本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及種一種提高千層塔(Huperziaserrata(Thunb.)Trev.)外植體表面滅菌效率的方法。
背景技術(shù)：
千層塔(Huperziaserrata(Thunb.)Trev.)為石松目(Lycopodiales)石杉科(Lycopodiaceae)石杉屬(LycopodiumL.)多年生草本蕨類植物。千層塔始載于《植物名實圖考》，性味辛苦、平。具有散瘀消腫、解毒和止痛的功效。1927年我國科技工作者報道了從該植物中分離的石杉堿甲具有橫紋肌松弛作用，之后的大量研究發(fā)現(xiàn)石杉堿甲是一種高效、低毒、可逆和高選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑?，F(xiàn)在，被石杉堿甲及經(jīng)作為治療阿爾茨海默病(AD，Alzheimerdisease)的藥物，同時在美國被用做益智的營養(yǎng)保健品。但是，千層塔自然資源嚴重短缺。千層塔生長緩慢，野生狀態(tài)下千層塔的繁殖主要以孢子繁殖為主，孢子萌發(fā)周期長，萌發(fā)后屬地下生配子體，需6-15年才能成熟。因此極大地限制了千層塔野生資源的再生。千層塔中的石杉堿甲含量又很低(0.007％)，再加上其全合成石杉堿甲步驟繁瑣、價格昂貴且有副作用。目前，石杉堿甲的提取主要依賴于野生資源，提取率僅為0.006％-0.1％，因而大量的市場需求、受限的自然資源和自身生長繁殖的限制。因此，不論是石杉堿甲直接或者間接獲得都是以千層塔的原植物為原料，這種自然界有限的資源將處于滅絕的邊緣。利用植物組織培養(yǎng)可進行珍稀和瀕危藥用植物的微繁殖，建立高效和穩(wěn)定培養(yǎng)系，培育出脫毒的優(yōu)質(zhì)品種，解決珍稀瀕危藥用植物人工種植存在的種子稀少、種苗奇缺、種質(zhì)退化等嚴重問題，為千層塔的資源再生和可持續(xù)利用提供技術(shù)手段。但是，千層塔組織培養(yǎng)過程主要采用的是葉片、莖和根。這些外植體存在外植體滅菌困難、無菌外植體獲得率低，而且滅菌后大部分死亡，不能生長、分化和增殖等問題。因此，對于千層塔的組織培養(yǎng)，外植體的滅菌至關(guān)重要。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于，提供一種提高千層塔外植體表面滅菌效率的方法，該方法能夠顯著千層塔外植體表面的滅菌效率，同時提高了千層塔外植體的存活率。為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案：一種提高千層塔外植體表面滅菌效率的方法，該方法包括在低壓環(huán)境中將千層塔外植體采用滅菌劑進行滅菌，滅菌后的千層塔外植體在低壓環(huán)境中培養(yǎng)。具體的，所述的低壓環(huán)境是指壓力為40～60KP。更具體的，所述的千層塔外植體指千層塔的根、千層塔的莖或千層塔的葉。進一步的，千層塔外植體采用滅菌劑進行滅菌包括：取千層塔外植體依次經(jīng)流水沖洗、體積分數(shù)為75％的乙醇溶液浸泡、體積分數(shù)為5％的NaOCl溶液浸泡及體積分數(shù)為7％的過氧化氫溶液浸泡，千層塔外植體經(jīng)NaOCl溶液和過氧化氫溶液浸泡時處于低壓環(huán)境。具體的，千層塔外植體在NaOCl溶液中浸泡的低壓環(huán)境時間為5～15min，千層塔外植體在過氧化氫溶液中浸泡的低壓環(huán)境時間為5～10min。另外，將經(jīng)過滅菌劑滅菌處理的千層塔外植體轉(zhuǎn)接到MS固體培養(yǎng)基上于低壓環(huán)境中培養(yǎng)，2周后取出千層塔外植體轉(zhuǎn)移到常壓培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)。還有，低壓環(huán)境中培養(yǎng)的光照強度為2000Lux，低壓環(huán)境中培養(yǎng)的光周期為16h；在常壓培養(yǎng)室中的培養(yǎng)的溫度為25℃。進一步的，在所述的MS固體培養(yǎng)基中添加100～200mg/L的兩性霉素B。優(yōu)選的，所述的低壓環(huán)境中培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為30～40℃。本發(fā)明的優(yōu)點為：(1)本發(fā)明通過低壓結(jié)合溫和的滅菌劑處理，以及滅菌后的低壓和高溫培養(yǎng)，不僅提高了千層塔外植體的滅菌效率，同時還提高了千層塔的移栽成活率，可用于千層塔的組織培養(yǎng)，為千層塔的滅菌培養(yǎng)提供了新思路；(2)對千層塔外植體滅菌，最好的方案是：滅菌時，5％NaOCl浸泡時間為10分鐘，7％過氧化氫浸泡時間為8分鐘，兩種滅菌劑浸泡時的壓力為50KP；滅菌后前兩周培養(yǎng)時，MS固體培養(yǎng)基中含有的兩性霉素B的濃度為150mg/L，培養(yǎng)的壓力為50KP，培養(yǎng)的溫度為35℃。兩周后進行正常的培養(yǎng)。在這樣的條件下，千層塔的葉片除菌率和存活率分別達到60％和75％；千層塔的莖除菌率和存活率達到55％和78％；千層塔的根除菌率和存活率分別達到55％和58％。具體實施方式千層塔在人工組織培養(yǎng)中遇到的最大的問題就是外植體污染嚴重。如果滅菌時間不夠，則滅菌效率極低；如果滅菌時間過長，則外植體成活率極低。嚴重阻礙了千層塔組織培養(yǎng)的成功。本發(fā)明的提高千層塔外植體表面滅菌效率的方法，通過低壓結(jié)合溫和的滅菌劑處理，以及滅菌后的低壓和高溫培養(yǎng)，不僅提高...