇流過柱子，用蒸餾水沖洗流出液至pH值中性，再用5％鹽酸、2％氫氧化鈉溶液重復(fù)上一步所述的制備方法。

進(jìn)一步，將權(quán)利要求9所述的制備方法的產(chǎn)物，用95％乙醇制成溶液，pH值為5.9，用處理過的HZ-806樹脂吸附后再用丙酮以3BV/h的流速進(jìn)行解吸，解吸液真空濃縮，得到純化的紫草素中藥純品。

進(jìn)一步，丙酮作為洗脫液與樣液的量的比例為2∶1。

具體地，本發(fā)明提供的不育劑中，各藥材組分的作用機(jī)制為：

紫草素：味苦、寒，具有涼血，活血，清熱，解毒。治溫?zé)岚哒睿瑵駸狳S疸，紫癜，燒傷，濕疹，丹毒等功效。具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗生育等作用。亦可用于藥物、化妝品著色劑。

炔雌醚：炔雌醚(炔雌醇環(huán)戊醚)為長(zhǎng)效雌激素。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述不育劑各組分的含量為：紫草素100重量份，炔雌醚10重量份。

本發(fā)明提供的不育劑中，發(fā)明人通過研究各藥材組分的合理配比、協(xié)同作用，使得采用本發(fā)明提供的不育劑制備得到的藥物合劑在控制小型鼠類生育方面具有良好的效果。

為了使本發(fā)明所解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例證，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例證僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

附圖說明

附圖1為不同濃度實(shí)驗(yàn)組雌性小鼠子宮臟器系數(shù)。

附圖2為不同濃度實(shí)驗(yàn)組雄性小鼠的精囊腺臟器系數(shù)。

附圖3為不同濃度實(shí)驗(yàn)組雄性小鼠的精子密度。

附圖4為不同濃度實(shí)驗(yàn)組雄性小鼠的睪丸臟器系數(shù)。

附圖5為不同處理組小鼠第一次繁殖幼仔數(shù)。

附圖6為不同處理組小鼠第二次繁殖幼仔數(shù)。

附圖7為不同處理組小鼠繁殖啟動(dòng)期。

附圖8為子午沙鼠種群第一胎產(chǎn)仔數(shù)比較。

附圖9為午沙鼠種群第二胎產(chǎn)仔數(shù)比較。

附圖10為午沙鼠種群第三胎產(chǎn)仔數(shù)比較。

附圖11為子午沙鼠種群繁殖胎數(shù)比較。

附圖12為子午沙鼠種群繁殖啟動(dòng)期比較。

附圖13為紫草素提取、轉(zhuǎn)化、純化的流程圖。

圖中，Control為對(duì)照組，F(xiàn)-Treatment為雌性處理組，M-Treatment為雄性處理組。

具體實(shí)施方式

實(shí)際應(yīng)用，例1，紫草素對(duì)小白鼠繁殖的影響

為明確植物提取物紫草素的抗生育作用，以昆明小白鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，首先分4組，每組15對(duì)，其中1組為對(duì)照組，其余3組分別以5mg/kg、20mg/kg和50mg/kg濃度紫草素進(jìn)行灌胃給藥。解剖并測(cè)定雌性子宮、雄性精囊腺、睪丸等3項(xiàng)臟器系數(shù)和精子密度共4項(xiàng)指標(biāo)。其次，選擇紫草素1種理想濃度進(jìn)行繁殖實(shí)驗(yàn)，將新選小鼠分為4組，每組15對(duì)，對(duì)照組1組，其余3組設(shè)3種不同處理，雄性處理組，雌性處理組和雌雄處理組，處理組灌胃給藥后進(jìn)行繁殖實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：50mg/kg紫草素濃度實(shí)驗(yàn)組的雌性子宮臟器系數(shù)極顯著低于對(duì)照組和其余2個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組(F＝6.29，P＜0.01)，子宮出現(xiàn)明顯萎縮，雄性精囊腺臟器系數(shù)、精子密度均顯著低于對(duì)照組(F＝6.49，P＜0.01；F＝4.60，P＜0.05)，50mg/kg紫草素濃度具有抗生育的預(yù)期效果；小鼠繁殖實(shí)驗(yàn)表明，50mg/kg紫草素濃度顯著降低了雌性處理組和雌雄處理組的出生率，雌性和雄性的繁殖啟動(dòng)期均顯著延遲，將有效降低小鼠整個(gè)繁殖期的繁殖率。

材料

紫草索(Shikonin，分子式C₁₆H₁₆O₅，analytical standard≥97％，分子量288.30)為新疆紫草提取物。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為成年昆明小白鼠，體重33.1-44.6g。

方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

成年小白鼠在常溫下養(yǎng)殖，給予足夠飼料和水，發(fā)育正常。實(shí)驗(yàn)小白鼠分4組，每組15對(duì)，其中1組為對(duì)照組，其余3組分別以5mg/kg、20mg/kg和50mg/kg濃度紫草素進(jìn)行灌胃，紫草素以食用油溶解，每只鼠單次灌胃油溶紫草素為0.2ml，1周灌胃2次，間隔3天，對(duì)照組以相同量食用油灌胃。最后1次灌胃后1周進(jìn)行解剖，測(cè)定雌性子宮臟器系數(shù)、雄性精囊腺臟器系數(shù)、精子密度和睪丸臟器系數(shù)等4項(xiàng)指標(biāo)。臟器系數(shù)用以下公式計(jì)算：

選擇理想紫草素濃度進(jìn)行繁殖實(shí)驗(yàn)，新選取小鼠4組，每組15對(duì)，其中對(duì)照組1組，實(shí)驗(yàn)組3組，設(shè)3種不同處理：雄性處理組(雄性給藥，雌性不給藥)，雌性處理組(雌性給藥，雄性不給藥)，雌雄處理組(雌、雄都給藥)。實(shí)驗(yàn)組以理想濃度紫草素1周灌胃2次，間隔3天，對(duì)照組以相同量食用油灌胃，最后1次灌胃1周后進(jìn)行合籠，記錄小白鼠繁殖情況。

小鼠精子密度測(cè)定

在光學(xué)顯微鏡下，采用紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，在1mm²的計(jì)數(shù)室中，計(jì)數(shù)25個(gè)方格中四周和中央共5個(gè)方格中的精子數(shù)量。計(jì)算方法：

精子密度(精子總數(shù)/ml)＝精子數(shù)×稀釋倍數(shù)×5mm²×10um×1000ul

數(shù)據(jù)處理

采用SAS9.0單因子方差分析(One-way ANOVA)對(duì)不同處理小鼠雌性子宮臟器系數(shù)、雄性精囊腺、睪丸臟器系數(shù)和精子密度進(jìn)行比較分析，對(duì)各組雌鼠新生幼仔數(shù)進(jìn)行比較分析。結(jié)果與分析

紫草素對(duì)小鼠繁殖器官的影響

5mg/kg、20mg/kg和50mg/kg三個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的雌性子宮臟器系數(shù)、雄性精囊腺臟器系數(shù)、精子密度和睪丸臟器系數(shù)的對(duì)比分析結(jié)果如圖1-4。由圖2可知，雌性子宮臟器系數(shù)50mg/kg濃度實(shí)驗(yàn)組極顯著低于對(duì)照組和其余2個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組(F＝6.29，P＜0.01)。從解剖結(jié)果來看，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠的子宮在外形上沒有發(fā)現(xiàn)如變黑、水腫、充血等器質(zhì)性變化和病變，經(jīng)檢測(cè)子宮臟器系數(shù)，只有50mg/kg濃度實(shí)驗(yàn)組與其余3組存在極顯著差異，即50mg/kg濃度實(shí)驗(yàn)組子宮出現(xiàn)明顯萎縮。由圖2-3可知，50mg/kg濃度實(shí)驗(yàn)組雄性小鼠精囊腺臟器系數(shù)、精子密度均顯著低于對(duì)照組(F＝6.49，P＜0.01；F＝4.60，P＜0.05)。由圖4可知，不同濃度實(shí)驗(yàn)組雄性小鼠的睪丸臟器系數(shù)與對(duì)照組均沒有顯著差異(F＝1.09，P＞0.05)。上述結(jié)果表明，50mg/kg紫草素濃度具有抗生育作用的預(yù)期效果。

紫草素對(duì)小鼠繁殖的影響

我們選擇50mg/kg濃度紫草素作為理想濃度不育劑，重新選擇小鼠進(jìn)行繁殖實(shí)驗(yàn)對(duì)比。小鼠分為4組，其中1個(gè)對(duì)照組，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組15對(duì)。實(shí)驗(yàn)組分別為：雌性處理組(雄性不給藥)，雄性處理組(雌性不給藥)，雌雄都處理組(雌、雄都給藥)。對(duì)每組出生的新個(gè)體數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析結(jié)果如圖5。由圖5可知，從第一次出生的幼體數(shù)量來看，對(duì)照組與雄性處理組差異不顯著，并且此2組與雌性處理組和雌雄處理組差異極顯著(F＝14.78，P＜0.001)，即后2個(gè)實(shí)驗(yàn)組出生的個(gè)體數(shù)顯著小于對(duì)照組和雄性處理組。而雌性處理組與雌雄處理組出生的個(gè)體數(shù)量差異不顯著。表明50mg/kg濃度紫草素顯著降低了雌性處理組和雌雄處理組的出生率。

小鼠第二次繁殖幼仔數(shù)如圖6。由圖中可知，繁殖幼體數(shù)量差異與第一次有所不同，對(duì)照組與雄性處理組差異不顯著，與雌性處理組和雌雄處理組差異極顯著(F＝4.23，P＝0.0103)，即后2個(gè)實(shí)驗(yàn)組出生的個(gè)體數(shù)顯著小于對(duì)照組，而雄性處理組與雌性處理組和雌雄處理組差異不顯著。因此，50mg/kg濃度紫草素持續(xù)有效降低了雌性處理組和雌雄處理組的出生率。

小鼠自雌雄合籠至第一窩幼仔出生為止的天數(shù)為繁殖啟動(dòng)期(王濤濤等，2015)。不同處理組小鼠的繁殖啟動(dòng)期如圖7。從繁殖啟動(dòng)期來看，3個(gè)處理組的均極顯著大于對(duì)照組(F＝11.83，P＜0.001)，即處理組的繁殖啟動(dòng)期均明顯推遲。雄性處理組和雌雄處理組與對(duì)照組的差異相當(dāng)，繁殖啟動(dòng)期比對(duì)照組平均推遲了10-12天。雌性處理組與對(duì)照組的差異最大，其繁殖啟動(dòng)期較對(duì)照組平均推遲了16天。第二窩幼體出生時(shí)間，雌性處理組和雄性處理組均比對(duì)照組推遲10-11天，而雌雄處理組比對(duì)照組推遲18-20天。這樣紫草素延長(zhǎng)了小鼠的繁殖周期，直接效果是相對(duì)降低了小鼠的年度繁殖次數(shù)和繁殖率。表明50mg/Kg濃度紫草素對(duì)雌、雄小鼠的正常繁殖過程形成了明顯干擾，對(duì)雌、雄小鼠均具有抗生育作用。

實(shí)際應(yīng)用，例2，本發(fā)明的不育劑對(duì)子午沙鼠繁殖的影響

將子午沙鼠(Meriones meridianus)分為3組，設(shè)對(duì)照組、雌性處理組和雄性處理組，對(duì)不育劑的作用效果進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明，年度繁殖期內(nèi)子午沙鼠第一次繁殖，雄性處理組的平均胎仔數(shù)顯著降低(F＝12.76，P＜0.01)，為1.42±0.12，抗生育率達(dá)到42.86％；第二次繁殖，雌性處理組和雄性處理組平均胎仔數(shù)均顯著降低(F＝11.71，P＜0.01)，分別為1.42±0.13和0.14±0.04，抗生育率分別達(dá)到57.14％和85.78％；年度內(nèi)對(duì)照組繁殖次數(shù)2-3次，2個(gè)處理組繁殖次數(shù)0-2次，均顯著低于對(duì)照組(F＝11.87，P＜0.01)；2個(gè)處理組的繁殖啟動(dòng)期明顯延遲，雌性處理組推遲15-22d，雄性處理組推遲32-157d。不育劑對(duì)兩性均起到了不育作用。

材料與方法

材料

紫草素(Shikonin，分子式C₁₆H₁₆O₅，analytucal standard≥97％，分子量288.30)為新疆紫草提取物，主要成分為萘醌類化合物；炔雌醚(Quinestrol，Assay 99.27％)由北京紫竹天工科技有限公司提供(產(chǎn)品遵守美國(guó)許可證書USP22.)；實(shí)驗(yàn)用子午沙鼠(Meriones meridianus)于2014年10月捕自內(nèi)蒙古阿拉善盟阿拉善左旗南部典型荒漠生境(E104°10′-105°30′，N37°24′-38°25′)。以40cm×40cm×60cm的鼠籠單獨(dú)飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)荒漠生態(tài)與鼠害控制研究基地實(shí)驗(yàn)室(位于當(dāng)?shù)?，通風(fēng)良好，自然光照，飼料充足自由取食。飼養(yǎng)5個(gè)月安全越冬后，于2015年4月選取健康和性成熟子午沙鼠雌雄各45只，共90只待用。

方法

藥物濃度及試鼠分組：選取濃度為100mg/kg紫草素與炔雌醚按照10∶1比例混合均勻，配制成以食用油為溶劑的紫草素-炔雌醚油溶液不育劑(15ml/kg)。實(shí)驗(yàn)鼠分為對(duì)照組、雌鼠處理組、雄鼠處理組，每組雌雄各15只，單獨(dú)飼養(yǎng)。體質(zhì)量62.78±10.07(SE)。雌鼠處理組一周內(nèi)間隔3天雌鼠灌胃兩次，最后一次灌胃后一周與正常雄鼠按1∶1比例合籠。同樣，雄鼠處理組一周內(nèi)間隔3天雄鼠灌胃兩次，最后一次灌胃后一周與正常雌鼠按1∶1比例合籠。對(duì)照組一周內(nèi)雌、雄鼠用等量食用油間隔3天灌胃兩次，最后一次灌胃后一周雌、雄鼠按1∶1比例合籠。

記錄指標(biāo)：實(shí)驗(yàn)鼠觀察期為4月-10月，在觀察期內(nèi)每天檢查記錄各組鼠的產(chǎn)仔日期、每胎產(chǎn)仔數(shù)和繁殖胎數(shù)。

數(shù)據(jù)分析：對(duì)每組繁殖胎數(shù)、每胎的產(chǎn)仔數(shù)、繁殖啟動(dòng)期差異均作單因素方差分析(the One-Way ANOVA)，數(shù)據(jù)采用SAS9.0軟件分析，顯著性水平P＜0.05。對(duì)子午沙鼠的抗生育率采用下式計(jì)算：

抗生育率＝對(duì)照組生育率-試驗(yàn)組生育率。

結(jié)果

第一胎產(chǎn)仔數(shù)比較

子午沙鼠第一胎繁殖胎仔數(shù)單因素方差分析結(jié)果如圖8。2個(gè)處理組與對(duì)照組同樣均出現(xiàn)了繁殖，各組繁殖的胎仔數(shù)不同，對(duì)照組平均胎仔數(shù)為4.28±0.72，雌性處理組平均胎仔數(shù)為3.71±0.28，雄性處理組平均胎仔數(shù)為1.42±0.12，2個(gè)處理組均低于對(duì)照組。雌性處理組與對(duì)照組差異不顯著，而雄性處理組的胎仔數(shù)與對(duì)照組和雌性處理組均差異極顯著(F＝12.76，P＜0.01)，即雄性處理組的胎仔數(shù)極顯著低于對(duì)照組和雌性處理組。說明不育劑對(duì)雄性的不育作用明顯高于雌性。雄性處理組抗生育率為42.86％。

第二胎產(chǎn)仔數(shù)比較

子午沙鼠種群第二胎繁殖的個(gè)體數(shù)方差分析結(jié)果如圖9。對(duì)照組平均胎仔數(shù)為3.57±0.43，雌性處理組平均胎仔數(shù)為1.42±0.13，雄性處理組平均胎仔數(shù)為0.14±0.04。可以看出2個(gè)處理組平均胎仔數(shù)均極顯著低于對(duì)照組(F＝11.71，P＜0.01)，而且2個(gè)處理組的差異不顯著，繁殖率均明顯降低，雌性處理組為42.86％，雄性處理組為14.28％，對(duì)照組為100％。表明不育劑顯著降低了2個(gè)處理組第二次繁殖的個(gè)體數(shù)和繁殖率。雌性處理組抗生育率為57.14％，雄性處理組抗生育率為85.78％，均明顯升高。

第三胎產(chǎn)仔數(shù)比較

子午沙鼠種群第三胎繁殖的個(gè)體數(shù)差異性分析結(jié)果如圖10。對(duì)照組進(jìn)行了繁殖，處理組均未繁殖，可以看出對(duì)照組與2個(gè)處理組的繁殖胎仔數(shù)雖然無顯著差異(F＝2.36，P＞0.05)，但是對(duì)照組仍有28.57％的成體進(jìn)行了第三次繁殖，而處理組沒有個(gè)體參加繁殖。本研究記錄到的年度內(nèi)對(duì)照組子午沙鼠最后一次繁殖幼體出生時(shí)間是9月20日，盡管接近其繁殖休眠期，但處理組無個(gè)體參加繁殖的現(xiàn)象，仍然不能完全排除不育劑的作用。

子午沙鼠種群繁殖胎數(shù)比較

實(shí)驗(yàn)期間子午沙鼠種群繁殖胎數(shù)差異性分析如圖11?？芍獙?duì)照組繁殖2-3胎，繁殖3胎的占28.57％；雌性處理組繁殖1-2胎，繁殖2胎的占42.86％；雄性處理組繁殖0-2胎，繁殖2胎的占14.29％?？梢钥闯?個(gè)處理組與對(duì)照組，以及2個(gè)處理組之間的差異均達(dá)到極顯著(F＝11.87，P＜0.01)。表明不育劑極顯著降低了處理組繁殖頻率，相對(duì)延長(zhǎng)了其繁殖周期，特別是對(duì)于雄性處理組的作用更加明顯。

子午沙鼠繁殖啟動(dòng)期比較

繁殖啟動(dòng)期是指自子午沙鼠合籠配對(duì)開始至第一窩幼仔出生為止的天數(shù)。本研究實(shí)驗(yàn)觀察期為183d(4月5日-10月5日)，若統(tǒng)計(jì)期內(nèi)未產(chǎn)仔，繁殖啟動(dòng)期為實(shí)驗(yàn)觀察期的天數(shù)。子午沙鼠種群繁殖啟動(dòng)期如圖12?？梢钥闯?，對(duì)照組繁殖啟動(dòng)期平均為26.43±1.13d，雌性處理組平均為41.57±2.43d，雄性處理組平均為119±6.37d。差異性分析表明，雌性處理組與對(duì)照組差異不顯著，雄性處理組與對(duì)照組差異極顯著(Fig.5，F(xiàn)＝14.46，P＜0.001)?？梢姴挥齽┩七t了2個(gè)處理組的繁殖啟動(dòng)期，雌性處理組推遲15-22d，雄性處理組推遲32-157d，因此導(dǎo)致2個(gè)處理組后續(xù)妊娠期在年度內(nèi)的改變和推移，而且2個(gè)處理組第三胎均未能繁殖，明顯降低了子午沙鼠種群年度內(nèi)的有效繁殖率。

紫草素的提取、轉(zhuǎn)化與純化流程

新疆紫草根中主要有效成分為紫草素及其衍生物，紫草素及其衍生物為萘醌類化合物，多為有色結(jié)晶，并且結(jié)構(gòu)中5，8-位有兩個(gè)酚羥基，故呈紫色。紫草素分子化學(xué)結(jié)構(gòu)式為

中文名稱：紫草素；

別名名稱：紫草寧，紫根色素，歐紫草；

英文名稱：Shikonin；

化學(xué)名稱：5，8-二羥基-2-[(1R)-1-羥基-4-甲基戊-3-烯基]萘-1，4-二酮；

英文化學(xué)名稱：5，8-Dihydroxy-2-[(1R)-1-hydroxy-4-methyl-pent-3-enyl]naphthalene-1，4-dione；

分子式：C₁₆H₁₆O₅；

分子量：288.30；

紫草素分子中具有酚羥基，故有酸性，能溶于堿液，加酸酸化又可析出，此性質(zhì)常用于提取。

紫草素是萘醌類色素，脂溶性強(qiáng)，所以易溶于石油醚、氯仿，可溶于植物油、乙醇，不溶于水。紫草素衍生物均具有活性基團(tuán)，如5，8-位酚羥基、側(cè)鏈上的雙鍵及酯鍵等，所以在提取、制備及儲(chǔ)存時(shí)均應(yīng)防止成分結(jié)構(gòu)改變或被破壞。萘醌類成分在溫度＜60℃、酸堿度pH＜7、超聲＜30min條件下，對(duì)成分影響較小；在光線直射、溫度＞60℃，酸堿度pH＞7、超聲＞30min條件下，對(duì)成分影響較大。

紫草總色素提取工藝

1.提取溶劑的優(yōu)選

為了選取最佳溶劑，分別稱取紫草50g，按照表1數(shù)據(jù)，分別加入石油醚(40～80℃)、95％7醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮，振蕩，放置一定時(shí)間，過濾，濾液定容于1000ml量瓶中，搖勻，精密量取10ml，放置在100ml量瓶中，分別用相應(yīng)溶劑定容，搖勻，用可見紫外分光光度儀在520nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，按左旋紫草素(C₁₆H₁₆O₅)的吸收系數(shù)(E_1cm^1％)為242計(jì)算紫草羥基萘醌總色素量，按公式(1)，計(jì)算紫草總色素得率，結(jié)果見表1。

表1不同溶劑提取紫草總色素的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

從不同溶劑提取效果來看，石油醚、氯仿較理想。紫草中萘醌類色素為脂溶性成分，由于相似者易溶的特性，溶于親脂性較強(qiáng)的溶劑。氯仿有一定毒性，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)盡量避免使用該溶劑。石油醚(40～80℃)與水、堿液均不起反應(yīng)，與堿液萃取效果理想，且石油醚(40～80℃)對(duì)紫草總色素的提取能力也較好，因此選擇石油醚(40～80℃)為較佳提取溶劑。

2.動(dòng)態(tài)提取法提取紫草總色素

采用動(dòng)態(tài)提取法，將紫草總色素轉(zhuǎn)化為紫草素，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)綜合紫草總色素浸出與時(shí)間、溫度關(guān)系的考察結(jié)果和生產(chǎn)實(shí)際，選擇浸提時(shí)間、每次加溶劑的量及浸提次數(shù)為考察因素，每個(gè)因素又設(shè)定三個(gè)水平，根據(jù)因素水平表，選擇正交表L₉(3⁴)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并以每個(gè)實(shí)驗(yàn)提取的紫草總色素得率作為考察指標(biāo)，比色法測(cè)定含量，統(tǒng)計(jì)分析，確定最佳浸提提取工藝。

(1)正交設(shè)計(jì)表選用L₉(3⁴)因素水平表，見表2。

表2因素水平表

(2)試驗(yàn)方法及試驗(yàn)數(shù)據(jù)

準(zhǔn)確稱取紫草50g，分別根據(jù)表3的試驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)，合并提取液，過濾，定容至1000ml，搖勻，精密量取10ml，放置100ml容量瓶中，用石油醚定容，搖勻，用可見紫外分光光度儀在516nm處測(cè)定其吸收度。按左旋紫草素(C₁₆H₁₆O₅)的吸收系數(shù)(E_1cm^1％)為242，計(jì)算紫草羥基萘醌總色素量，并按公式(1)計(jì)算總色素提取率，結(jié)果見表3。

表3正交試驗(yàn)安排和結(jié)果

(3)方差分析結(jié)果

表4方差分析表

根據(jù)方差分析結(jié)果，A因素各水平之間沒有顯著差異，可選用A因素中的任何一水平，根據(jù)生產(chǎn)周期越短越好的要求，選用提取兩次，每次提取1小時(shí)。而B、C因素各水平之間存在顯著差異，由于B₁＜B₂＜B₃，C₁＜C₂＜C₃，因此最佳工藝應(yīng)為A₁B₃C₃。從正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中直接觀察可以看出提取紫草總色素含量較高的實(shí)驗(yàn)還有A₂B₂C₃，即第5號(hào)實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)將以上兩種提取工藝分別重復(fù)試驗(yàn)三次，結(jié)果如下：

表5較佳工藝對(duì)比表

以上結(jié)果表明兩種較佳工藝提取紫草總色素得率相差不大，但從降低生產(chǎn)成本，縮短生產(chǎn)周期等因素考慮，選用最佳工藝A₁B₃C₃。即提取二次，每次提取時(shí)間為1小時(shí)，每次加石油醚量為10倍，提取溫度為50℃。

提取紫草總色素最佳工藝：石油醚(40～80℃)動(dòng)態(tài)提取2次，每次加石油醚(40～80℃)量為生藥的10倍，每次1小時(shí)，提取溫度為50℃，得到紫草總色素石油醚液。按公式(1)，計(jì)算紫草總色素得率。采用此工藝提取，紫草總色素提出率為2.16％。

紫草總色素轉(zhuǎn)化為紫草素的工藝

紫草總色素轉(zhuǎn)化為紫草素的過程為：

(1)紫草素總色素堿液作用下，發(fā)生水解反應(yīng)，大部分色素分子中-R轉(zhuǎn)化為-H，即轉(zhuǎn)化為紫草素鈉鹽。

(2)轉(zhuǎn)化液再加酸，紫草素鈉鹽即變?yōu)樽喜菟亍?/p>

1.氫氧化鈉溶液濃度的優(yōu)選

準(zhǔn)確量取優(yōu)選出的較佳工藝提取的紫草總色素石油醚液850ml(相當(dāng)于生藥量50g)共5份，分別加0、1％、2％、3％、4％氫氧化鈉溶液500ml萃取，放置24小時(shí)，分取堿提取液，用濃鹽酸酸化至產(chǎn)生沉淀，濃鹽酸可過量，靜置2小時(shí)，布什漏斗抽濾，沉淀用蒸餾水洗至中性，于50℃下烘干，稱重，并用高效液相色譜法測(cè)定紫草干提取物中紫草素含量，計(jì)算出紫草素量，并按公式(2)計(jì)算出紫草素得率，結(jié)果見表6。

表6氫氧化鈉溶液濃度對(duì)紫草素提出量的影響

由表6可知，2％氫氧化鈉溶液提取效果最好，因此選定2％氫氧化鈉溶液為最佳提取溶劑。

2.氫氧化鈉溶液用量的優(yōu)選

準(zhǔn)確量取采用優(yōu)選出的較佳工藝提取的紫草總色素石油醚液850ml共5份，分別加2％氫氧化鈉溶液400、500、600、700、800ml萃取，放置24小時(shí)，分取堿提取液，用濃鹽酸酸化至產(chǎn)生沉淀，濃鹽酸可過量，靜置2小時(shí)，布氏漏斗抽濾，沉淀用蒸餾水洗至中性，于50℃下烘干，稱重，并用高效液相色譜法測(cè)定紫草提取物中紫草素含量，按公式2計(jì)算出紫草素得率，結(jié)果見表7。

表7氫氧化鈉溶液用量對(duì)紫草素提出量的影響

由表7可知，紫草素提出量隨氫氧化鈉溶液用量的增加而提高，并且700ml與800ml相差不大。

3.溫度對(duì)紫草素得率的影響

準(zhǔn)確量取采用優(yōu)選出的較佳工藝提取的石油醚液850ml共4份，分別加2％氫氧化鈉溶液700ml萃取，分別在20℃、30℃、40℃、50℃保溫箱中，靜置2小時(shí)，布氏漏斗抽濾，沉淀用蒸餾水洗至中性，于50℃下烘干，稱重，并用高效液相色譜法測(cè)定紫草提取物中紫草素含量，計(jì)算出紫草素量，并按公式2計(jì)算出紫草素得率，結(jié)果見表8。

表8提取溫度對(duì)紫草素得率的影響

由表8可知，紫草素提出率隨提取溫度的不同而有所不同。開始隨著溫度的升高，紫草素提出量也增加，在40℃時(shí)提出量最高。而繼續(xù)提高溫度至50℃，紫草素提出量反而下降。因?yàn)樽喜菘偵剞D(zhuǎn)化為紫草素是一個(gè)水解反應(yīng)，增加溫度可以使其反應(yīng)加速，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，紫草總色素水解為紫草素后，再增加水解時(shí)間，紫草素會(huì)繼續(xù)分解，轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)。因此設(shè)計(jì)40℃水解1、2、3、4、5、6小時(shí)的堿化水解工藝，見表9。由表9可以看出40℃時(shí)，水解1小時(shí)，紫草素得率較高。

表9 40℃不同堿化時(shí)間的對(duì)比實(shí)驗(yàn)

4.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選紫草總色素轉(zhuǎn)化為紫草素工藝條件

(1)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：結(jié)合上述紫草素提取轉(zhuǎn)化工藝影響因素的考察結(jié)果和生產(chǎn)實(shí)際，選擇氫氧化鈉溶液濃度、用量、堿化時(shí)間作為考察因素，分別設(shè)定三個(gè)水平，根據(jù)因素水平表，選用L₉(3⁴)因素水平表，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，見表10。

表10因素水平表

(2)試驗(yàn)方法及試驗(yàn)數(shù)據(jù)：準(zhǔn)確量取石油醚液850ml分別按表11設(shè)計(jì)的試驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)，加不同濃度的堿液，堿化放置不同的時(shí)間后，堿提取液用濃鹽酸酸化至產(chǎn)生沉淀，濃鹽酸可過量，靜置2小時(shí)，布氏漏斗抽濾，沉淀用蒸餾水洗至中性，于50℃下烘干，稱重，并用高效液相色譜法測(cè)定紫草干提取物中紫草素含量，按公式2計(jì)算出紫草素得率。結(jié)果見表11。

表11正交試驗(yàn)安排和結(jié)果

(3)方差分析結(jié)果

表12方差分析表

由此可見因素A、C對(duì)紫草素提取轉(zhuǎn)化率影響極顯著，因素B對(duì)紫草素提取轉(zhuǎn)化率影響顯著，各因素對(duì)提取轉(zhuǎn)化效果的影響程度依次為C＞A＞B，因此A，B，C三個(gè)因素的最佳參數(shù)為A₂B₃C₂，即紫草素轉(zhuǎn)化的最佳工藝為：在40℃時(shí)，氫氧化鈉溶液濃度為2％，用量為700ml(相當(dāng)于藥材量的14倍)，轉(zhuǎn)化時(shí)間為1小時(shí)。

按此最佳工藝安排試驗(yàn)，平行操作3份，紫草素提出轉(zhuǎn)化率分別為1.760％，1.776％，1.765％。平均為1.767％；紫草素純度分別為75.12％、76.05％、75.84％，平均為75.67％。

紫草素轉(zhuǎn)化工藝研究結(jié)果表明，最佳工藝為：40℃時(shí)，氫氧化鈉溶液濃度為2％，用量為700ml(相當(dāng)于藥材量的14倍)，水解1小時(shí)，此時(shí)紫草素得率為1.767％；紫草干提取物中紫草素純度為75.67％，此時(shí)還未達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)要求。

紫草素純化工藝

1.樹脂預(yù)處理

在潔凈的分離柱內(nèi)，放入已經(jīng)去除雜質(zhì)、體積恒定的大孔吸附樹脂，再加入相當(dāng)于樹脂體積0.4～0.5倍的乙醇，浸泡24小時(shí)。然后用二倍柱體積的乙醇流過柱子，用水沖洗流出液pH至中性，再用5％的鹽酸、2％的氫氧化鈉溶液重復(fù)以上步驟。

2.上樣液制備及預(yù)處理：

稱取紫草50g，按照最佳動(dòng)態(tài)提取工藝提取、最佳堿化工藝轉(zhuǎn)化制備成紫草素粗提物。然后用95％乙醇，制成不同濃度的紫草粗提物溶液，備用。

3.動(dòng)態(tài)吸附處理：

為了更合理的設(shè)計(jì)生產(chǎn)化工藝路線，先采用小柱子對(duì)其動(dòng)態(tài)柱分離條件進(jìn)行考察，為生產(chǎn)提供科學(xué)的依據(jù)。

在進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附時(shí)，考察6個(gè)因素的影響，分別為不同洗脫劑、分離柱內(nèi)徑、上樣液的濃度、藥液的pH值、上樣液流速、溫度等。

(1)不同洗脫劑對(duì)紫草素純度及收率的影響

實(shí)驗(yàn)中所用樹脂為30g，所用藥液的濃度為含紫草素粗提物0.801mg/ml(相當(dāng)于50g生藥/ml藥液)，pH值為5.0，藥液體積為100ml，柱徑為22.5mm，樹脂吸附后用200ml不同溶劑以1.5BV/h的流速進(jìn)行解吸，解吸液真空濃縮，得到純化的紫草素，紫草素精密稱取約0.5g，置100ml量瓶中，加乙醇至刻度，4小時(shí)內(nèi)時(shí)時(shí)振搖，濾過，精密量取續(xù)濾液5ml，置25ml量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻。照分光光度法，在516nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，按左旋紫草素(C₁₆H₁₆O₆)的吸收系數(shù)(E_1cm^1％)為242計(jì)算，測(cè)定紫草素含量，按公式3計(jì)算紫草素純度，并按公式4計(jì)算紫草素收率，結(jié)果見表13。由表13可知，丙酮解吸效果最好，乙醇洗脫效果較差。

表13不同溶劑解吸的結(jié)果

(2)考察選擇柱子的內(nèi)徑

藥液pH值為5.0，上樣液流速為1.5BV/h，柱徑分別為15mm、20mm、22.5mm、25mm四種不同規(guī)格的柱子，所得數(shù)據(jù)如下，從表中的數(shù)據(jù)可以看出柱子的內(nèi)徑為20mm的紫草素收率和純度最高，因此選擇內(nèi)徑為20mm的柱子。

表14不同柱徑紫草索收率以及產(chǎn)品中紫草素純度的數(shù)據(jù)

(3)考察藥液的濃度

采用的柱子內(nèi)徑為20.0mm，樹脂量為30g，上樣液的流速為1.5BV/h，上樣液的濃度分別為0.801mg/ml、1.63mg/ml、3.25mg/ml，藥液體積分別為150ml，75ml，36ml，即保持相同的生藥量，所得數(shù)據(jù)如表所示。根據(jù)表中的數(shù)據(jù)，以藥液濃度為1.63mg/ml紫草素收率和產(chǎn)品中紫草素純度最高。因此選擇藥液濃度為1.63mg/ml的藥液為最佳的上樣濃度。

表15上樣液濃度對(duì)紫草素收率及產(chǎn)品中紫草素純度的影響

(4)考察上樣液的pH值

pH值對(duì)吸附的影響一般來說，藥液的pH值對(duì)樹脂的吸附率影響較大，因此考察不同pH的藥液對(duì)樹脂吸附率的影響。從表16中看出，以溶液pH值為5.9，紫草素收率和產(chǎn)品中紫草素純度為最高。

表16不同pH值的藥液上柱后的吸附數(shù)據(jù)

(5)考察上樣液流速

柱徑：20mm，上樣液的濃分別為1.63mg/ml，上樣液體積75ml，pH值為5.9，樹脂用量30g，用丙酮洗脫，流速分別選擇1.5BV/h；3.0BV/h；5.0BV/h；7.5BV/h，所得數(shù)據(jù)如下表。理論上，上樣液的流速越慢，紫草素的吸附越充分，但從表17中可看出，流速3.0BV/h的解吸效果與流速1.5BV/h相當(dāng)，并且均比5.0BV/h、7.5BV/h的效果好。而流速快可以縮短生產(chǎn)周期，所以選定流速3.0BV/h為最佳流速。

表17不同的上樣液流速時(shí)紫草素的收率及產(chǎn)品中紫草素純度的數(shù)據(jù)

(6)考察溫度的影響

一般來說，吸附分為物理吸附和化學(xué)吸附。物理吸附一般在低溫下進(jìn)行，而化學(xué)吸附需要一定的熱量，為了測(cè)定打孔樹脂對(duì)紫草素是物理吸附還是化學(xué)吸附，因此測(cè)定了不同溫度下樹脂對(duì)紫草素的吸附效果，而水洗和醇洗均在常溫下進(jìn)行。從表中的數(shù)據(jù)可以看出，在室溫下吸附紫草素的收率最高，在35℃時(shí)紫草素的收率有所下降，在51℃有所上升，在75℃時(shí)有所下降，這說明樹脂對(duì)紫草素的吸附既是物理吸附，又是化學(xué)吸附，在整個(gè)吸附過程中是物理吸附和化學(xué)吸附競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果。

表18不同溫度下樹脂吸附紫草素的數(shù)據(jù)

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，動(dòng)態(tài)吸附的最佳條件是：紫草素較佳洗脫溶劑為丙酮，上樣液濃度為1.63mg/ml，上樣液最佳PH值為5.9，柱徑選擇為20mm，上樣流速為3BV/h，溫度采用室溫下即可。

在最佳條件下吸附，所得紫草素收率為1.34％，產(chǎn)品中紫草素純度達(dá)到96.6％，達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)。

結(jié)論

紫草素高效提純是紫草活性成分發(fā)揮療效的關(guān)鍵所在，而提取、純化紫草素的關(guān)鍵技術(shù)問題是如何去除無效雜質(zhì)，提高紫草素的收率和產(chǎn)品中紫草素純度，縮短生產(chǎn)周期。作者利用紫草中萘醌類成分的物理化學(xué)特性，把動(dòng)態(tài)提取，溶液萃取工藝與先進(jìn)的樹脂吸附工藝相結(jié)合，并分別優(yōu)化了提取、轉(zhuǎn)化、樹脂吸附純化三個(gè)步驟中的工藝參數(shù)，使得紫草素的最終收率達(dá)到1.34％，產(chǎn)品中紫草素純度達(dá)到96.6％。并大大縮短了提取純化時(shí)間。結(jié)論如下：

紫草總色素提取工藝

1、提取溶劑選擇：通過對(duì)石油醚(40～80℃)、95％乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿五種不同溶劑對(duì)紫草素的提取能力的比較，結(jié)果表明石油醚(40～80℃)的提取效果優(yōu)于其它溶劑。

2、提取方式的選擇：石油醚(40～80℃)提取紫草總色素采用不同提取方式，如浸提、動(dòng)態(tài)提取，通過實(shí)驗(yàn)比較，最后確定較適宜的提取方法為動(dòng)態(tài)提取，即紫草加入石油醚(40～80℃)動(dòng)態(tài)提取兩次，每次加溶劑量為生藥材量的10倍，提取溫度為50℃，每次提取時(shí)間為1小時(shí)，此條件下，紫草總色素的收率可達(dá)2.16％。

轉(zhuǎn)化工藝

此步驟是將紫草總色素轉(zhuǎn)化為紫草素，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化的最佳工藝為：紫草總色素石油醚液用2％的氫氧化鈉溶液，用量為生藥量的14倍，堿化時(shí)間為1小時(shí)，堿化溫度為40℃，分取堿提取液，用濃鹽酸酸化至產(chǎn)生沉淀，濃鹽酸可過量，靜置2小時(shí)，布氏漏斗抽濾，沉淀用蒸餾水洗至中性，于50℃下烘干，得到紫草素粗提取物。此條件下紫草素的收率可達(dá)1.767％，產(chǎn)品中紫草素的純度可達(dá)75.67％。

純化工藝

1、篩選樹脂：通過靜態(tài)吸附對(duì)四種不同極性的大孔樹脂進(jìn)行篩選，結(jié)果表明這四種樹脂中，HZ-806樹脂吸附率最快，解吸率也高，因此將其定為本研究項(xiàng)目的吸附樹脂。

2、動(dòng)態(tài)吸附：分別考察了上樣液的流速、分離柱內(nèi)徑、上樣液濃度、溫度及pH值等因素對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響。結(jié)果表明：上樣液的流速為3BV/h，分離柱內(nèi)徑為20mm，上樣液的濃度為1.63mg/ml、溫度為室溫，pH值為5.9時(shí)吸附效果最好。在最佳石油醚(50℃)動(dòng)態(tài)提取-堿液轉(zhuǎn)化-大孔樹脂吸附條件下，經(jīng)單程提取、轉(zhuǎn)化、純化后紫草素的最終收率為1.34％，產(chǎn)品中紫草素的純度為96.6％，均超過了文獻(xiàn)的報(bào)道值。

以上實(shí)例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，所作出的若干改進(jìn)，也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。