峨眉金線蓮種子無激素快速組培繁殖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可利用峨眉金線蓮種子快速繁育種苗的方法，全過程不使用激素，以分布于四川峨眉山地區(qū)的野生或人工種植開花后受粉5個月成熟未開裂金線蓮果實為材料，通過種子→原球莖→完整植株→煉苗移栽的途徑高效快速地繁育種苗。整個過程使用無激素的培養(yǎng)基，一顆成熟果實通過10-12個月左右的組織培養(yǎng)，可快繁培育出5000株以上的優(yōu)質(zhì)種苗，經(jīng)煉苗移栽溫室大棚培養(yǎng)成活率可達95%以上。本發(fā)明方法可以保持峨眉金線蓮的優(yōu)良性狀，保持其優(yōu)良的藥性，且方法簡單、成本低，可以實現(xiàn)工廠化育苗，而且不使用激素，保證了種苗的安全性，對極度瀕危的珍稀藥用植物資源的再生和可持續(xù)利用及種質(zhì)資源的保護都具有重要的意義。
【專利說明】峨眉金線蓮種子無激素快速組培繁殖的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)【技術領域】，具體涉及一種利用峨眉金線蓮成熟蒴果無激 素快速繁育有機種苗的方法。
【背景技術】
[0002] 峨眉金線蓮 K. Y. Lang.)是蘭科（Orchidaceae)、開 唇蘭屬多年生草本植物，同花葉開唇蘭、臺灣、福建、廣東、廣西金線蓮等 統(tǒng)稱為金線蓮。在民間常作藥用，其氨基酸組成、成分、含量及維生素、多糖等含量均高于西 洋參和野山參。其性平味甘，具有清熱、涼血、祛風利濕、強心利尿、固腎平肝以及降血壓等 功效，在治療肝病、高血壓、糖尿病及腫瘤等方面有良好的效果。另外，金線蓮也是觀賞價值 極高的觀賞植物。但是，由于金線蓮屬植物的種子微小，不具胚乳，無發(fā)芽能力，只有與真菌 共生的情況下才能萌發(fā)，因此，發(fā)芽率低，野外生長條件苛刻，自然繁殖和生長緩慢。另外由 于峨眉金線蓮的生境地破壞嚴重，野生峨眉金線蓮資源非常稀少，現(xiàn)已瀕臨滅絕。
[0003]目前已有的研究主要集中在臺灣、福建、廣東及廣西金線蓮中，多以莖段為外植體 材料進行繁殖，未見有利用峨眉金線蓮蒴果快繁育苗的報道。而且所用培養(yǎng)基多含激素，會 造成激素富集到金線蓮種苗中，產(chǎn)品質(zhì)量達不到有機產(chǎn)品的標準，為此開展峨眉金線蓮種 子無激素人工快速培養(yǎng)的研究，建立一套種苗的組織培養(yǎng)快繁體系，對合理保護開發(fā)峨眉 金線蓮種質(zhì)資源并產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)有機種苗有著十分重要的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種利用峨眉金線蓮成熟未開裂果實及無激 素培養(yǎng)基快速繁育種苗的方法，本方法不僅可以進行規(guī)模化生產(chǎn)有機種苗，而且也能有效 保護野生資源。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的： 一種峨眉金線蓮種子無激素快速組培繁殖的方法，所述方法包括如下步驟： a、 選取開花后受粉成熟但未開裂的金線蓮蒴果作為外植體材料，選擇內(nèi)部種胚顏色已 由白色轉(zhuǎn)變?yōu)榻瘘S色絲狀的果實進行消毒處理； b、 種胚萌發(fā)及原球莖分化：將消毒后的蒴果剖開，取出內(nèi)部種子，均勻撒播到種胚萌發(fā) 及原球莖分化培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)10~20天，而后按照光照8h/d - 10h/d - 12h/d - 14h/d 梯度增加光照時間培養(yǎng)，各級培養(yǎng)25~30天，種子萌發(fā)形成原球莖并分化形成帶2片葉長 2-3cm的完整芽苗植株； c、 壯苗及生根培養(yǎng)；將已分化為完整芽苗的植株轉(zhuǎn)接到壯苗及生根培養(yǎng)基上，在溫度 22-25°C，光照強度20001ux，光照時間14-16h/d的條件下培養(yǎng)4-6月，培養(yǎng)出6-7cm根系發(fā) 達的完整大苗； d、 煉苗及移栽溫室大棚培養(yǎng)：經(jīng)生根培養(yǎng)的完整大苗經(jīng)逐步煉苗后從瓶中取出，小心 清洗凈根部培養(yǎng)基，待植株表面水分稍干后移栽溫室大棚培養(yǎng)，移栽后保持溫室大棚溫度 22-32°C，濕度65?75%，成活率可達95%以上。
[0006] 進一步的，所述步驟b中種胚萌發(fā)及原球莖分化培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+香蕉汁 l〇〇g/L + 蔗糖 25 ?35g/L + 瓊脂 6 ?8g/L + 活性炭 1. 5 ?2. 5g/L，pH 值為 5. 8 ?6. 2。
[0007] 進一步的，所述步驟c中壯苗及生根培養(yǎng)基為：改良MS培養(yǎng)基+馬鈴薯汁200g/ L +蔗糖25?35g/L +瓊脂6?8g/L +活性炭1. 5?2. 5g/L，pH值為5. 8?6. 2。所述 改良MS培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基基礎上，大量元素減半，微量元素及有機母液等不變。
[0008] 進一步的，所述步驟a所述消毒處理是指將外植體材料用自來水沖洗2?3小時， 然后用軟毛刷清洗，用蒸餾水沖洗后置超凈工作臺內(nèi)，75%酒精浸泡45s-60s，無菌水清洗 干凈，再用〇. 1%的升汞溶液進行表面消毒15min，無菌水清洗4-5次，每次2分鐘，最后用無 菌濾紙吸干材料表面水分。
[0009] 進一步的，所述步驟d移栽溫室大棚培養(yǎng)是指生根壯苗培養(yǎng)后，煉苗2-3周左右， 組培苗長至6?7cm高時移栽至溫室大棚，移栽用介質(zhì)為腐殖土加少量珍珠巖的混合物，移 栽前用800-1000倍多菌靈或百菌清加生根粉50mg/kg浸根15-20min。所述煉苗是將組培 瓶置于溫室大棚1-2周，然后松蓋2-3天，部分開蓋2-3天，完全去蓋。所述腐殖土與珍珠 巖的重量份數(shù)比為3~4:1。
[0010] 進一步的，所述步驟d所述溫室大棚采用雙層遮蔭網(wǎng)遮光，外層是一層固定的50% 遮陰網(wǎng)，內(nèi)層為可活動的遮陰網(wǎng)，便于調(diào)節(jié)光照強度，移栽2周內(nèi)需遮光80-90%，之后需遮 光60%，溫室大棚中溫度控制在20?26°C，相對濕度控制在65?75%。
[0011] 進一步的，所述步驟a中所述金線蓮是指生長在峨眉山地區(qū)的野生或人工種植開 花后受粉5個月成熟峨眉金線蓮未開裂蒴果。
[0012] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術的有益效果是： 本發(fā)明是以峨眉金線蓮成熟未開裂果實為外植體，通過種子一原球莖一完整植株一 煉苗移栽的途徑高效快速地繁育種苗。整個過程使用無激素的培養(yǎng)基，一顆成熟果實通過 10-12個月左右的組織培養(yǎng)，僅通過原球莖轉(zhuǎn)接一次無需再次繼代培養(yǎng)直接分化成完整的 植株，可快繁培育出5000株以上的優(yōu)質(zhì)種苗，經(jīng)煉苗移栽溫室大棚培養(yǎng)成活率可達95%以 上。
[0013] 本發(fā)明方法可以保持峨眉金線蓮的優(yōu)良性狀，保持其優(yōu)良的藥性，且方法簡單、成 本低，可以實現(xiàn)工廠化育苗，而且不使用激素，保證生產(chǎn)出的種苗不會殘留超標，能為生產(chǎn) 金線蓮有機產(chǎn)品提供優(yōu)質(zhì)種苗，另外對極度瀕危的珍稀藥用植物資源的再生和可持續(xù)利用 及種質(zhì)資源的保護都具有重要的意義。
【具體實施方式】
[0014] 實施例一 本發(fā)明具體可以按照以下方式實施，峨眉金線蓮種子無激素快速組培繁殖的方法，包 括如下步驟： a、選取9?10月份野生或人工種植開花后受粉5個月成熟未開裂金線蓮蒴果作為 外植體材料，選擇內(nèi)部種胚顏色已由白色轉(zhuǎn)變?yōu)榻瘘S色絲狀的果實進行消毒處理：用自來 水沖洗2?3小時，然后用軟毛刷清洗，用蒸餾水沖洗后置超凈工作臺內(nèi)，75%酒精浸泡 45s-60s，無菌水清洗干凈，再用0. 1%的升汞溶液中表面消毒15min，無菌水清洗4-5次，每 次2分鐘最后用無菌濾紙吸干材料表面水分。
[0015] b、種胚萌發(fā)及原球莖分化：將消毒后的蒴果剖開，取出內(nèi)部種子，均勻撒播到萌發(fā) 及分化培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)15天，光照8h/d - 10h/d - 12h/d - 14h/d梯度增加光照時間 培養(yǎng)，光照強度為20001ux，培養(yǎng)溫度為22?25°C，各級培養(yǎng)30天，種子萌發(fā)形成原球莖 并分化形成帶2片葉長2-3cm的完整芽苗植株；所述萌發(fā)及分化培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+香 蕉汁100g/L +蔗糖25?35g/L +瓊脂6?8g/L +活性炭1. 5?2. 5g/L，pH值為5. 8? 6. 2 ； c、 壯苗及生根培養(yǎng)；將已分化為完整芽苗的植株轉(zhuǎn)接到壯苗及生根培養(yǎng)基上，在溫度 22-25°C，光照強度20001ux，光照時間14-16h/d的條件下培養(yǎng)4-6月，培養(yǎng)出6-7cm根系發(fā) 達的完整大苗；所述壯苗及生根培養(yǎng)基為：改良MS培養(yǎng)基（大量元素減半，微量元素及有 機母液等不變）+馬鈴薯汁200g/L +蔗糖25?35g/L +瓊脂6?8g/L +活性炭1. 5? 2.58/1，口11值為5.8?6.2; d、 煉苗及移栽溫室大棚培養(yǎng)：經(jīng)生根培養(yǎng)的健壯大苗經(jīng)逐步煉苗（將組培瓶置于溫室 大棚1-2周，然后松蓋2-3天，部分開蓋2-3天，完全去蓋），然后從瓶中取出，小心清洗凈根 部培養(yǎng)基，待植株表面水分稍干后種植，移栽用介質(zhì)為腐殖土土加少量珍珠巖的混合物，移 栽后保持溫室大棚溫度22-26°C，濕度75%左右，成活率可達95%以上。所述腐殖土與珍珠 巖的重量份數(shù)比為3:1。
[0016] 本發(fā)明所述的MS培養(yǎng)基即為常規(guī)的MS培養(yǎng)基或常規(guī)方法配制的MS培養(yǎng)基。改 良MS培養(yǎng)基：大量無機鹽為MS培養(yǎng)基的一半，微量元素及有機母液等不變。本領域技術 人員可以理解的是，本發(fā)明步驟b、c和d采用的培養(yǎng)基都是通過基礎培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基 或改良MS培養(yǎng)基）配加蔗糖、瓊脂、活性炭等配制得到，上述各物質(zhì)的含量都是配制完成 后各物質(zhì)質(zhì)量所占總體積的含量。其中，瓊脂是以藻類的石花菜屬（Gelidium)及江蘺屬 (Gracilaria)制成的膠產(chǎn)品，為培養(yǎng)基的固化劑。
[0017] 下面通過實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】做進一步的說明，但并不因此將本發(fā)明 的保護范圍限制在實施例之中。
[0018] 實施例二 本實施例選用的材料是峨眉金線蓮野生成熟未開裂果實，采自四川峨眉山。按以下步 驟繁殖： 1、選取9月下旬及10月中旬野生成熟未開裂金線蓮蒴果作為外植體材料，選擇內(nèi)部絲 狀種胚顏色為金黃色或深黃色的果實進行消毒處理：用自來水沖洗2?3小時，然后用軟 毛刷清洗，用蒸餾水沖洗后置超凈工作臺內(nèi)，75%酒精浸泡45s-60s，無菌水清洗干凈，再用 〇. 1%的升汞溶液中表面消毒15min，無菌水清洗4-5次，每次2分鐘最后用無菌濾紙吸干材 料表面水分。
[0019] 2、種胚萌發(fā)及原球莖分化：將消毒后的蒴果剖開，取出內(nèi)部種子，均勻撒播到萌發(fā) 及分化培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)15天，光照8h/d - 10h/d - 12h/d - 14h/d梯度增加光照時間 培養(yǎng)，光照強度為20001ux，培養(yǎng)溫度為22?25°C，各級培養(yǎng)30天，種子萌發(fā)形成原球莖 并分化形成帶2片葉長2-3cm的完整芽苗植株；所述萌發(fā)及分化培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+香 蕉汁100g/L +蔗糖25?35g/L +瓊脂6?8g/L +活性炭1. 5?2. 5g/L，pH值為5. 8? 6. 2 ； 3、 壯苗及生根培養(yǎng)；將已分化為完整芽苗的植株轉(zhuǎn)接到壯苗及生根培養(yǎng)基上，在溫度 22-25°C，光照強度20001ux，光照時間14-16h/d的條件下培養(yǎng)4-6月，培養(yǎng)出6-7cm根系發(fā) 達的完整大苗；所述壯苗及生根培養(yǎng)基為：改良MS培養(yǎng)基（大量元素減半，微量元素及有 機母液等不變）+馬鈴薯汁200g/L +蔗糖25?35g/L +瓊脂6?8g/L +活性炭1. 5? 2.58/1，口11值為5.8?6.2; 4、 煉苗及移栽溫室大棚培養(yǎng)：經(jīng)生根培養(yǎng)的健壯大苗經(jīng)逐步煉苗（將組培瓶置于溫室 大棚1-2周，然后松蓋2-3天，部分開蓋2-3天，完全去蓋），然后從瓶中取出，小心清洗凈根 部培養(yǎng)基，待植株表面水分稍干后種植，移栽用介質(zhì)為腐殖土土加少量珍珠巖的混合物，移 栽后保持溫室大棚溫度22-26°C，濕度75%左右，成活率可達95%以上。移栽后每天澆水3 次，澆至培養(yǎng)基質(zhì)濕透為止（使植株周圍濕度70%左右），每半月施復合肥一次（常見蔬菜 專用肥：氮15%、五氧化二磷7%和氧化鉀8%)，并注意防治病蟲害。所述腐殖土與珍珠巖的 重量份數(shù)比為4:1。
[0020] 實施例三 本實施例選用的材料為峨眉金線蓮，采自四川峨眉山。按以下步驟繁殖峨眉金線蓮。
[0021] a、選取人工種植開花后受粉5個月成熟未開裂得峨眉金線蓮蒴果作為外植體材 料，選擇內(nèi)部絲狀種胚顏色為金黃色或深黃色的果實進行消毒處理：用自來水沖洗2?3小 時，然后用軟毛刷清洗，用蒸餾水沖洗后置超凈工作臺內(nèi)，75%酒精浸泡45s-60s，無菌水清 洗干凈，再用〇. 1%的升汞溶液中表面消毒15min，無菌水清洗4-5次，每次2分鐘最后用無 菌濾紙吸干材料表面水分。
[0022] b、種胚萌發(fā)及原球莖分化：將消毒后的蒴果剖開，取出內(nèi)部種子，均勻撒播到萌發(fā) 及分化培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)15天，光照8h/d - 10h/d - 12h/d - 14h/d梯度增加光照時間 培養(yǎng)，光照強度為20001ux，培養(yǎng)溫度為22?25°C，各級培養(yǎng)30天，種子萌發(fā)形成原球莖 并分化形成帶2片葉長2-3cm的完整芽苗植株；所述萌發(fā)及分化培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+香 蕉汁100g/L +蔗糖25?35g/L +瓊脂6?8g/L +活性炭1. 5?2. 5g/L，pH值為5. 8? 6. 2 ； c、 壯苗及生根培養(yǎng)；將已分化為完整芽苗的植株轉(zhuǎn)接到壯苗及生根培養(yǎng)基上，在溫度 22-25°C，光照強度20001ux，光照時間14-16h/d的條件下培養(yǎng)4-6月，培養(yǎng)出6-7cm根系發(fā) 達的完整大苗；所述壯苗及生根培養(yǎng)基為：改良MS培養(yǎng)基（大量元素減半，微量元素及有 機母液等不變）+馬鈴薯汁200g/L +蔗糖25?35g/L +瓊脂6?8g/L +活性炭1. 5? 2.58/1，口11值為5.8?6.2; d、 煉苗及移栽溫室大棚培養(yǎng)：經(jīng)生根培養(yǎng)的健壯大苗經(jīng)逐步煉苗（將組培瓶置于溫室 大棚1-2周，然后松蓋2-3天，部分開蓋2-3天，完全去蓋），然后從瓶中取出，小心清洗凈根 部培養(yǎng)基，待植株表面水分稍干后種植，移栽用介質(zhì)為腐殖土土加少量珍珠巖的混合物，移 栽后保持溫室大棚溫度22-26°C，濕度75%左右，成活率可達95%以上。移栽后每天澆水3 次，澆至培養(yǎng)基質(zhì)濕透為止（使植株周圍濕度70%左右），每半月施復合肥一次（常見蔬菜 專用肥：氮15%、五氧化二磷7%和氧化鉀8%)，并注意防治病蟲害。
[0023] 下面表1-3顯示實例中不同果實來源及培養(yǎng)基對種子萌發(fā)、分化和壯苗等培養(yǎng)的 影響。
[0024] 表1不同來源種子的萌發(fā)率
【權利要求】
1. 峨眉金線蓮種子無激素快速組培繁殖的方法，其特征在于，所述方法包括如下步 驟： a、 選取開花后受粉成熟但未開裂的金線蓮蒴果作為外植體材料，選擇內(nèi)部種胚顏色已 由白色轉(zhuǎn)變?yōu)榻瘘S色絲狀的果實進行消毒處理； b、 種胚萌發(fā)及原球莖分化：將消毒后的蒴果剖開，取出內(nèi)部種子，均勻撒播到種胚萌發(fā) 及原球莖分化培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)10~20天，而后按照光照8h/d - 10h/d - 12h/d - 14h/d 梯度增加光照時間培養(yǎng)，各級培養(yǎng)25~30天，種子萌發(fā)形成原球莖并分化形成帶2片葉長 2-3cm的完整芽苗植株； c、 壯苗及生根培養(yǎng)；將已分化為完整芽苗的植株轉(zhuǎn)接到壯苗及生根培養(yǎng)基上，在溫度 22-25°C，光照強度20001ux，光照時間14-16h/d的條件下培養(yǎng)4-6月，培養(yǎng)出6-7cm根系發(fā) 達的完整大苗； d、 煉苗及移栽溫室大棚培養(yǎng)：經(jīng)生根培養(yǎng)的完整大苗經(jīng)逐步煉苗后從瓶中取出，小心 清洗凈根部培養(yǎng)基，待植株表面水分稍干后移栽溫室大棚培養(yǎng)，移栽后保持溫室大棚溫度 22-32°C，濕度65?75%，成活率可達95%以上。
2. 根據(jù)權利要求1所述的金線蓮種子無激素快速組培繁殖的方法，其特征在于：所述 步驟b中種胚萌發(fā)及原球莖分化培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+香蕉汁100g/L +蔗糖25?35g/ L +瓊脂6?8g/L +活性炭1. 5?2. 5g/L，pH值為5. 8?6. 2。
3. 根據(jù)權利要求1所述的金線蓮種子無激素快速組培繁殖的方法，其特征在于：所述 步驟c中壯苗及生根培養(yǎng)基為：改良MS培養(yǎng)基+馬鈴薯汁200g/L +蔗糖25?35g/L +瓊 脂6?8g/L +活性炭1. 5?2. 5g/L，pH值為5. 8?6. 2。
4. 根據(jù)權利要求1至3中任一項所述的金線蓮種子無激素快速組培繁殖的方法，其特 征在于：所述步驟a所述消毒處理是指將外植體材料用自來水沖洗2?3小時，然后用軟 毛刷清洗，用蒸餾水沖洗后置超凈工作臺內(nèi)，75%酒精浸泡45s-60s，無菌水清洗干凈，再用 〇. 1%的升汞溶液進行表面消毒15min，無菌水清洗4-5次，每次2分鐘，最后用無菌濾紙吸 干材料表面水分。
5. 根據(jù)權利要求1至4中任一項所述的金線蓮種子無激素快速組培繁殖的方法，其 特征在于：所述步驟d移栽溫室大棚培養(yǎng)是指生根壯苗培養(yǎng)后，煉苗2-3周左右，組培苗長 至6?7cm高時移栽至溫室大棚，移栽用介質(zhì)為腐殖土加少量珍珠巖的混合物，移栽前用 800-1000倍多菌靈或百菌清加生根粉50mg/kg浸根15-20min。
6. 根據(jù)權利要求5所述的金線蓮種子無激素快速組培繁殖的方法，其特征在于：所述 腐殖土與珍珠巖的重量份數(shù)比為3~4:1。
7. 根據(jù)權利要求1至4中任一項所述的金線蓮種子無激素快速組培繁殖的方法，其特 征在于：所述步驟d所述溫室大棚采用雙層遮蔭網(wǎng)遮光，外層是一層固定的50%遮蔭網(wǎng)，內(nèi) 層為可活動的遮蔭網(wǎng)，便于調(diào)節(jié)光照強度，移栽2周內(nèi)需遮光80-90%，之后需遮光60%，溫室 大棚中溫度控制在20?26°C，相對濕度控制在65?75%。
8. 根據(jù)權利要求1至4中任一項所述的金線蓮種子無激素快速組培繁殖的方法，其特 征在于：所述步驟a中所述金線蓮是指生長在峨眉山地區(qū)的野生或人工種植開花后受粉5 個月成熟峨眉金線蓮未開裂蒴果。
【文檔編號】A01H4/00GK104429965SQ201410771714
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月16日 優(yōu)先權日:2014年12月16日
【發(fā)明者】魯松, 熊鐵一 申請人:四川省自然資源科學研究院, 峨眉山生物資源實驗站