一種抗原特異性T淋巴細胞凍存液及其制備方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種抗原特異性t淋巴細胞凍存液及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：基因修飾免疫細胞治療技術(shù)是一種新興的腫瘤治療模式，已經(jīng)成為全球的研究熱點，特別是以car-t(嵌合抗原受體t細胞)/tcr-t(嵌合型t細胞)技術(shù)為主要代表，成為全球生物醫(yī)學新世紀的主要發(fā)展方向。目前認為經(jīng)體外擴增遺傳修飾的免疫細胞后再回輸?shù)饺梭w內(nèi)，有利于提高機體的免疫防御能力，表現(xiàn)在可以提高機體對特異性抗腫瘤等疾病的治療能力。在細胞免疫治療過程中，不僅需要培養(yǎng)和促進細胞的增殖，特別是在體外培養(yǎng)一段時間后，隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化，免疫細胞的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并而不斷有新的變化，因此及時進行細胞凍存十分必要。細胞凍存最常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法，主要是采用添加適量保護劑的緩慢冷凍法來凍存細胞，如采用甘油或二甲基亞砜(dmso)為保護劑，因為如果細胞在不加任何保護劑的情況下直接冷凍，細胞內(nèi)外的水分會很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應(yīng)，如：細胞脫水使局部電解質(zhì)濃度增高、導致ph值改變，部分蛋白質(zhì)由于上述原因而變性，從而引起細胞內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)紊亂，溶酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶，使細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)成分造成破壞，線粒體腫脹，功能丟失，并造成能量代謝障礙。胞膜上的類脂蛋白復合體也易被破壞引起細胞膜通透性的改變，使細胞內(nèi)容物丟失。如果細胞內(nèi)冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成細胞核dna空間構(gòu)型發(fā)生不可逆的損傷，而致細胞死亡?，F(xiàn)有的凍存方案常采用：70％-80％dmem/1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10％-20％胎牛血清和10％二甲基亞砜(dmso)的凍存方案去保存細胞，該方案能夠很好的為動物細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，細胞經(jīng)短時間凍存再復蘇后仍能維持較高的活率。但是該細胞凍存方案經(jīng)長時間凍存后細胞復蘇率較低，只有70％-80％左右，直接制約凍存細胞的臨床應(yīng)用。且現(xiàn)有的凍存方法對于免疫細胞，在凍存過程中則易形成冰晶損傷細胞，復蘇后存在細胞活率低、細胞增殖數(shù)量不足和細胞殺傷功能低下等問題。因此，免疫細胞治療的臨床應(yīng)用急需一種能夠防止凍存過程中的細胞損傷、保持細胞復蘇后的高活率及其功能的細胞凍存液。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種抗原特異性t淋巴細胞凍存液及其制備方法。本發(fā)明抗原特異性t淋巴細胞凍存液可以提升細胞活率，抗原特異性t淋巴細胞凍存液的制備方法工藝簡單。本發(fā)明第一方面提供了一種抗原特異性t淋巴細胞凍存液，包括凍存液a和凍存液b，所述凍存液a包括以下體積分數(shù)的組分：30％-40％的勃脈力電解質(zhì)注射液、30％-40％的葡萄糖氯化鈉注射液、5％-15％的右旋糖酐葡萄糖注射液和15％-25％的人血白蛋白溶液；所述凍存液b包括以下體積分數(shù)的組分：20％-30％的勃脈力電解質(zhì)注射液、20％-30％的葡萄糖氯化鈉注射液、5％-15％的右旋糖酐葡萄糖注射液、15％-25％的人血白蛋白溶液和10％-20％的二甲基亞砜；所述凍存液a與所述凍存液b分開儲存，使用時，所述凍存液a與所述凍存液b按體積比為1:0.5-2的比例混合，形成抗原特異性t淋巴細胞凍存液。優(yōu)選地，所述凍存液a包括以下體積分數(shù)的組分：35％的勃脈力電解質(zhì)注射液、35％的葡萄糖氯化鈉注射液、10％的右旋糖酐葡萄糖注射液和20％的人血白蛋白溶液；所述凍存液b包括以下體積分數(shù)的組分：27.5％的勃脈力電解質(zhì)注射液、27.5％的葡萄糖氯化鈉注射液、10％的右旋糖酐葡萄糖注射液、20％的人血白蛋白溶液和15％的二甲基亞砜。優(yōu)選地，所述凍存液a與所述凍存液b的體積比為1:1。優(yōu)選地，所述葡萄糖氯化鈉注射液中含有質(zhì)量濃度為5％的右旋葡萄糖和0.45％的氯化鈉，所述右旋糖酐葡萄糖注射液中含有質(zhì)量濃度為10％的低分子量右旋糖苷和5％的右旋葡萄糖。優(yōu)選地，所述人血白蛋白溶液中含有質(zhì)量濃度為25％的人血白蛋白。本發(fā)明第一方面提供的凍存液配比合理，能夠降低細胞內(nèi)的晶體形成，減少細胞內(nèi)水凝固所形成的高濃度溶質(zhì)對細胞造成的低溫損傷，提升細胞活率；并能減少免疫細胞表面抗原的丟失，保持t細胞的腫瘤殺傷功能。所有組分均可以直接回輸人體，在臨床應(yīng)用中具有方便、快捷等顯著優(yōu)勢，本發(fā)明凍存液所有組分明確，可以工業(yè)化生產(chǎn)，原材料價格便宜，易獲取，具有成本優(yōu)勢。本發(fā)明第二方面提供了一種抗原特異性t淋巴細胞凍存液的制備方法，包括：將勃脈力電解質(zhì)注射液、葡萄糖氯化鈉注射液、右旋糖酐葡萄糖注射液和人血白蛋白溶液分別按照體積分數(shù)為30％-40％、30％-40％、5％-15％和15％-25％進行混合，制得凍存液a；將勃脈力電解質(zhì)注射液、葡萄糖氯化鈉注射液、右旋糖酐葡萄糖注射液、人血白蛋白溶液和二甲基亞砜分別按照體積分數(shù)為20％-30％、20％-30％、5％-15％、15％-25％和10％-20％進行混合，制得凍存液b；所述凍存液a與所述凍存液b分開儲存，使用時，將所述凍存液a與所述凍存液b按照體積比為1:0.5-2的比例混合，得到凍存液。本發(fā)明第二方面提供的制備方法，方法簡單易操作，制備成本較低，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明第三方面提供了一種如第一方面所述的凍存液在抗原特異性t淋巴細胞凍存中的應(yīng)用，包括：(1)取所述凍存液，所述凍存液包括凍存液a和凍存液b；取對數(shù)生長期的抗原特異性t淋巴細胞；(2)向所述抗原特異性t淋巴細胞中加入所述凍存液a，得到細胞重懸液；然后加入凍存液b，得到細胞凍存液，所述凍存液a與所述凍存液b的體積比為1:0.5-2，凍存所述細胞凍存液，得到凍存的抗原特異性t淋巴細胞。優(yōu)選地，所述細胞重懸液中的所述抗原特異性t淋巴細胞的濃度為1×106個/ml-10×106個/ml。優(yōu)選地，凍存結(jié)束后，將所述凍存后的所述抗原特異性t淋巴細胞進行復蘇，所述復蘇的方法包括：將凍存后的細胞凍存液置于37℃水浴鍋中，迅速晃動直至凍存液完全融解，得到復蘇后的抗原特異性t淋巴細胞。本發(fā)明第三方面提供的應(yīng)用，該凍存液能夠凍存細胞，相對其他凍存液能夠更有效的保持細胞的復蘇成活率，促進其增殖能力，并提高細胞活性，減少免疫細胞表面抗原的丟失，保持t細胞的腫瘤殺傷功能。且本發(fā)明凍存液重懸的細胞可直接回輸體內(nèi)。本發(fā)明第四方面提供了一種抗原特異性t淋巴細胞注射液，包括抗原特異性t淋巴細胞和第一方面所述的細胞凍存液，所述細胞注射液中，所述抗原特異性t淋巴細胞的濃度為0.5×106個/ml-2×106個/ml。本發(fā)明第四方面提供的注射液，可以直接回輸體內(nèi)，無需經(jīng)過額外的處理工序，從而減少操作流程，降低污染概率。本發(fā)明凍存液和血液成分相容，可作為水、電解質(zhì)的補充源和堿化劑。綜上，本發(fā)明有益效果包括以下幾個方面：1、本發(fā)明提供的凍存液能夠降低細胞內(nèi)的晶體形成，減少細胞內(nèi)水凝固所形成的高濃度溶質(zhì)對細胞造成的低溫損傷，提升細胞活率；并能減少免疫細胞表面抗原的丟失，保持t細胞的腫瘤殺傷功能；2、本發(fā)明提供的凍存液的制備方法，方法簡單易操作，制備成本較低，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；3、本發(fā)明提供的凍存液的應(yīng)用，相對其他凍存液，本發(fā)明凍存液能夠更有效的保持細胞的復蘇成活率，促進其增殖能力，并提高細胞活性，減少免疫細胞表面抗原的丟失，保持t細胞的腫瘤殺傷功能。且本發(fā)明凍存液重懸的細胞可直接回輸體內(nèi)；4、本發(fā)明提供的注射液，可以直接回輸體內(nèi)，無需經(jīng)過額外的處理工序，從而減少操作流程，降低污染概率。本發(fā)明凍存液和血液成分相容，可作為水、電解質(zhì)的補充源和堿化劑。附圖說明圖1為實施例1提供的凍存液凍存抗原特異性t淋巴細胞后對其細胞活性的影響圖；圖2為實施例1提供的凍存液凍存抗原特異性t淋巴細胞后對其細胞增殖速度的影響圖；圖3為實施例1提供的凍存液凍存抗原特異性t淋巴細胞后對其腫瘤殺傷功能的影響圖。具體實施方式以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明的保護范圍。第一方面，本發(fā)明提供一種抗原特異性t淋巴細胞凍存液，包括凍存液a和凍存液b，凍存液a包括以下體積分數(shù)的組分：30％-40％的勃脈力電解質(zhì)注射液、30％-40％的葡萄糖氯化鈉注射液、5％-15％的右旋糖酐葡萄糖注射液和15％-25％的人血白蛋白溶液；凍存液b包括以下體積分數(shù)的組分：20％-30％的勃脈力電解質(zhì)注射液、20％-30％的葡萄糖氯化鈉注射液、5％-15％的右旋糖酐葡萄糖注射液、15％-25％的人血白蛋白溶液和10％-20％的二甲基亞砜；凍存液a與凍存液b分開儲存，使用時，凍存液a與凍存液b按體積比為1:0.5-2的比例混合，形成抗原特異性t淋巴細胞凍存液。本發(fā)明凍存液分為a液(又稱細胞重懸液)與b液(又稱細胞凍存液)兩部分，a液中不含dmso，細胞可以較長時間保存于其中。而當開始凍存時，將a液與b液快速混合，立即進行凍存，即可將dmso引起的毒性降到最低。當凍存大體積(例如100ml以上)或者多份(例如50份以上)的細胞樣品時體現(xiàn)的作用尤為明顯?，F(xiàn)有技術(shù)中大多數(shù)凍存液直接回輸人體的問題有：一是凍存液成分與人血液差別過大，回輸會引起滲透壓變化；二是凍存液中含有對人體有潛在危害的成分(如過敏原、熱原等)。而本發(fā)明提供的凍存液避免了上述問題，首先，本發(fā)明提供的凍存液兼具了細胞凍存保護液與電解質(zhì)注射液的雙重優(yōu)點，既可以在低至-130℃以下的低溫凍存過程中保護細胞，同時解凍后可以直接作為電解質(zhì)注射液回輸人體，無需經(jīng)過額外的處理工序，從而減少操作流程，降低污染概率?；颊呓邮芗毎剌斨畷r和之后均有可能出現(xiàn)電解質(zhì)紊亂，需要輸液補充水、葡萄糖和電解質(zhì)，本發(fā)明提供的凍存液和血液成分相容，可作為水、電解質(zhì)的補充源和堿化劑。本發(fā)明凍存液中，(1)勃脈力a(plasma-lytea)為復方電解質(zhì)注射液，富含電解質(zhì)，且與血液和血液成分相容。在凍存時，勃脈力a起到擴充容積的作用。在回輸人體時可作為水、電解質(zhì)的補充源和堿化劑。(2)葡萄糖氯化鈉注射液(即5％右旋葡萄糖和0.45％氯化鈉注射液)為臨床常用藥物注射稀釋劑，在凍存時葡萄糖可作為凍存保護劑來減少冰晶形成、降低細胞的滲透收縮，在回輸時，葡萄糖可提供腸外營養(yǎng)，補充能量，氯化鈉則可以補充電解質(zhì)。此外，在本發(fā)明提供的凍存液中也起到擴充容積的作用。(3)右旋糖酐葡萄糖注射液(即10％低分子量右旋糖苷和5％右旋葡萄糖溶液)為臨床常用注射液，其中所含的右旋糖酐是目前最佳的血漿代用品之一。在凍存時右旋糖酐葡萄糖可作為凍存保護劑來減少冰晶形成，在回輸時能改善微循環(huán)，預防或消除血管內(nèi)紅細胞聚集和血栓形成等，亦有擴充血容量作用。(4)人血白蛋白溶液在凍存細胞復蘇之后提供適于細胞生存的營養(yǎng)環(huán)境，幫助細胞從凍存狀態(tài)恢復。在回輸時會起到血漿容量擴充劑的作用，且不會如牛血清(fbs)等非人體成分一樣引起過敏反應(yīng)。(5)二甲亞砜(dmso)為凍存保護劑，在凍存時減少冰晶形成、保護細胞不因凍存而死亡。本發(fā)明中的勃脈力(plasma-lytea)電解質(zhì)注射液和人血清白蛋共同構(gòu)成了成分豐富多元的營養(yǎng)體系，在細胞凍存的過程中提供了穩(wěn)定的、直接的營養(yǎng)供給，保證了細胞存活率。同時，右旋糖酐能夠很好的維持滲透壓，即使在溫度下降的過程中，仍能維持良好的滲透壓環(huán)境，避免因溫度下降、滲透壓改變而出現(xiàn)的細胞死亡現(xiàn)象。此外，在溫度下降的過程中，蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)形成了水化膜，降低冰晶形成，避免了細胞因溫度下降時，冰晶的形成造成的細胞機械損傷、死亡，從而提高免疫細胞的復蘇成活率，并保持其細胞活性，延長免疫細胞存活期，減少免疫細胞表面抗原的丟失。在免疫細胞治療領(lǐng)域，將極大提升回輸病人體內(nèi)的基因修飾淋巴t細胞的活性和功能。本發(fā)明中，凍存液a包括以下體積分數(shù)的組分：32％-38％的勃脈力電解質(zhì)注射液、32％-38％的葡萄糖氯化鈉注射液、7％-13％的右旋糖酐葡萄糖注射液和18％-22％的人血白蛋白溶液；凍存液b包括以下體積分數(shù)的組分：22％-28％的勃脈力電解質(zhì)注射液、22％-28％的葡萄糖氯化鈉注射液、8％-12％的右旋糖酐葡萄糖注射液、18％-22％的人血白蛋白溶液和12％-17％的二甲基亞砜。本發(fā)明中，凍存液a包括以下體積分數(shù)的組分：35％的勃脈力電解質(zhì)注射液、35％的葡萄糖氯化鈉注射液、10％的右旋糖酐葡萄糖注射液和20％的人血白蛋白溶液；凍存液b包括以下體積分數(shù)的組分：27.5％的勃脈力電解質(zhì)注射液、27.5％的葡萄糖氯化鈉注射液、10％的右旋糖酐葡萄糖注射液、20％的人血白蛋白溶液和15％的二甲基亞砜。本發(fā)明中，凍存液a與凍存液b的體積比為1:1。本發(fā)明中，葡萄糖氯化鈉注射液中含有質(zhì)量濃度為5％的右旋葡萄糖和0.45％的氯化鈉(即100ml葡萄糖氯化鈉注射液中含5g低分子量右旋葡萄糖和0.45g氯化鈉)，右旋糖酐葡萄糖注射液中含有質(zhì)量濃度為10％的低分子量右旋糖苷和5％的右旋葡萄糖(即100ml右旋糖酐葡萄糖注射液中含10g低分子量右旋糖苷和5g右旋葡萄糖)。本發(fā)明中，人血白蛋白溶液中含有質(zhì)量濃度為25％的人血白蛋白。本發(fā)明中提供的凍存液除了可以凍存抗原特異性t淋巴細胞，還可以凍存其他一般的免疫細胞，如b淋巴細胞和nk細胞等。本發(fā)明第一方面提供的凍存液配比合理，能夠降低細胞內(nèi)的晶體形成，減少細胞內(nèi)水凝固所形成的高濃度溶質(zhì)對細胞造成的低溫損傷，提升細胞活率；并能減少免疫細胞表面抗原的丟失，保持t細胞的腫瘤殺傷功能。所有組分均可以直接回輸人體，在臨床應(yīng)用中具有方便、快捷等顯著優(yōu)勢，本發(fā)明凍存液所有組分明確，可以工業(yè)化生產(chǎn)，原材料價格便宜，易獲取，具有成本優(yōu)勢。本發(fā)明第二方面提供了一種抗原特異性t淋巴細胞凍存液的制備方法，包括：將勃脈力電解質(zhì)注射液、葡萄糖氯化鈉注射液、右旋糖酐葡萄糖注射液和人血白蛋白溶液按照體積分數(shù)為30％-40％、30％-40％、5％-15％和15％-25％的比例進行混合，制得凍存液a；將勃脈力電解質(zhì)注射液、葡萄糖氯化鈉注射液、右旋糖酐葡萄糖注射液、人血白蛋白溶液和二甲基亞砜按照體積分數(shù)為20％-30％、20％-30％、5％-15％、15％-25％和10％-20％的比例進行混合，制得凍存液b；凍存液a與凍存液b分開儲存，使用時，將凍存液a與凍存液b按照體積比為1:0.5-2的比例混合，得到凍存液。本發(fā)明中，凍存液a與凍存液b按照體積比為1:1的比例混合。本發(fā)明中，使用時，先用凍存液a懸浮細胞，然后再以體積比為1:1的比例加入凍存液b混合即可得到凍存液。本發(fā)明中，將凍存液a和凍存液b進行過濾。本發(fā)明中，過濾操作為采用0.22um濾膜過濾。本發(fā)明第二方面提供的凍存液的制備方法，方法簡單易操作，制備成本較低，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明第三方面提供了一種如第一方面的凍存液在抗原特異性t淋巴細胞凍存中的應(yīng)用，包括：取凍存液，凍存液包括凍存液a和凍存液b；取對數(shù)生長期的抗原特異性t淋巴細胞；向抗原特異性t淋巴細胞中加入凍存液a，得到細胞重懸液；然后加入凍存液b，得到細胞凍存液，凍存液a與凍存液b的體積比為1:0.5-2，凍存細胞凍存液，得到凍存的抗原特異性t淋巴細胞。本發(fā)明中，細胞重懸液中的抗原特異性t淋巴細胞的濃度為1×106個/ml-10×106個/ml。本發(fā)明中，凍存的具體操作為：將細胞凍存液分裝于凍存管中，將凍存管置于程序凍存盒中，在-80℃環(huán)境中冷凍后，移入液氮罐中凍存。本發(fā)明中，凍存結(jié)束后，將凍存后的抗原特異性t淋巴細胞進行復蘇，復蘇的方法包括：將凍存后的細胞凍存液置于37℃水浴鍋中，迅速晃動直至凍存液完全融解，得到復蘇后的抗原特異性t淋巴細胞。本發(fā)明中，抗原特異性t淋巴細胞細胞復蘇后繼續(xù)培養(yǎng)，包括：將復蘇后得到的凍存管中的細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，加入完全培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，離心后棄上清，然后向細胞沉淀內(nèi)加入完全培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻后，轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，進行接種和培養(yǎng)。本發(fā)明中，復蘇后的抗原特異性t淋巴細胞可進行后續(xù)腫瘤殺傷實驗、細胞增殖實驗、細胞活性檢測實驗等，也可以直接回輸人體。按照上述細胞凍存和復蘇方法，在復蘇細胞后，能顯著提高細胞的復蘇活率，使得其比常規(guī)凍存液的復蘇活性提升1.1至1.9倍；并能快速擴增抗原特異性t淋巴細胞，讓免疫細胞的增殖速度比常規(guī)凍存液提高了1.3至2.7倍，提升了免疫細胞數(shù)量；而且本發(fā)明t淋巴細胞凍存液所復蘇后的抗原特異性t淋巴細胞能保持很好的免疫細胞功能，其能起到很好的腫瘤特異性殺傷功能，較常規(guī)凍存液提升1.1至1.8倍。經(jīng)本發(fā)明免疫細胞凍存液復蘇后的抗原特異性t淋巴細胞，相對其他凍存液能夠更有效的保持細胞的復蘇成活率，促進其增殖能力，并提高細胞活性，減少免疫細胞表面抗原的丟失，保持t細胞的腫瘤殺傷功能，因此本發(fā)明所描述的凍存液較常規(guī)凍存液相比更適合用于凍存和復蘇抗原特異性t淋巴細胞，能快速繁殖獲得足夠數(shù)量的所需的免疫細胞，使其更好的應(yīng)用于臨床免疫細胞治療中。本發(fā)明第三方面提供的應(yīng)用，該凍存液能夠凍存細胞，相對其他凍存液能夠更有效的保持細胞的復蘇成活率，促進其增殖能力，并提高細胞活性，減少免疫細胞表面抗原的丟失，保持t細胞的腫瘤殺傷功能。且本發(fā)明凍存液重懸的細胞可直接回輸體內(nèi)。本發(fā)明第四方面提供了一種抗原特異性t淋巴細胞注射液，包括抗原特異性t淋巴細胞和如第一方面的細胞凍存液，細胞注射液中，抗原特異性t淋巴細胞的濃度為0.5×106個/ml-2×106個/ml。本發(fā)明中，抗原特異性t淋巴細胞注射液還可以包括生理鹽水等溶劑。本發(fā)明中，每次回輸?shù)募毎乖禺愋詔淋巴細胞注射液為100ml，所述抗原特異性t淋巴細胞的濃度為0.5×106個/ml-2×106個/ml。本發(fā)明中，本發(fā)明抗原特異性t淋巴細胞注射液的制備方法為：取凍存液，凍存液包括凍存液a和凍存液b；向抗原特異性t淋巴細胞中加入凍存液a，重懸細胞后，加入凍存液b，得到抗原特異性t淋巴細胞注射液。本發(fā)明第四方面提供的注射液，可以直接回輸體內(nèi)，無需經(jīng)過額外的處理工序，從而減少操作流程，降低污染概率。本發(fā)明凍存液血液和血液成分相容，可作為水、電解質(zhì)的補充源和堿化劑。實施例1：一種抗原特異性t淋巴細胞凍存液，包括凍存液a和凍存液b，凍存液a包括以下體積分數(shù)的組分：35％的勃脈力電解質(zhì)注射液、35％的葡萄糖氯化鈉注射液、10％的右旋糖酐葡萄糖注射液和20％的人血白蛋白溶液；凍存液b包括以下體積分數(shù)的組分：27.5％的勃脈力電解質(zhì)注射液、27.5％的葡萄糖氯化鈉注射液、10％的右旋糖酐葡萄糖注射液、20％的人血白蛋白溶液和15％的二甲基亞砜；以下為本發(fā)明實施例中所采用的各原料的廠家品牌與貨號：表1原料表葡萄糖氯化鈉注射液中含有質(zhì)量濃度為5％的右旋葡萄糖和0.45％的氯化鈉，右旋糖酐葡萄糖注射液中含有質(zhì)量濃度為10％的低分子量右旋糖苷和5％的右旋葡萄糖；凍存液a與凍存液b分開儲存，使用時，凍存液a與凍存液b按體積比為1:1的比例混合，形成抗原特異性t淋巴細胞凍存液。實施例2：一種抗原特異性t淋巴細胞凍存液，包括凍存液a和凍存液b，凍存液a包括以下體積分數(shù)的組分：30％的勃脈力電解質(zhì)注射液、40％的葡萄糖氯化鈉注射液、5％的右旋糖酐葡萄糖注射液和25％的人血白蛋白溶液；凍存液b包括以下體積分數(shù)的組分：30％的勃脈力電解質(zhì)注射液、20％的葡萄糖氯化鈉注射液、5％的右旋糖酐葡萄糖注射液、25％的人血白蛋白溶液和20％的二甲基亞砜；葡萄糖氯化鈉注射液中含有質(zhì)量濃度為5％的右旋葡萄糖和0.45％的氯化鈉，右旋糖酐葡萄糖注射液中含有質(zhì)量濃度為10％的低分子量右旋糖苷和5％的右旋葡萄糖；凍存液a與凍存液b分開儲存，使用時，凍存液a與凍存液b按體積比為1:0.5的比例混合，形成抗原特異性t淋巴細胞凍存液。實施例3：一種抗原特異性t淋巴細胞凍存液，包括凍存液a和凍存液b，凍存液a包括以下體積分數(shù)的組分：40％的勃脈力電解質(zhì)注射液、30％的葡萄糖氯化鈉注射液、15％的右旋糖酐葡萄糖注射液和15％的人血白蛋白溶液；凍存液b包括以下體積分數(shù)的組分：20％的勃脈力電解質(zhì)注射液、30％的葡萄糖氯化鈉注射液、15％的右旋糖酐葡萄糖注射液、15％的人血白蛋白溶液和20％的二甲基亞砜；葡萄糖氯化鈉注射液中含有質(zhì)量濃度為5％的右旋葡萄糖和0.45％的氯化鈉，右旋糖酐葡萄糖注射液中含有質(zhì)量濃度為10％的低分子量右旋糖苷和5％的右旋葡萄糖；凍存液a與凍存液b分開儲存，使用時，凍存液a與凍存液b按體積比為1:2的比例混合，形成抗原特異性t淋巴細胞凍存液。實施例4：一種抗原特異性t淋巴細胞凍存液，包括凍存液a和凍存液b，凍存液a包括以下體積分數(shù)的組分：40％的勃脈力電解質(zhì)注射液、30％的葡萄糖氯化鈉注射液、15％的右旋糖酐葡萄糖注射液和15％的人血白蛋白溶液；凍存液b包括以下體積分數(shù)的組分：30％的勃脈力電解質(zhì)注射液、30％的葡萄糖氯化鈉注射液、15％的右旋糖酐葡萄糖注射液、15％的人血白蛋白溶液和10％的二甲基亞砜；葡萄糖氯化鈉注射液中含有質(zhì)量濃度為5％的右旋葡萄糖和0.45％的氯化鈉，右旋糖酐葡萄糖注射液中含有質(zhì)量濃度為10％的低分子量右旋糖苷和5％的右旋葡萄糖；凍存液a與凍存液b分開儲存，使用時，凍存液a與凍存液b按體積比為1:1的比例混合，形成抗原特異性t淋巴細胞凍存液。實施例5：一種如實施例1所述的凍存液在抗原特異性t淋巴細胞凍存中的應(yīng)用，包括：1.pbmc細胞的分離1.1抽取病人血液，送樣至血液分離室；1.2采集外周血單個核細胞，ficoll離心分離后取中間層細胞；1.3pbs洗滌，得到pbmc(外周血單個核細胞)。2.抗原特異性t淋巴細胞制備及培養(yǎng)2.1取pbmc，加入不含血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配成細胞懸液；2.2按比例加入cd3磁珠，室溫孵育；2.3將孵育好磁珠的細胞，放入磁鐵進行分離；2.4pbs洗滌，得到cd3陽性t淋巴細胞；2.5取經(jīng)過免疫磁珠分離法得到的cd3陽性t淋巴細胞，制備成細胞懸液，進行培養(yǎng)；2.6第3天，加入相應(yīng)病毒滴度的病毒，進行擴增培養(yǎng)。3.抗原特異性t淋巴細胞的凍存3.1培養(yǎng)至9-11天，取對數(shù)生長期的細胞；3.2離心，推薦轉(zhuǎn)速1300r/min，離心3min，吸去上清；3.3重懸，使用配制好的凍存液a，按照1×106個/ml至10×106個/ml濃度重懸；3.4加入配制好的等體積的凍存液b；3.5分裝至細胞凍存管中，在細胞凍存管上記錄好細胞信息；3.6將細胞凍存管放置于程序凍存盒中，先于-80℃冷凍，然后轉(zhuǎn)入液氮罐中凍存，得到凍存的所述抗原特異性t淋巴細胞。當程序凍存盒的溫度大于-25℃時，程序凍存盒的溫度將以1℃/min-2℃/min降溫；當程序凍存盒的溫度在從-25℃到-80℃時，降溫過程中，將以5℃/min-7℃/min降溫。4.抗原特異性t淋巴細胞的復蘇4.1調(diào)節(jié)水浴鍋至37℃；4.2從液氮中取出凍存管，立即投入37℃水浴鍋中，迅速晃動直至凍存液完全融解(約1min)，得到復蘇的所述抗原特異性t淋巴細胞；4.3回輸體內(nèi)4.3.1將4.2步驟中的細胞以0.5×106個/ml-2×106個/ml濃度轉(zhuǎn)移至輸血袋內(nèi)。4.3.2將輸血袋針頭與病人血管連接固定，觀察回輸液點滴情況。4.3.3預處理：一般不需任何預處理，但若患者為過敏體質(zhì)或其它情況需根據(jù)醫(yī)囑加入相應(yīng)處理。4.3.4如果回輸液點滴通順，換上細胞轉(zhuǎn)輸袋，調(diào)節(jié)速度為30-40滴/min。4.3.5一般病人觀察10min后如沒有特殊反應(yīng)，將滴速改為60-80滴/min，直至輸完；若患者有心血管方面疾病應(yīng)按醫(yī)囑控制滴速?；剌斶^程中可囑家屬或護士每隔5-10分鐘輕輕擠壓轉(zhuǎn)輸袋底部，使沉淀細胞重新懸浮。4.3.6細胞回輸完成。4.4繼續(xù)培養(yǎng)4.4.1將4.2步驟中的復蘇后的細胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，加入5ml完全培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，推薦轉(zhuǎn)速1300r/min離心3min，棄上清；4.4.2向細胞沉淀內(nèi)加入適量完全培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，進行接種，培養(yǎng)。復蘇后的抗原特異性t淋巴細胞可進行后續(xù)腫瘤殺傷實驗、細胞增殖實驗、細胞活性檢測實驗等。效果實施例1、為評估本發(fā)明提供的凍存液對抗原特異性t淋巴細胞凍存、復蘇后對其細胞活性的影響，選用人來源的血液進行外周血單個核細胞的分離、抗原特異性t淋巴細胞制備及培養(yǎng)后，將細胞分別使用以下類別凍存液凍存：cryostorcs10(對照組1)、hycryo-stemcryopreservationmedia(對照組2)、synth-a-freezemedium(對照組3)、stem-cellbanker(對照組4)、oricell通用血清型凍存液(對照組5)和常規(guī)凍存液(70％-80％dmem/1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10％-20％胎牛血清和10％dmso)(對照組6)，本發(fā)明實施例1的凍存液為實驗組。以下為本發(fā)明實施例中所采用的其他廠家凍存液品牌與貨號：表2凍存液商品表表3常規(guī)凍存液成分表dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基(70％-80％)thermofisher11995-040胎牛血清(10％-20％)hyclonesh30084.03dmso10％miltenyi170-076-303細胞按照5×106/ml密度凍存，凍存3個月后進行復蘇，做體外細胞活性率檢測實驗，通過前述細胞復蘇方法，采用臺盼藍(trypanblue)和活-死細胞染色試劑盒(live/deadassaykit)方法檢測細胞活率。從圖1中可以看出，使用本發(fā)明配方所配制成的凍存液，細胞活率明顯提高，較對照組1-6，分別提高111.0％、122.5％、119.8％、115.8％、134.9％和190.4％。檢測結(jié)果表明，采用本發(fā)明所描述的細胞凍存液對抗原特異性t淋巴細胞的復蘇后細胞活率，與常規(guī)凍存液相比，在相同條件下細胞活率提高1.1至1.9倍。2、為評估本發(fā)明所描述的凍存液對抗原特異性t淋巴細胞凍存、復蘇后對其細胞增殖速度的影響，選用人來源的血液進行外周血單個核細胞的分離、抗原特異性t淋巴細胞制備及培養(yǎng)后，將細胞分別使用以下類別凍存液凍存：cryostorcs10(對照組1)、hycryo-stemcryopreservationmedia(對照組2)、synth-a-freezemedium(對照組3)、stem-cellbanker(對照組4)、oricell通用血清型凍存液(對照組5)和常規(guī)凍存液(70％-80％基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10％-20％胎牛血清和10％dmso)(對照組6)，本發(fā)明實施例1的細胞凍存液為實驗組。細胞按照5×106/ml密度凍存，凍存3個月后進行復蘇，進行培養(yǎng)(37℃，5％co2)，培養(yǎng)5天后通過cfse流式細胞儀檢測法，檢測細胞增殖情況。從圖2中可以看出，使用本發(fā)明配方所配制成的凍存液，細胞增殖速度明顯提高，較對照組1-6，分別提高135.8％、162.6％、197.5％、139.6％、202.5％和271.0％。檢測結(jié)果表明，采用本發(fā)明所描述的細胞凍存液對抗原特異性t淋巴細胞復蘇后的增殖速度，與常規(guī)凍存液相比，在相同條件下細胞增殖速度提高1.3至2.7倍。3.為評估本發(fā)明所描述的凍存液對抗原特異性t淋巴細胞凍存、復蘇后對其腫瘤殺傷功能的影響，選用人來源的血液進行外周血單個核細胞的分離、抗原特異性t淋巴細胞制備及培養(yǎng)后，將細胞分別使用以下類別凍存液凍存：cryostorcs10(對照組1)、hycryo-stemcryopreservationmedia(對照組2)、synth-a-freezemedium(對照組3)、stem-cellbanker(對照組4)、oricell通用血清型凍存液(對照組5)和常規(guī)凍存液(70％-80％基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10％-20％胎牛血清和10％dmso)(對照組6)，本發(fā)明實施例1的凍存液為實驗組。細胞按照5×106/ml密度凍存，凍存3個月后進行復蘇，與腫瘤細胞系nalm-6進行共培養(yǎng)(37℃，5％co2)，效應(yīng)t細胞與腫瘤細胞系的比例為1:1，分別使用流式抗體染色。16小時后通過流式細胞儀檢測腫瘤殺傷情況。從圖3中可以看出，使用本發(fā)明配方所配制成的凍存液，腫瘤殺傷能力顯著提升，較對照組1-6，分別提高113.5％、120.6％、144.5％、153.2％、144.8％和186.5％。檢測結(jié)果表明，采用本發(fā)明所描述的細胞凍存液對抗原特異性t淋巴細胞復蘇后的腫瘤殺傷活性，與常規(guī)凍存液相比，在相同條件下腫瘤殺傷活性提高1.1至1.8倍。綜上所述，本發(fā)明中的凍存液配方是針對car-t、tcr-t免疫細胞治療過程中的，抗原特異性t淋巴細胞高活性凍存及復蘇所設(shè)計的，該凍存液包含各類細胞穩(wěn)定劑，在平衡細胞營養(yǎng)比例上進行了多次實驗，最終確定使用本發(fā)明配方制備的凍存液，在凍存和復蘇培養(yǎng)抗原特異性t淋巴中，相對其他凍存液能夠更有效的保持細胞的復蘇成活率，促進其增殖能力，并提高細胞活性，減少免疫細胞表面抗原的丟失，保持t細胞的腫瘤殺傷功能。實驗結(jié)果表明，使用本發(fā)明中的凍存液在相同條件下，細胞復蘇后活率較對照組提高1.1至1.9倍；細胞增殖率較對照組提高1.3至2.7倍；腫瘤殺傷能力較對照組提高1.1至1.8倍。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。當前第1頁12