防治植物線蟲的伴胞晶體蛋白組合物及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種防治植物寄生線蟲的伴胞晶體蛋白組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物寄生線蟲病是農(nóng)作物的重要病害之一。全球每年由植物寄生線蟲所造成的作物損失超過千億美元(Chiwold，2003)，線蟲病害已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的一個(gè)突出問題。目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常采用化學(xué)殺線蟲劑來防治植物寄生線蟲病害，但現(xiàn)今市場上殺線蟲劑的品種有限，大部分為高毒、高殘留農(nóng)藥，長期單一地使用高毒、高殘留的化學(xué)殺線蟲劑，不僅對環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染，也引發(fā)了農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)、線蟲抗藥性日益突出等系列環(huán)境和社會(huì)問題。近年來，隨著人們對農(nóng)產(chǎn)品安全的日益關(guān)注，化學(xué)農(nóng)藥的使用越來越受到限制，因此，研發(fā)有效的殺線蟲微生物以補(bǔ)充或替代化學(xué)殺線蟲劑就顯得日益迫切。

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是目前世界上應(yīng)用最廣泛、最成功的微生物殺蟲劑，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、貯藏以及衛(wèi)生等領(lǐng)域的害蟲防治。自從1961年Ciordia等首次發(fā)現(xiàn)Bt對牛腸道蛇形毛圓線蟲(thichostrongylus colubriformis)卵和幼蟲有殺滅作用以來，Bt的殺線蟲作用才逐漸引起人們的關(guān)注。1985年Bone等首次證實(shí)了Bt伴胞晶體蛋白(δ-內(nèi)毒素)對線蟲的作用活性，2003年Wei等研究了不同基因產(chǎn)生的伴胞晶體蛋白對幾種自由生活線蟲的毒性，從兩個(gè)主要的Bt晶體蛋白亞家族中表達(dá)出了7種不同的晶體毒素蛋白，通過測試這些晶體毒素蛋白對自由生活的線蟲毒性，證實(shí)了其中4種晶體毒素蛋白(Cry5B、Cry6A、Cryl4A、Cry21A)對多種線蟲種類均有活性，所測試的線蟲至少對一種晶體毒素蛋白敏感，從而明確提出Bt晶體毒素蛋白具有殺線蟲能力(Wei JZ,2003)。隨著研究的深入，Bt及其伴胞晶體蛋白防治植物線蟲病害的效果不斷得到肯定。美觀Mycogen公司篩選到多株對植物病原線蟲具有作用活性的Bt菌株和伴胞晶體蛋白，并申請了多項(xiàng)專利。目前發(fā)現(xiàn)的具有殺線蟲作用的Bt伴胞晶體蛋白主要有Cry 5、Cry 6、Cry 12、Cry 13、Cry 14以及Cry 21等幾大類。

本申請人所在研究團(tuán)隊(duì)長期從事植物線蟲生防菌株的篩選與開發(fā)利用研究工作，篩選獲得了高毒力殺線蟲Bt菌株YC-10，其對南方根結(jié)線蟲、大豆孢囊線蟲和咖啡短體線蟲等具有很好的毒殺作用(已獲得國家發(fā)明專利，ZL 201110261675.8)。隨后對該菌株進(jìn)行了全基因組測序，序列登錄號(hào)為CP011349，從基因組序列信息中獲得伴胞晶體蛋白cry基因序列，并對該菌株的cry基因進(jìn)行了克隆與原核表達(dá)，利用純化的表達(dá)蛋白進(jìn)行了室內(nèi)活性測定，表明Cry1Ia蛋白對南方根結(jié)線蟲J2、大豆孢囊線蟲J2具有很好的殺線蟲作用活性(已申請國家發(fā)明專利，申請?zhí)枺?01510367317.3)。

有研究表明使用兩種或多種不同類型的殺蟲晶體蛋白進(jìn)行復(fù)配，可以提高殺蟲活性，擴(kuò)大殺蟲譜，有效延緩或克服害蟲抗藥性的產(chǎn)生。1985年，Wu和Chang等發(fā)現(xiàn)Bt以色列亞種(B.thuringiensis subsp.israelensis)中26kD與65、130kD蛋白組合均有增效作用。1996年Lee等發(fā)現(xiàn)Cry1Aa與Cry1Ac組合，增強(qiáng)了對舞毒蛾的作用活性。Vadim等(2003)測定了蛋白P20、Cyt1Aa、Cry4Aa以及Cry11Aa之間不同組合對登革熱蚊子毒性，結(jié)果表明蛋白P20和Cyt1Aa對Cry4Aa及Cry11Aa都存在協(xié)同增效作用。Xue等(2005)研究了殺蟲蛋白Cry1Aa與Cry1c組合物對甜菜夜蛾的毒性，表明兩者以1:1比例混合比單獨(dú)的毒力有很大的提高。蔡吉林等(2013)報(bào)道了Cry1Ea和Cry9Aa蛋白以及Cry1Ai和Cry9Aa蛋白在1:1混配時(shí)，對小菜蛾(Plutella xylostella(Linnaeus))表現(xiàn)出了顯著的增效作用。但還未見有關(guān)于Cry1Ia和Cry1Ac Bt蛋白組合物在植物線蟲防治上的協(xié)同增效作用的相關(guān)研究報(bào)道。而發(fā)現(xiàn)新的殺線蟲蛋白以及協(xié)同增效蛋白組合物在防治植物線蟲病害上將具有重要意義，是保障農(nóng)業(yè)可持續(xù)安全生產(chǎn)的重要手段。

湖南省植物保護(hù)研究所利用本單位分離獲的Bt菌株中相關(guān)Bt伴胞晶體蛋白基因進(jìn)行克隆表達(dá)獲得的不同Bt伴胞晶體蛋白，在對單個(gè)Bt伴胞晶體蛋白進(jìn)行了殺線蟲活性測試的基礎(chǔ)上，對Bt伴胞晶體蛋白進(jìn)行組合混配，研究其蛋白間的協(xié)同增效作用，以期獲得對線蟲作用效果好的Bt蛋白組合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種低毒、生態(tài)環(huán)保，能延緩線蟲抗藥性的產(chǎn)生等優(yōu)勢的防治植物線蟲蛋白組合物，還提供了該殺線蟲蛋白組合物在防治植物寄生線蟲中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，提供了一種防治植物線蟲的伴胞晶體蛋白組合物，包括蘇云金芽孢桿菌伴胞晶體蛋白Cry1Ia和Cry1Ac，所述Cry1Ia的氨基酸序列為SEQ ID NO：1所示，所述Cry1Ac的氨基酸序列為SEQ ID NO：2所示。

上述的防治植物線蟲的伴胞晶體蛋白組合物，優(yōu)選的，所述Cry1Ia和Cry1Ac的質(zhì)量比為1∶3～3∶1。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述Cry1Ia和Cry1Ac的質(zhì)量比為1∶1。

作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種上述的防治線蟲的伴胞晶體蛋白組合物在防治植物寄生線蟲中的應(yīng)用。

上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述防治線蟲的伴胞晶體蛋白組合物的濃度為20.0mg/L～40.0mg/L。

上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述植物寄生線蟲為根結(jié)屬線蟲。

上述的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述植物寄生線蟲為孢囊屬線蟲。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)本發(fā)明針對目前Bt蛋白在線蟲防治應(yīng)用上的不足，利用已有的Bt Cry蛋白資源，將其進(jìn)行不同組合，以期獲得具有較好殺線蟲作用效果的Cry蛋白組合物，為殺線蟲制劑的開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。本發(fā)明提供一組來自Bt菌株的蛋白組合物Cry1Ia和Cry1Ac，該組合物對植物線蟲具有顯著的協(xié)同增效作用，組合物比單個(gè)蛋白作用活性更強(qiáng)，防治效果得到顯著提高，可以達(dá)到高效防治植物線蟲病害的目的。同時(shí)組合物低毒、生態(tài)環(huán)保，能延緩線蟲抗藥性的產(chǎn)生等優(yōu)勢，可做為新型的生物農(nóng)藥。

(2)本發(fā)明提供了該蛋白組合物中活性蛋白的有效組合比例，當(dāng)Cry1Ia蛋白和Cry1Ac蛋白按照質(zhì)量比為1∶1混合時(shí)，協(xié)同增效作用最顯著，對南方根結(jié)線蟲J2作用活性共毒系數(shù)達(dá)到了445。

附圖說明

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。

圖1為克隆表達(dá)Cry1Ia蛋白及純化后的PAGE檢測圖(泳道M為蛋白Marker，泳道1-5分別為未經(jīng)誘導(dǎo)的工程菌菌株抽提的蛋白，0.5M IPTG誘導(dǎo)抽提蛋白、轉(zhuǎn)空載體的工程菌菌株抽提的蛋白、親和層析純化Cry1Ia蛋白、脫鹽濃縮后的Cry1Ia蛋白)。

圖2為克隆表達(dá)Cry1Ac蛋白及純化后的PAGE檢測圖(泳道M為蛋白Marker，泳道1-5分別為未經(jīng)誘導(dǎo)的工程菌菌株抽提的蛋白，0.5M IPTG誘導(dǎo)抽提蛋白、轉(zhuǎn)空載體的工程菌菌株抽提的蛋白、親和層析純化Cry1Ac蛋白、脫鹽濃縮后的Cry1Ac蛋白)。

圖3為Cry1Ia與Cry1Ac蛋白組合物處理南方根結(jié)線蟲J2室內(nèi)生測圖(a為對照，b為蛋白組合物處理)。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體優(yōu)選的實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例

以下實(shí)施例中所采用的材料和儀器均為市售。

實(shí)施例1：

一種本發(fā)明的Cry1Ia蛋白，其序列為：

MKLKNQDKHQSFSSNAKVDKISTDSLKNETDIELQNINHEDCLKMSEYENVEPFVSASTIQTGIGIAGKILGTLGVPFAGQVASLYSFILGELWPKGKNQWEIFMEHVEEIINQKISTYARNKALTDLKGLGDALAVYHDSLESWVGNRNNTRARSVVKSQYIALELMFVQKLPSFAVSGEEVPLLPIYAQAANLHLLLLRDASIFGKEWGLSSSEISTFYNRQVERAGDYSDHCVKWYSTGLNNLRGTNAESWVRYNQFRRDMTLMVLDLVALFPSYDTQMYPIKTTAQLTREVYTDAIGTVHPHPSFTSTTWYNNNAPSFSAIEAAVVRNPHLLDFLEQVTIYSLLSRWSNTQYMNMWGGHKLEFRTIGGTLNISTQGSTNTSINPVTLPFTSRDVYRTESLAGLNLFLTQPVNGVPRVDFHWKFVTHPIASDNFYYPGYAGIGTQLQDSENELPPEATGQPNYESYSHRLSHIGLISASHVKALVYSWTHRSADRTNTIEPNSITQIPLVKAFNLSSGAAVVRGPGFTGGDILRRTNTGTFGDIRVNINPPFAQRYRVRIRYASTTDLQFHTSINGKAINQGNFSATMNRGEDLDYKTFRTVGFTTPFSFLDVQSTFTIGAWNFSSGNEVYIDRIEFVPVEVTYEAEYDFEKAQEKVTALFTSTNPRGLKTDVKDYHIDQVSNLVESLSDEFYLDEKRELFEIVKYAKQLHIERN。

一種本發(fā)明的Cry1Ac蛋白，其序列為：

MDNNPNINECIPYNCLSNPEVEVLGGERIETGYTPIDISLSLTQFLLSEFVPGAGFVLGLVDIIWGIFGPSQWDAFLVQIEQLINQRIEEFARNQAISRLEGLSNLYQIYAESFREWEADPTNPALREEMRIQFNDMNSALTTAIPLLAVQNYQVPLLSVYVQAANLHLSVLRDVSVFGQRWGFDAATINSRYNDLTRLIGNYTDYAVRWYNTGLERVWGPDSRDWVRYNQFRRELTLTVLDIVALFPNYDSRRYPIRTVSQLTREIYTNPVLENFDGSFRGSAQGIERSIRSPHLMDILNSITIYTDAHRGYYYWSGHQIMASPVGFSGPEFTFPLYGTMGNAAPQQRIVAQLGQGVYRTLSSTFYRRPFNIGINNQQLSVLDGTEFAYGTSSNLPSAVYRKSGTVDSLDEIPPQNNNVPPRQGFSHRLSHVSMFRSGSSSSVSIIRAPMFSWIHRSAEFNNIIASDSITQIPAVKGNFLFNGSVISGPGFTGGDLVRLNSSGNNIQNRGYIEVPIHFPSTSTRYRVRVRYASVTPIHLNVNWGNSSIFSNTVPATATSLDNLQSSDFGYFESANAFTSSLGNIVGVRNFSGTAGVIIDRFEFIPVTATLEAEYNLERAQKAVNALFTSTNQLGLKTNVTDYHIDQVSNLVTYLSDEFCLDEKRELSEKVKHAKRLSDERNLLQDSNFKDINRQPERGWGGSTGITIQGGDDVFKENYVTLSGTFDECYPTYLYQKIDESKLKAFTRYQLRGYIEDSQDLEIYLIRYNAKHETVNVPGTGSLWPLSAQSPIGKCGEPNRCAPHLEWNPDLDCSCRDGEKCAHHSHHFSLDIDVGCTDLNEDLGVWVIFKIKTQDGHARLGNLEFLEEKPLVGEALARVKRAEKKWRDKREKLEWETNIVYKEAKESVDALFVNSQYDQLQADTNIAMIHAADKRVHSIREAYLPELSVIPGVNAAIFEELEGRIFTAFSLYDARNVIKNGDFNNGLSCWNVKGHVDVEEQNNQRSVLVVPEWEAEVSQEVRVCPGRGYILRVTAYKEGYGEGCVTIHEIENNTDELKFSNCVEEEIYPNNTVTCNDYTVNQEEYGGAYTSRNRGYNEAPSVPADYASVYEEKSYTDGRRENPCEFNRGYRDYTPLPVGYVTKELEYFPETDKVWIEIGETEGTFIVDSVELLLMEE。

本實(shí)施例1中cry1Ia和Cry1Ac基因來自于蘇云金芽孢桿菌YC-10，蘇云金芽孢桿菌YC-10菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址位于中國武漢大學(xué)，保藏日期2010年1月21日，保藏名稱為蘇云金芽孢桿菌YC-10，保藏號(hào)為CCTCC NO：M 2010023(已獲得國家發(fā)明專利，ZL 201110261675.8)。工程菌菌株cry1Ia-pET-BL21和Cry1Ac-pET-BL21是申請人所在課題組所構(gòu)建的能有效表達(dá)伴胞晶體蛋白Cry1Ia(81kDa)和Cry1Ac(133kDa)的重組菌株。為了得到純化的Cry1Ia和Cry1Ac蛋白以及后續(xù)的生物測定和復(fù)配活性研究，申請人以工程菌菌株cry1Ia-pET-BL21和Cry1Ac-pET-BL21為出發(fā)菌株，對兩個(gè)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，并通過蛋白純化處理系統(tǒng)，利用親和層析法對表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化，利用PAGE電泳檢測蛋白純度，酶標(biāo)儀測量蛋白濃度。

具體蛋白誘導(dǎo)純化步驟如下：

(1)將甘油保存的工程菌菌株cry1Ia-pET-BL21和Cry1Ac-pET-BL21利用LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行活化。挑取單胞利用LB液體培養(yǎng)基37℃，200rmp搖瓶培養(yǎng)8h作為放大培養(yǎng)種子。以2％(v/v)比例接種種子液到LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rmp培養(yǎng)12h，加入0.5M IPTG，20℃，200rmp誘導(dǎo)培養(yǎng)96h。

(2)離心收集菌體，加入0.01M PBS緩沖液(pH7.2)洗滌3次，菌體懸浮在50mLPBS緩沖液中。利用超聲波破碎菌體，離心收集含有表達(dá)蛋白的上清液。

(3)將收集的上清液進(jìn)行冷凍干燥濃縮，并利用蛋白純化儀對濃縮液進(jìn)行親和層析(His層析柱)分離，獲得純化的表達(dá)蛋白Cry1Ia和Cry1Ac。

(4)將純化的Cry1Ia和Cry1Ac蛋白分別利用蛋白純化儀進(jìn)行脫鹽處理，并將蛋白溶解在0.05M Tirs-Hcl(pH9.0)中。

(5)將純化的Cry1Ia和Cry1Ac蛋白分別進(jìn)行PAGE電泳檢測，觀察蛋白純度。同時(shí)利用酶標(biāo)儀對純化蛋白進(jìn)行定量，-80℃分小管保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1為隆表達(dá)Cry1Ia蛋白及純化后的PAGE檢測圖，泳道M為蛋白Marker，泳道1～5分別為未經(jīng)誘導(dǎo)的工程菌菌株抽提的蛋白，0.5M IPTG誘導(dǎo)抽提蛋白、轉(zhuǎn)空載體的工程菌菌株抽提的蛋白、親和層析純化Cry1Ia蛋白、脫鹽濃縮后的Cry1Ia蛋白。圖2為克隆表達(dá)Cry1Ac蛋白及純化后的PAGE檢測圖，泳道M為蛋白Marker，泳道1～5分別為未經(jīng)誘導(dǎo)的工程菌菌株抽提的蛋白，0.5M IPTG誘導(dǎo)抽提蛋白、轉(zhuǎn)空載體的工程菌菌株抽提的蛋白、親和層析純化Cry1Ac蛋白、脫鹽濃縮后的Cry1Ac蛋白。

實(shí)施例2：

一種防治植物線蟲的伴胞晶體蛋白組合物，包括實(shí)施例1中的Cry1Ia和Cry1Ac，其質(zhì)量比為1∶1。

本實(shí)施例的伴胞晶體蛋白組合物的制備方法為：

(1)將Cry1Ia蛋白溶液分別稀釋成濃度分別為：5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L和80.0mg/L。

(2)將實(shí)施例1的Cry1Ac蛋白溶液分別稀釋成濃度分別為：5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L和80.0mg/L。

(3)將同一濃度步驟(1)中的Cry1Ia蛋白溶液和步驟(2)中的Cry1Ac蛋白溶液，按照質(zhì)量比為1∶1比例混合得到伴胞晶體蛋白混合物。

實(shí)施例3：

一種實(shí)施例2的伴胞晶體蛋白組合物在防治南方根結(jié)線蟲J2中的應(yīng)用，主要考察其對南方根結(jié)線蟲J2室內(nèi)活性的影響，具體的應(yīng)用方法為：

(1)南方根結(jié)線蟲J2的收集

南方根結(jié)線蟲為實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)盆栽辣椒擴(kuò)繁保存種群，當(dāng)辣椒根系上有大量根結(jié)出現(xiàn)時(shí)，取出根系，用水輕輕沖洗，取下卵囊，于0.5％次氯酸鈉中消毒3min、滅菌水沖洗3次，放入由200目鋼絲網(wǎng)做成的孵化池，并置于培養(yǎng)皿中，加入滅菌水，25℃恒溫培養(yǎng)，3d后每24h收集新孵化的南方根結(jié)線蟲J2備用。

(2)對南方根結(jié)線蟲J2的室內(nèi)活性測定

將含有根結(jié)線蟲J2的懸浮液用滅菌水進(jìn)行稀釋并計(jì)數(shù)，使1mL約含有線蟲100條。

實(shí)驗(yàn)組：利用24孔生化培養(yǎng)板將線蟲懸浮液分別與實(shí)施例2中的伴胞晶體蛋白組合物等體積混合，使蛋白混合物濃度分別為2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L和40.0mg/L。每個(gè)處理重復(fù)4次。

Cry1Ia蛋白組：利用24孔生化培養(yǎng)板將線蟲懸浮液分別與實(shí)施例2的Cry1Ia蛋白溶液等體積混合，使Cry1Ia蛋白溶液濃度分別為2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L和40.0mg/L。每個(gè)處理重復(fù)4次。

Cry1Ac蛋白組：利用24孔生化培養(yǎng)板將線蟲懸浮液分別與實(shí)施例2的Cry1Ac蛋白溶液等體積混合，使Cry1Ac蛋白溶液濃度分別為2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L和40.0mg/L。每個(gè)處理重復(fù)4次。

空白對照組：以0.01M Tris-Hcl(pH9.0)溶液作為對照。

將24孔板放置于25±2℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行保濕培養(yǎng)，并分別于24h、48h、72h和96h分別利用顯微鏡進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)線蟲死亡情況(以針觸之線蟲不動(dòng)視為死亡)。其處理結(jié)果見表1。

表1：Cry1Ia、Cry1Ac蛋白及蛋白混合液對南方根結(jié)線蟲J2室內(nèi)毒力測定結(jié)果

從表1中可以看出Cry1Ia蛋白與Cry1Ac蛋白以1∶1混合，對南方根結(jié)線蟲J2毒殺作用顯著高于單一蛋白的作用效果，說明兩種蛋白間存在明顯的協(xié)同增效作用。

圖3為Cry1Ia與Cry1Ac的伴胞晶體蛋白組合物處理南方根結(jié)線蟲J2室內(nèi)生測圖(a為對照，b為蛋白組合物處理)，結(jié)果表明伴胞晶體蛋白組合物處理南方根結(jié)線蟲J2，其24h死亡率達(dá)100％。

實(shí)施例4：

一種實(shí)施例2的伴胞晶體蛋白組合物在防治大豆孢囊線蟲J2中的應(yīng)用，主要考察其對大豆孢囊線蟲J2室內(nèi)活性的影響，具體的應(yīng)用方法為：

(1)大豆孢囊線蟲J2的收集：

大豆孢囊線蟲為實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)大豆上擴(kuò)繁保存種群，挑取孢囊于0.5％次氯酸鈉中消毒3min、滅菌水沖洗3次，放入由200目鋼絲網(wǎng)做成的孵化池，并置于培養(yǎng)皿中，加入滅菌水，25℃恒溫培養(yǎng)，5d后每24h收集新孵化的大豆孢囊線蟲J2備用。

(1)對大豆孢囊線蟲J2幼蟲的毒力測定

按照實(shí)施例3的方法，檢測Cry1Ia、Cry1Ac和蛋白混合液對大豆孢囊線蟲J2作用，結(jié)果見表2。

表2：Cry1Ia、Cry1Ac蛋白及蛋白混合液對大豆包囊線蟲J2室內(nèi)毒力結(jié)果

從表2可以看出，Cry1Ia蛋白與Cry1Ac蛋白以1∶1混合，對大豆孢囊線蟲J2毒殺作用顯著高于單一蛋白的作用效果，說明兩種蛋白間在防治大豆孢囊線蟲病上存在明顯的協(xié)同增效作用。

實(shí)施例5：考察Cry1Ia蛋白與Cry1Ac蛋白不同比例混合協(xié)同增效作用

以南方根結(jié)線蟲J2為供試靶標(biāo)，將Cry1Ia與Cry1Ac蛋白分別以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3不同比例混合，進(jìn)行室內(nèi)毒力測試，方法如前實(shí)施例3，48h觀察結(jié)果，統(tǒng)計(jì)線蟲死亡率，計(jì)算LC₅₀以及不同配比共毒系數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果如表3。

表3：Cry1Ia與Cry1Ac蛋白復(fù)配不同配比對南方根結(jié)線蟲J2室內(nèi)毒力測定結(jié)果

從表3中可以看出兩種蛋白混合能有效提高其作用活性，由其以1∶1蛋白混合物殺線蟲效果最好，其共毒系數(shù)達(dá)到445。

實(shí)施例6：

一種實(shí)施例2的Cry1Ia和Cry1Ac的伴胞晶體蛋白組合物在溫室條件下防治作物根結(jié)線蟲病的應(yīng)用，具體的應(yīng)用方法為：

1、供試作物為番茄，品種為湘粉一號(hào)(市場購買)。在塑料盆中裝入滅菌土(滅菌土的成分為：粘土∶營養(yǎng)土＝2∶1)，播種番茄。番茄苗長出4～5片真葉時(shí)移栽于直徑15cm小盆缽(盆缽中裝滅菌土)，每盆一棵。待移栽苗成活后進(jìn)行處理。

2、蛋白溶液的配制：

實(shí)驗(yàn)組：將Cry1Ia和Cry1Ac蛋白混合，(Cry1Ia蛋白溶液和Cry1Ac蛋白溶液1∶1)，并以0.05MTris-Hcl溶解，稀釋成濃度分別為：10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L。

藥劑對照組：1.8％阿維菌素乳油800倍稀釋作為對照藥劑。

空白對照組：灌水。

3、處理作物：

分別將實(shí)驗(yàn)組和藥劑對照組的溶液配制成處理液，處理番茄。每組處理10株，每株番茄澆灌100mL處理液，空白對照組灌水100mL。接種根結(jié)線蟲500條/株。每個(gè)處理3次重復(fù)，區(qū)組隨機(jī)排列。將經(jīng)過處理后的番茄置于25℃～27℃的溫室中培養(yǎng)，定期澆水，60d后拔取植株進(jìn)行病情調(diào)查，并根據(jù)根結(jié)數(shù)目進(jìn)行病情分級(jí)，計(jì)算防效。

病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：

0級(jí)：無根結(jié)。

Ⅰ級(jí)：根結(jié)占全根系的1％～25％。

Ⅱ級(jí)：根結(jié)占全根系的26％～50％。

Ⅲ級(jí)：根結(jié)占全根系的51％～75％。

Ⅳ級(jí)：根結(jié)占全根系的76％～100％。

病情指數(shù)(％)＝Σ(各級(jí)植物數(shù)×級(jí)值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)值)×100。

防治效果(％)＝(空白對照病情指數(shù)－藥劑處理后病情指數(shù))/空白對照病情指數(shù)×100。

本實(shí)施例的試驗(yàn)結(jié)果如下表4所示。

表4：Cry1Ia·Cry1Ac蛋白混合液防治番茄根結(jié)線蟲病溫室盆栽試驗(yàn)結(jié)果

從表4中可知：利用本發(fā)明中復(fù)配的Cry1Ia·Cry1Ac蛋白混合液對番茄根結(jié)線蟲病有明顯的防治效果，每株100mL 40mg/L蛋白溶液處理，其防效達(dá)到了70.87％，表現(xiàn)出該蛋白組合物在植物寄生線蟲生物防治上的巨大應(yīng)用潛力。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)和技術(shù)方案的情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動(dòng)和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所做的任何簡單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。