本發(fā)明屬于蘭科植物組織培養(yǎng)滅菌技術領域，具體涉及一種蘭科植物微量種子滅菌及接種方法，適用于離體保存過程中微量蘭科植物種子的滅菌及接種。
背景技術：
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蘭科(Orchidaceae)的許多物種在觀賞、藥用及生態(tài)保護等方面都有較高的價值，在人們生活和生產過程中發(fā)揮了重要作用。由于人為采挖、氣候變化等因素其野生資源日益減少、賴以生存的環(huán)境不斷遭受破壞。同時，蘭科植物的種子細如粉塵，在自然環(huán)境下很難萌發(fā)，種群的維持和更新困難。我國的所有蘭科物種都已被列入《中國物種紅色名錄》，全世界所有的野生蘭科植物均被列為《野生動植物瀕危物種國際貿易公約》(CITES)的保護范圍，對野生蘭科植物開展遷地保護研究迫在眉睫。采用組織培養(yǎng)技術對蘭科植物進行離體保存研究是保護蘭科物種的有效手段。在整個離體保存操作過程中，種子的無菌處理成功與否非常關鍵?，F(xiàn)有技術通常是用紗布或濾紙等包裹種子在次氯酸鈉或氯化汞溶液中進行消毒，或種子先消毒再過濾等方法，整個操作流程存在滅菌不充分、操作不方便、易污染等情況。特別地，野外能獲得的單個物種的種子數(shù)量通常有限(果莢開裂，殘留的種子很少)，采回的果莢在接種前也易開裂，而且在多個物種同時接種時極易發(fā)生混種。采用現(xiàn)有方法均難以對上述材料順利實現(xiàn)滅菌和接種要求。
技術實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術存在了上述不足之處，借助當前普遍可得的DNA純化柱(包含吸附柱和收集管)對野外獲取的少量的野生蘭科種子進行滅菌和接種，使僅用微量種子也能為野生蘭科植物的離體保存提供無菌種源。該方法將對蘭科植物種質資源的開發(fā)、利用和保護提供重要的技術支持。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供如下技術方案：
一種蘭科植物微量種子的滅菌及接種方法，將DNA純化柱、200μl，1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用，用對折過的硫酸紙收集適量開裂的蘭科種子，簡單的去除果莢碎片雜質后，沿著折痕將種子倒入已滅菌的吸附柱中，然后把吸附柱放入收集管，并將吸附柱做好標記，在無菌條件下，向吸附柱中加入600μl的75％乙醇，倒立純化柱1-2次，之后200-1000rpm離心20s，從加乙醇開始，直到完成離心，整個操作過程控制在28s-35s；倒棄收集管中廢液，向吸附柱中加入600μl無菌水，反復吸打無菌水使種子懸浮，充分漂洗種子，然后200-1000rpm離心20s，洗脫75％乙醇溶液；倒棄收集管中廢液，在無菌條件下向吸附柱中加入600μl的0.1-0.2％氯化汞溶液滅菌4-6min或2％次氯酸鈉溶液消毒6-10min，期間反復吸打溶液使種子懸浮充分滅菌，然后200-1000rpm離心20s；倒棄收集管中廢液，再向吸附柱中加入600μl無菌水，反復吸打無菌水使種子懸浮，充分漂洗種子，然后200-1000rpm離心20s，此操作重復3-4次，使消毒液徹底洗脫；再向離心之后的吸附柱中添加600μl無菌水，改用量程為200μl的槍頭反復吸打無菌水獲得種子懸濁液；另吸取50-300μl不等體積的種子懸濁液到培養(yǎng)基上，實現(xiàn)接種。
如所述的一種蘭科植物微量種子的滅菌及接種方法，其中DNA純化柱為規(guī)格為1ml吸附柱，2ml收集管。
如所述的一種蘭科植物微量種子的滅菌及接種方法，其中所述的改用量程為200μl的槍頭滅菌前將槍頭前部長1.5cm的部分剪去，避免槍頭口徑過小造成種子堵塞槍頭。
如所述的一種蘭科植物微量種子的滅菌及接種方法，其中所述的改用量程為200μl的槍頭反復吸打無菌水獲得種子懸濁液，進一步吸取50μl種子懸濁液到載玻片上，在體視鏡鏡下統(tǒng)計種子量，便于計算后期種子萌發(fā)率。
如所述的一種蘭科植物微量種子的滅菌及接種方法，包括如下步驟：
步驟1：把規(guī)格為吸附柱1ml，收集管2ml的DNA純化柱、200μl和1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用；
步驟2：用對折過的硫酸紙收集適量開裂的鼓槌石斛種子，去除果莢碎片等雜質后，沿著折痕將種子倒入已滅菌的吸附柱中，蓋好蓋子。把吸附柱放入收集管，在吸附柱上做好標記，然后置于離心管架上；
步驟3：在無菌操作臺上，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 75％乙醇，蓋好蓋子消毒30s，期間倒立1-2次純化柱，整體，在種子消毒的同時，吸附柱內部也得到滅菌，加乙醇，倒立純化柱，上離心機都在消毒30s之內完成，然后600-800rpm離心20s；
步驟4：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液，吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 0.2％氯化汞滅菌4-6min，反復吸打溶液使種子懸浮得到充分滅菌，然后600-800rpm離心20s；
步驟5：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，此時吸附柱及種子已經過乙醇、氯化汞消毒處于無菌狀態(tài)，用1ml移液槍加入600μl無菌水，反復吸打無菌水使種子懸浮，充分漂洗種子，然后600-800rpm離心20s；
步驟6：重復步驟5，3-4次；
步驟7：用1ml移液槍取600μl無菌水加入吸附柱中，然后用200μl的移液槍反復吸打使之呈種子懸濁液，吸取50μl種子懸濁液到載玻片上，在體視鏡下統(tǒng)計種子量，以便于計算后期種子萌發(fā)率；另吸取100μl的種子懸濁液接種到培養(yǎng)基上；
步驟8：把培養(yǎng)基移到溫度25±2℃暗培養(yǎng)3-5天，后光照培養(yǎng)一周，種子萌發(fā)。
如所述的一種蘭科植物微量種子的滅菌及接種方法，包括如下步驟：
步驟1：把規(guī)格為吸附柱1ml，收集管2ml的DNA純化柱、200μl和1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用；
步驟2：用對折過的硫酸紙收集適量開裂的虎頭蘭種子，去除果莢碎片等雜質后，沿著折痕將種子倒入已滅菌的吸附柱中，蓋好蓋子。把吸附柱放入收集管，在吸附柱上做好標記，然后置于離心管架上；
步驟3：在無菌操作臺上，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 75％乙醇，蓋好蓋子消毒30s，期間倒立1-2次純化柱，整體，在種子消毒的同時，吸附柱內部也得到滅菌，加乙醇，倒立純化柱，上離心機都在消毒30s之內完成，然后200-300rpm離心20s；
步驟4：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 0.2％氯化汞滅菌4-6min，反復吸打溶液使種子懸浮得到充分滅菌，然后200-300rpm離心20s；
步驟5：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，此時吸附柱及種子已經過乙醇、氯化汞消毒處于無菌狀態(tài)，用1ml移液槍加入600μl無菌水，反復吸打無菌水使種子懸浮，充分漂洗種子，然后200-300rpm離心20s；
步驟6：重復步驟5，3-4次；
步驟7：用1ml移液槍取600μl無菌水加入吸附柱中，然后用槍頭前部長約1.5cm的部分被剪去的200μl的移液槍，反復吸打使之呈種子懸濁液，吸取50μl種子懸濁液到載玻片上，在體視鏡下統(tǒng)計種子量，以便于計算后期種子萌發(fā)率，吸取150μl種子懸濁液接到培養(yǎng)基上；
步驟8：把培養(yǎng)物移到溫度23±2℃暗培養(yǎng)一周后，再移至光照條件下培養(yǎng)一個月后種子膨大開始萌發(fā)。
本發(fā)明還提供了一種蘭科植物微量種子的滅菌及接種方法用于離體保存過程中微量蘭科植物種子的滅菌及接種的方法。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明結合組織培養(yǎng)技術的滅菌方法和DNA純化柱等工具，設計了一套特別適用于果莢開裂、細小且微量的蘭科植物種子的滅菌和接種方法。該技術克服了蘭科植物種子在消毒過程中易出現(xiàn)的滅菌不充分、混種及消毒液殘留的問題，能高效地進行微量的蘭科植物種子的消毒和接種，有效降低污染率，具有實驗器材易得、節(jié)約材料、成本低廉、操作方便、接種效率高等優(yōu)點?？舍槍ξ⒘?、細小的蘭科種子進行批量高效滅菌、徹底去除消毒液殘留等問題。當接種的種子量較多時，也可分裝多個或改用更大體積的純化柱達成目的。
具體實施方式：
下面用本發(fā)明的實施例來進一步說明本發(fā)明的實質性內容，但并不以此來限定本發(fā)明。
實施例1：
1、材料：鼓槌石斛DendrobiumchrysotoxumLindley，種子大小約為0.43×0.10mm。
2、實驗器材：超凈臺、離心機、離心管架、DNA純化柱、移液槍、200μl和1ml槍頭、滅菌鍋、體視鏡、載玻片；
3、操作過程：
步驟1：把DNA純化柱(規(guī)格：吸附柱1ml，收集管2ml)、200μl和1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用；
步驟2：用對折過的硫酸紙收集適量開裂的鼓槌石斛種子，簡單的去除果莢碎片等雜質后沿著折痕將種子倒入已滅菌的吸附柱中，蓋好蓋子。把吸附柱放入收集管，在吸附柱上做好標記，然后置于離心管架上。
步驟3：在無菌操作臺上，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 75％乙醇，蓋好蓋子消毒30s，期間倒立1-2次純化柱(整體)，在種子消毒的同時，吸附柱內部也得到滅菌。加乙醇，倒立純化柱，上離心機都在消毒30s之內完成，然后600-800rpm離心20s。
步驟4：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 0.2％氯化汞滅菌4-6min，反復吸打溶液使種子懸浮得到充分滅菌，然后600-800rpm離心20s。
步驟5：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，此時吸附柱及種子已經過乙醇、氯化汞消毒處于無菌狀態(tài)。用1ml移液槍加入600μl無菌水，反復吸打無菌水使種子懸浮，充分漂洗種子，然后600-800rpm離心20s。
步驟6：重復步驟5，3-4次。
步驟7：用1ml移液槍取600μl無菌水加入吸附柱中，然后用200μl的移液槍反復吸打使之呈種子懸濁液，吸取50μl種子懸濁液到載玻片上，在體視鏡下統(tǒng)計種子量，以便于計算后期種子萌發(fā)率；另吸取100μl的種子懸濁液接種到培養(yǎng)基上。
步驟8：把培養(yǎng)基移到溫度25±2℃暗培養(yǎng)3-5天，后光照培養(yǎng)一周，即可觀察到種子萌發(fā)。
實施例2：
1、材料：虎頭蘭Cymbidium hookerianum H.G.Reichenbach，種子大小約為1.57×0.27mm。
2、實驗器材：超凈臺、離心機、離心管架、DNA純化柱、移液槍、200μl和1ml槍頭、滅菌鍋、體視鏡、載玻片；
3、操作過程：
步驟1：把DNA純化柱(規(guī)格：吸附柱1ml，收集管2ml)、200μl和1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用；
步驟2：用對折過的硫酸紙收集適量開裂的虎頭蘭種子，簡單的去除果莢碎片等雜質后沿著折痕將種子倒入已滅菌的吸附柱中，蓋好蓋子。把吸附柱放入收集管，在吸附柱上做好標記，然后置于離心管架上。
步驟3：在無菌操作臺上，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 75％乙醇，蓋好蓋子消毒30s，期間倒立1-2次純化柱(整體)，在種子消毒的同時，吸附柱內部也得到滅菌。加乙醇，倒立純化柱，上離心機都在消毒30s之內完成，然后200-300rpm離心20s。
步驟4：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 0.2％氯化汞滅菌4-6min，反復吸打溶液使種子懸浮得到充分滅菌，然后200-300rpm離心20s。
步驟5：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，此時吸附柱及種子已經過乙醇、氯化汞消毒處于無菌狀態(tài)。用1ml移液槍加入600μl無菌水，反復吸打無菌水使種子懸浮，充分漂洗種子，然后200-300rpm離心20s。
步驟6：重復步驟5，3-4次。
步驟7：用1ml移液槍取600μl無菌水加入吸附柱中，然后用槍頭前部長約1.5cm的部分被剪去的200μl的移液槍(虎頭蘭種子會造成200μl槍頭堵塞)反復吸打使之呈種子懸濁液，吸取50μl種子懸濁液到載玻片上，在體視鏡下統(tǒng)計種子量，以便于計算后期種子萌發(fā)率。吸取150μl種子懸濁液接到培養(yǎng)基上。
步驟8：把培養(yǎng)物移到溫度23±2℃暗培養(yǎng)一周后，再移至光照條件下培養(yǎng)一個月后種子膨大開始萌發(fā)。