本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種長白忍冬的組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
長白忍冬（Lonicera ruprechtiana Regel）是忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬屬落葉灌木。主要分布于我國東北地區(qū)的東部，朝鮮半島北部、西伯利亞東部及遠(yuǎn)東地區(qū)也有分布。單葉對(duì)生，唇形花冠先白色后變黃色，芳香；漿果紅色，圓形，掛果時(shí)間長，綠葉襯托著紅果，甚是美觀。耐旱抗寒性強(qiáng)，是東北地區(qū)觀花賞果的優(yōu)良的鄉(xiāng)土綠化樹種。
忍冬屬植物具有清熱解毒、保肝利膽、抗氧化、提高免疫力等功效。其花蕾和果實(shí)中還含有人體必需的微量元素、氨基酸和其它一些營養(yǎng)成分，具有營養(yǎng)保健價(jià)值。研究表明，長白忍冬的化學(xué)成分等均與金銀花相似，其抗菌、抑菌作用均不亞于金銀花，有些方面還優(yōu)于金銀花，因此長白忍冬可以開發(fā)為新的藥用植物資源，從而滿足醫(yī)療及市場(chǎng)需求。目前，長白忍冬主要采用播種、扦插的方法繁殖，而種子繁殖比較困難，野生資源數(shù)量少不能滿足實(shí)際需要，因此開展其組織培養(yǎng)技術(shù)的研究顯得尤為迫切。
長白忍冬具有很高的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但目前現(xiàn)存野生資源數(shù)量少，因此培育大量?jī)?yōu)質(zhì)苗木勢(shì)在必行。目前長白忍冬主要靠扦插的方法繁殖，但受插穗來源和季節(jié)限制，生長速度慢。因此,有必要建立一種長白忍冬的離體快繁方法,為其良種快速繁育提供技術(shù)支撐和保障, 從生產(chǎn)實(shí)踐上為園林綠化快速培育苗木解決技術(shù)上的難題，為其進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種長白忍冬離體快繁方法,通過外植體選擇及消毒、啟動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根誘導(dǎo)培養(yǎng)、煉苗移栽等過程實(shí)現(xiàn)長白忍冬的離體快繁,從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
本發(fā)明提供一種長白忍冬離體快繁技術(shù),包括以下步驟：
（1）外植體的消毒及初代培養(yǎng)：選擇生長健壯、無病蟲害的當(dāng)年萌發(fā)的幼嫩枝條為外植體，修剪成5cm左右的頂稍，放在滴加少量洗潔精的水溶液燒杯中的浸泡10 min，然后置流水下沖洗20 min，最后在超凈臺(tái)上先用70%乙醇表面消毒20 s，無菌水沖去殘留乙醇，再用0.1% HgCl2溶液（含0.1%Tween20）浸泡5～6 min，無菌水漂洗5次。將嫩枝修剪成1cm左右?guī)а壳o段接種于啟動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于每天光照10～12h,光照強(qiáng)度約為20001x,培養(yǎng)溫度為23～25℃條件下培養(yǎng),直至誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)生長；
（2）繼代增殖培養(yǎng)：將腋芽萌發(fā)生長的芽苗轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng),置于每天光照12小時(shí),光照強(qiáng)度為20001x,培養(yǎng)溫度為23～25℃條件下培養(yǎng)，直至腋芽萌發(fā)和產(chǎn)生叢生芽；
（3）生根誘導(dǎo)培養(yǎng)：將高度約為3cm的生長健壯的無根苗接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo), 置于每天光照12小時(shí),光照強(qiáng)度為2000～25001x,培養(yǎng)溫度為23～25℃條件下培養(yǎng)至生根；
(4)煉苗移栽: 長白忍冬在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30～35d后，挑選生長健壯、根系發(fā)達(dá)的組培苗, 先打開封口膜置于自然光照下煉苗3～5d, 然后用清水洗凈根部殘留的培養(yǎng)基, 移栽到已消毒的含有等量珍珠巖和蛭石的基質(zhì)中。
上述步驟(1)所述的啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂粉，pH值為5.8。培養(yǎng)40d，腋芽萌發(fā)并伸長生長至4.0cm左右。
上述步驟（2)所述的增殖培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L 6-BA+0.8 mg/L KT+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/瓊脂粉，pH值為5.8，增殖系數(shù)平均為10.2，繼代周期為40d。
上述步驟(3)所述的生根培養(yǎng)基為1/2MS+1g/L活性炭 +15g/L蔗糖+6g/L瓊脂粉,pH值為5.8。生根培養(yǎng)15d，在莖基部的皮部分化出不定根，主根生長10d左右開始分化出許多須根，35d后，平均主根數(shù)量為4～6條，根長3～4cm，生根率90%。
上述步驟(4)移栽前將基質(zhì)用0.3%高錳酸鉀溶液淋透消毒，然后再用清水沖淋3～5遍。移栽前期覆蓋塑料薄膜保濕并用遮蔭網(wǎng)適當(dāng)遮陰，每天早晚噴霧2次，每隔5天噴施800倍多菌靈殺菌溶液，移栽后期逐漸降低濕度，增加光照。移栽15d左右長出新根，萌發(fā)新葉，移栽成活率達(dá)85％以上。保證溫濕度平衡和光照需求是移栽成功的關(guān)鍵。
本發(fā)明的有益效果：1.本發(fā)明為長白忍冬優(yōu)質(zhì)種苗的快速繁殖提供一條有效途徑，采用組織培養(yǎng)的技術(shù)可實(shí)現(xiàn)植株再生。
本發(fā)明采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)條件可控，重復(fù)性強(qiáng)，可周年生產(chǎn)。本發(fā)明通過誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)和產(chǎn)生叢生芽的兩種途徑，既保持了母株的優(yōu)良遺傳特性又可在短時(shí)間內(nèi)繁育大量苗木。本發(fā)明在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過改進(jìn)增殖和生根培養(yǎng)基的配方，提高了增殖系數(shù)、提高了根系質(zhì)量，縮短了生根時(shí)間，很大程度上提高了長白忍冬的育苗效率，利于工廠化生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明,不是對(duì)本發(fā)明的限制。
具體實(shí)施
（1）外植體的消毒及啟動(dòng)培養(yǎng)：選擇生長健壯的無病蟲害的當(dāng)年萌發(fā)的幼嫩枝條或萌發(fā)條為外植體，修剪成適當(dāng)長度的頂稍放在滴加少量洗潔精的水溶液燒杯中的浸泡10 min，然后置流水下沖洗20 min，最后在超凈臺(tái)上先用70%～75%乙醇表面消毒20 s，無菌水沖去殘留乙醇，再用0.1% HgCl2溶液（含0.1%Tween20）浸泡5～6 min，無菌水漂洗5次將嫩枝剪成1cm左右?guī)а壳o段接種于啟動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于每天光照10～12h，光照強(qiáng)度為15001x，培養(yǎng)溫度為23～25℃條件下培養(yǎng)。所用的啟動(dòng)培養(yǎng)基為不加任何植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的MS培養(yǎng)基，附加30g/L蔗糖和6g/L瓊脂粉，pH值為5.8。經(jīng)過40d誘導(dǎo)培養(yǎng)，腋芽萌發(fā)抽枝長約4cm。
（2）繼代增殖培養(yǎng)：將腋芽萌發(fā)伸長生長的芽苗轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng),置于每天光照12小時(shí),光照強(qiáng)度為15001x,培養(yǎng)溫度為23～25℃條件下培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L 6-BA+0.8 mg/L KT+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/瓊脂粉，，pH值為5.8。增殖系數(shù)為10.2，繼代周期為40d。
（3）生根誘導(dǎo)培養(yǎng)：將高度約為3cm生長健壯的無根苗接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo), 置于每天光照12小時(shí),光照強(qiáng)度為2000～25001x,培養(yǎng)溫度為23～25℃條件下培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基為 1/2MS +1g/L活性炭 +15g/L蔗糖+6g/L瓊脂粉,pH值為5.8。生根培養(yǎng)15d，在莖基部的皮部分化出不定根，主根生長10d左右開始分化出8～10須根，35d后平均主根數(shù)量為4～6條，根長約4cm，生根率90%。
(4) 煉苗移栽: 長白忍冬在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30～35d后，挑選生長健壯、根系發(fā)達(dá)的組培苗, 先打開封口膜置于自然光照下煉苗3～5d, 然后用清水洗凈根部殘留的培養(yǎng)基, 移栽到已消毒的基質(zhì)中（珍珠巖：蛭石=1：1），移栽期間保證溫濕度條件，精心管護(hù)，移栽成活率達(dá)85％以上。