一種金花茶的組培快繁方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種金花茶的組培快繁方法，其特征在于，包括如下步驟：（1）外植體的消毒；（2）愈傷組織培養(yǎng)；（3）愈傷組織分化芽；（4）芽生根。本發(fā)明提供一種金花茶的組培快繁方法，能降低繁殖的成本，生長(zhǎng)周期短、繁殖率高、方便管理、利于工業(yè)化生產(chǎn)和自動(dòng)化監(jiān)控大大的節(jié)約了人力、物力和田間作物的土地。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種金花茶的組培快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明涉及一種金花茶的組培快繁方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 金花茶屬于山茶科、山茶屬，與茶、山茶、南山茶、油茶、茶梅等為孿生姐妹。金花茶 的花金黃色，耀眼奪目，仿佛涂著一層蠟，晶瑩而油潤(rùn)，似有半透明之感。金花茶單生于葉 腋，花開(kāi)時(shí)，有杯狀的、壺狀的或碗狀的，嬌艷多姿，秀麗雅致。以前，人們沒(méi)有見(jiàn)到過(guò)花色金 黃的種類(lèi)。I960年，中國(guó)科學(xué)工作者首次在廣西南寧一帶發(fā)現(xiàn)了一種金黃色的山茶花，被命 名為金花茶。國(guó)外稱(chēng)之為神奇的東方魔茶，被譽(yù)為"植物界大熊貓"、"茶族皇后"。
[0003] 金花茶是一種古老的植物，極為罕見(jiàn)，分布極其狹窄，全世界90%的野生金花茶僅 分布于中國(guó)廣西防城港市十萬(wàn)大山的蘭山支脈一帶，生長(zhǎng)于海拔700米以下，以海拔200? 500米之間的范圍較常見(jiàn)，垂直分布的下限為海拔20米左右。如金花茶在防城縣大王江附 近的濱海丘陵臺(tái)地仍有分布。垂直分布的上限可達(dá)海拔890米，如寧明縣那陶大山仍可見(jiàn) 到個(gè)別小瓣金花茶，數(shù)量極少，是世界上稀有的珍貴植物。金花茶喜溫暖濕潤(rùn)氣候，喜歡排 水良好的酸性土壤，苗期喜蔭蔽，進(jìn)入花期后，頗喜透射陽(yáng)光。對(duì)土壤要求不嚴(yán)，微酸性至中 性均土壤中可生長(zhǎng)。耐瘠薄，也喜肥，耐澇力強(qiáng)。
[0004] 據(jù)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所、廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中 心、廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)中心、北京疾病預(yù)防控制中心中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所、廣 西壯族自治區(qū)分析測(cè)試研究中心、廣西中醫(yī)學(xué)院、廣西農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心等權(quán)威機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)表 明：金花茶屬無(wú)毒級(jí)、含有400多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、無(wú)毒副作用。富含茶多糖、茶多酚、總皂甙、總 黃酮、茶色素、咖啡因、蛋白質(zhì)、維生素 Bl、B2、維生素 C、維生素 E、葉酸、脂肪酸、B-胡蘿卜 素等多種天然營(yíng)養(yǎng)成份；金花茶含有茶氨酸、蘇氨酸等幾十種氨基酸，以及富含有多種對(duì)人 體具有重要保健作用的天然有機(jī)鍺（Ge)、硒（Se)、鑰（Mo)、鋅（Zn)、釩（V)等微量元素，和 鉀（K)、鈣（Ca)、鎂（Mg)等宏量元素。自2009年成功舉辦首屆金花茶節(jié)以來(lái)，金花茶節(jié)成 為了防城港市主打的四大文化節(jié)慶品牌之一。金花茶產(chǎn)業(yè)也得到了迅速發(fā)展，涌現(xiàn)出桂人 堂金花茶、中港高科國(guó)寶金花茶、百喜金花茶等一批龍頭企業(yè)，金花茶系列產(chǎn)品分獲廣西名 牌產(chǎn)品、廣西著名商標(biāo)，產(chǎn)品暢銷(xiāo)國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)，年產(chǎn)值超過(guò)12億元。
[0005] 由此可見(jiàn)金花茶深受大眾的喜愛(ài)，提高金花茶的產(chǎn)量就要對(duì)金花茶進(jìn)行后代繁 殖，為了滿(mǎn)足這一需求，本發(fā)明提供一種金花茶的組培快繁方法，能夠快速的對(duì)金花茶進(jìn)行 組織培養(yǎng)繁殖，且出苗率較高。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明針對(duì)上述存在的問(wèn)題，提供一種金花茶的組培快繁方法，能降低繁殖的成 本，生長(zhǎng)周期短、繁殖率高、方便管理、利于工業(yè)化生產(chǎn)和自動(dòng)化監(jiān)控大大的節(jié)約了人力、物 力和田間作物的土地。
[0007] 本發(fā)明的方案是通過(guò)這樣實(shí)現(xiàn)的： 一種金花茶的組培快繁方法，包括如下步驟： 外植體的消毒：采摘6?7月份的金花茶葉，使用20?40%樂(lè)果乳劑稀釋400?600 倍液浸泡5?lOmin，取出后放入超凈工作臺(tái)使用4%維生素 C水溶液浸泡30min后再3%的 次氯酸進(jìn)行消毒5?IOmin,然后用無(wú)菌水沖洗3?5次，最后使用滅菌濾紙吸干金花茶葉 表面的無(wú)菌水；使用樂(lè)果乳劑對(duì)剛采摘的金花茶葉進(jìn)行消毒，能將金花茶葉上的害蟲(chóng)爬行 過(guò)后殘留下的有害液體去除，然后使用維生素 C浸泡再用次氯酸消毒不僅能有效延緩?fù)庵?體褐化時(shí)間和保持外植體活力，而且能將金花茶葉上的細(xì)菌殺死，再使用無(wú)菌水沖洗，確保 金花茶葉上其他液體無(wú)殘留，最后使用滅菌濾紙吸干金花茶葉表面的無(wú)菌水，以防將金花 茶葉放入愈傷組織培養(yǎng)基中對(duì)培養(yǎng)基有稀釋作用。
[0008] (2)愈傷組織培養(yǎng)：愈傷組織培養(yǎng)：使用解剖刀沿著金花茶葉的莖干位置橫切出 長(zhǎng)15?18cm，寬10?15cm的葉條片，將葉條片放入已經(jīng)裝入愈傷組織培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中， 輕壓葉條片，在29?31°C下暗培養(yǎng)8?15天，而后轉(zhuǎn)入26?28°C下進(jìn)行8?15天的暗 培養(yǎng)，獲得金花茶愈傷組織；采用光暗培養(yǎng)的方式，暗培養(yǎng)的時(shí)間原大于光培養(yǎng)，可以避免 金花茶葉修復(fù)期間過(guò)多的光照使其進(jìn)行光合作用生成糖類(lèi)，失去金花茶葉體內(nèi)的一部分物 質(zhì)和能量，使得完成修復(fù)過(guò)程的物質(zhì)和能量的總量減少，造成形成愈傷組織的時(shí)間變慢。
[0009] (3)愈傷組織分化芽：將上述得到的愈傷組織移置芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其中，芽誘導(dǎo) 培養(yǎng)基的配方為MS+6?8g/L瓊脂+25?29 g/L蔗糖+ 0. 3?0.8mg/L 6?芐基嘌呤 +0· 8?I. 5mg/L萘乙酸，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為6. 0?6. 5,于25?28°C條件下，光暗培養(yǎng) 30?45天后愈傷組織分化出芽；添加6?芐基嘌呤在培養(yǎng)基中具有抑制植物葉內(nèi)葉綠素、 核酸、蛋白質(zhì)的分解，保綠防老；將氨基酸、生長(zhǎng)素、無(wú)機(jī)鹽等向處理部位調(diào)運(yùn)等多種效能。
[0010] (4)芽生根：待步驟（3)中芽長(zhǎng)至5?6cm時(shí)，將芽移置根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其中，根 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為MS+6?8g/L瓊脂+25?29g/L蔗糖+0· 8?2. 5mg/L吲哚乙酸+0· 5? I. 5mg/L萘乙酸+0. 8?I. 5mg/L活性炭+0. 8?I. 5mg/L的硫酸亞鐵，于25?28°C條件下， 光暗培養(yǎng)20?30天，培養(yǎng)出幼苗，組培結(jié)束。采用萘乙酸為培養(yǎng)基其中之一的添加物質(zhì)能 夠促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大，可誘導(dǎo)生根；而抗褐化劑活性炭+〇. 8?I. 5mg/L的硫酸亞鐵可降 低組培過(guò)程中外植體、原球莖和叢生芽產(chǎn)生褐化，目前已達(dá)到外植體初誘導(dǎo)、原球莖繼代增 殖褐化率控制在15%以下，叢生芽生根誘導(dǎo)褐化率低于5%以下。
[0011] 本發(fā)明中，作為進(jìn)一步說(shuō)明，所述每個(gè)培養(yǎng)皿放入3?5片的葉條片。適當(dāng)放入葉 條片能保證每條葉條片能充分的吸收足量的養(yǎng)分，防止養(yǎng)分不足造成培養(yǎng)失敗，即提高繁 殖率。
[0012] 本發(fā)明中，作為進(jìn)一步說(shuō)明，所述愈傷組織培養(yǎng)基的配方為MS+6?8g/L瓊脂 +25?29 g/L蔗糖+ 0. 3?0. 8mg/L 6?芐基嘌呤+0. 8?I. 5mg/L萘乙酸，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 的pH值為6. 5?7. 0 ;將培養(yǎng)基放入高溫滅菌鍋，在121?130°C、I. 1?I. 5 kg/cm2條件 下進(jìn)行滅菌30?50min，然后取出冷卻至45°C后迅速在超凈工作臺(tái)中傾倒分裝到已經(jīng)經(jīng)過(guò) 高溫滅菌鍋滅菌的培養(yǎng)皿中。
[0013] 本發(fā)明中，作為進(jìn)一步說(shuō)明，所述培養(yǎng)皿的規(guī)格為90X 15mm ;所述裝入培養(yǎng)皿中 的培養(yǎng)基為培養(yǎng)皿體積的1/3?1/2。采用直接傾倒的方法，相比使用量筒量取定量的培養(yǎng) 基，具有快速，簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。
[0014] 本發(fā)明中，作為進(jìn)一步說(shuō)明，所述步驟（3)和步驟（4)中的光暗培養(yǎng)周期為光培養(yǎng) 20?22h，暗培養(yǎng)2?4h。在愈傷組織發(fā)芽和生根期間，需要吸收足夠的光源來(lái)形成葉綠素 繼而能通過(guò)吸收光源來(lái)完成光合作用，光合作用能夠合成能源，補(bǔ)充生長(zhǎng)所需的能量。
[0015] 本發(fā)明中，作為進(jìn)一步說(shuō)明，所述步驟（3)中光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為1500?1700勒 克斯，步驟（4)中光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為2000?3000勒克斯。愈傷組織培養(yǎng)時(shí)采用弱光的 光培養(yǎng)，提高了金花茶組培的增殖倍數(shù)，縮短周期培養(yǎng)的時(shí)間，且采用較弱光的光培養(yǎng)能夠 減少日光燈補(bǔ)光時(shí)產(chǎn)生的電耗和產(chǎn)生的熱量，減少降溫所需的費(fèi)用，因此采用此方法可提 高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，有利產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。芽生根培養(yǎng)加強(qiáng)了光照的強(qiáng)度，順應(yīng)金花茶 的生活習(xí)性，促進(jìn)其快速生根發(fā)芽。
[0016] 本發(fā)明中，作為進(jìn)一步說(shuō)明，所述金花茶葉為顏色嫩綠、完整、無(wú)病蟲(chóng)害；金花茶葉 的采摘時(shí)間為晚上1?2點(diǎn)。在深夜對(duì)金花茶葉進(jìn)行采摘,深夜的金花茶葉已經(jīng)停止進(jìn)行 光合作用，但是還是進(jìn)行呼吸作用，消耗了體內(nèi)的淀粉，為金花茶葉進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)提供 良好的條件，減少形成愈傷組織的時(shí)間。與現(xiàn)有技術(shù)中先采摘葉片后進(jìn)行暗培養(yǎng)一段時(shí)間 后再進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)的工序更加簡(jiǎn)單。
[0017] 本發(fā)明的突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步是： 1.本發(fā)明利用深夜的金花茶葉進(jìn)行組培，為金花茶葉進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)提供良好的 條件，能夠快速使金花茶葉形成金花茶葉愈傷組織，進(jìn)而減少了組培的時(shí)間。
[0018] 2.本發(fā)明形成金花茶葉愈傷組織后發(fā)芽、生根都進(jìn)行光暗培養(yǎng)，不僅僅通過(guò)光培 養(yǎng)促進(jìn)金花茶葉愈傷組織形成葉綠素，進(jìn)行光合作用合成能源提供生長(zhǎng)所需能量，而且通 過(guò)暗培養(yǎng)促進(jìn)其進(jìn)行呼吸作用，物質(zhì)轉(zhuǎn)換，促進(jìn)生長(zhǎng)。
[0019] 3.本發(fā)明光培養(yǎng)使用的是較弱的光照強(qiáng)度，不僅提高了金花茶組培的增殖倍數(shù)， 縮短周期培養(yǎng)的時(shí)間，且采用弱光的光培養(yǎng)能夠減少日光燈補(bǔ)光時(shí)產(chǎn)生的電耗和產(chǎn)生的熱 量，減少降溫所需的費(fèi)用，因此采用此方法可提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，有利產(chǎn)業(yè)的發(fā) 展，通過(guò)本發(fā)明的方法金花茶的發(fā)芽率達(dá)到75%以上。
[0020] 4.本發(fā)明的方法有利于工業(yè)化生產(chǎn)和自動(dòng)化監(jiān)控，大大的節(jié)約了人力、物力和田 間作物的土地；在金花茶苗栽培生產(chǎn)領(lǐng)域中具有極大的推廣價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，以使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征更易于被理 解，應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實(shí)施例僅僅是用于本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0022] 實(shí)施例1: 一種金花茶的組培快繁方法，包括如下步驟： (1) 外植體的消毒：于6月份晚上1點(diǎn)采摘顏色嫩綠、完整、無(wú)病蟲(chóng)害的金花茶葉，然后 使用20%樂(lè)果乳劑稀釋400倍液浸泡5min，取出后放入超凈工作臺(tái)使用4%維生素 C水溶液 浸泡30min后再3%的次氯酸進(jìn)行消毒5min，然后用無(wú)菌水沖洗3次，最后使用滅菌濾紙吸 干金花茶葉表面的無(wú)菌水； (2) 愈傷組織培養(yǎng)：使用解剖刀沿著金花茶葉的莖干位置橫切出長(zhǎng)15cm，寬IOcm的 葉條片，將3片的葉條片放入已經(jīng)裝入愈傷組織培養(yǎng)基的規(guī)格為90X 15mm的培養(yǎng)皿中，輕 壓葉條片，在29°C下暗培養(yǎng)8天，而后轉(zhuǎn)入26°C下進(jìn)行8天的暗培養(yǎng)，獲得金花茶愈傷組 織，其中，愈傷組織培養(yǎng)基的配方為MS+6g/L瓊脂+25 g/L蔗糖+ 0. 3mg/L 6?芐基嘌呤 +0. 8mg/L萘乙酸，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為6. 5 ;將培養(yǎng)基放入高溫滅菌鍋，在121°C、1. lkg/ cm2條件下進(jìn)行滅菌30min，然后取出冷卻至45°C后迅速在超凈工作臺(tái)中傾倒分裝到已經(jīng)經(jīng) 過(guò)高溫滅菌鍋滅菌的培養(yǎng)皿中，裝入培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基為培養(yǎng)皿體積的1/3 ; (3) 愈傷組織分化芽：將上述得到的愈傷組織移置芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其中，芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 基的配方為MS+6g/L瓊脂+25g/L蔗糖+ 0. 3mg/L 6?芐基嘌呤+0.8mg/L萘乙酸，調(diào)節(jié)培 養(yǎng)基的pH值為6. 0,于25°C條件下，進(jìn)行光培養(yǎng)20h，暗培養(yǎng)4h的光暗培養(yǎng)30天后愈傷組 織分化出芽，其中，光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為1500勒克斯； (4) 芽生根：待步驟（3)中芽長(zhǎng)至5cm時(shí)，將芽移置根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其中，根誘導(dǎo)培養(yǎng) 基的配方為MS+6g/L瓊脂+25g/L蔗糖+0· 8mg/L吲哚乙酸+0· 5mg/L萘乙酸+0· 8mg/L活性 炭+0. 8mg/L的硫酸亞鐵，于25°C條件下，進(jìn)行光培養(yǎng)20h，暗培養(yǎng)4h的光暗培養(yǎng)20天，其 中，光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為3000勒克斯，至培養(yǎng)出幼苗，組培結(jié)束。
[0023] 實(shí)施例2: 一種金花茶的組培快繁方法，包括如下步驟： (1) 外植體的消毒：于7月份晚上2點(diǎn)采摘顏色嫩綠、完整、無(wú)病蟲(chóng)害的金花茶葉，然后 使用40%樂(lè)果乳劑稀釋600倍液浸泡lOmin，取出后放入超凈工作臺(tái)使用4%維生素 C水溶 液浸泡30min后再3%的次氯酸進(jìn)行消毒lOmin，然后用無(wú)菌水沖洗5次，最后使用滅菌濾紙 吸干金花茶葉表面的無(wú)菌水； (2) 愈傷組織培養(yǎng)：使用解剖刀沿著金花茶葉的莖干位置橫切出長(zhǎng)18cm，寬15cm的葉 條片，將5片的葉條片放入已經(jīng)裝入愈傷組織培養(yǎng)基的規(guī)格為90X 15mm的培養(yǎng)皿中，輕壓 葉條片，在31°C下暗培養(yǎng)15天，而后轉(zhuǎn)入28°C下進(jìn)行15天的暗培養(yǎng)，獲得金花茶愈傷組 織，其中，愈傷組織培養(yǎng)基的配方為MS+8g/L瓊脂+29 g/L蔗糖+ 0.8mg/L 6?芐基嘌呤 +1.5mg/L萘乙酸，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為6.0;將培養(yǎng)基放入高溫滅菌鍋，在130°C、1.5 kg/ cm2條件下進(jìn)行滅菌50min，然后取出冷卻至45°C后迅速在超凈工作臺(tái)中傾倒分裝到已經(jīng)經(jīng) 過(guò)高溫滅菌鍋滅菌的培養(yǎng)皿中，裝入培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基為培養(yǎng)皿體積的1/2 ; (3) 愈傷組織分化芽：將上述得到的愈傷組織移置芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其中，芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 基的配方為MS+8g/L瓊脂+29 g/L蔗糖+ 0.8mg/L 6?芐基嘌呤+1.5mg/L萘乙酸，調(diào)節(jié)培 養(yǎng)基的pH值為7. 5,于28°C條件下，進(jìn)行光培養(yǎng)22h，暗培養(yǎng)2h的光暗培養(yǎng)45天后愈傷組 織分化出芽，其中，光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為1700勒克斯； (4) 芽生根：待步驟（3)中芽長(zhǎng)至6cm時(shí)，將芽移置根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其中，根誘導(dǎo)培養(yǎng) 基的配方為MS+8g/L瓊脂+29g/L蔗糖+ 2. 5mg/L吲哚乙酸+1. 5mg/L萘乙酸+1. 5mg/L活 性炭+1. 5mg/L的硫酸亞鐵，于28°C條件下，進(jìn)行光培養(yǎng)22h，暗培養(yǎng)2h的光暗培養(yǎng)30天， 其中，光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為2000勒克斯，至培養(yǎng)出幼苗，組培結(jié)束。
[0024] 實(shí)施例3: 一種金花茶的組培快繁方法，包括如下步驟： (1) 外植體的消毒：于6月份晚上1點(diǎn)20分時(shí)采摘顏色嫩綠、完整、無(wú)病蟲(chóng)害的金花茶 葉，然后使用25%樂(lè)果乳劑稀釋450倍液浸泡6min，取出后放入超凈工作臺(tái)使用4%維生素 C水溶液浸泡30min后再3%的次氯酸進(jìn)行消毒6min，然后用無(wú)菌水沖洗4次，最后使用滅 菌濾紙吸干金花茶葉表面的無(wú)菌水； (2) 愈傷組織培養(yǎng)：使用解剖刀沿著金花茶葉的莖干位置橫切出長(zhǎng)16cm，寬Ilcm的 葉條片，將4片的葉條片放入已經(jīng)裝入愈傷組織培養(yǎng)基的規(guī)格為90X 15mm的培養(yǎng)皿中，輕 壓葉條片，在30°C下暗培養(yǎng)9天，而后轉(zhuǎn)入27°C下進(jìn)行9天的暗培養(yǎng)，獲得金花茶愈傷組 織，其中，愈傷組織培養(yǎng)基的配方為MS+7g/L瓊脂+26 g/L蔗糖+ 0.4mg/L 6?芐基嘌呤 +0.9mg/L萘乙酸，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為6. 2;將培養(yǎng)基放入高溫滅菌鍋，在122°C、1.2 kg/ cm2條件下進(jìn)行滅菌35min，然后取出冷卻至45°C后迅速在超凈工作臺(tái)中傾倒分裝到已經(jīng)經(jīng) 過(guò)高溫滅菌鍋滅菌的培養(yǎng)皿中，裝入培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基為培養(yǎng)皿體積的1/3 ; (3) 愈傷組織分化芽：將上述得到的愈傷組織移置芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其中，芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 基的配方為MS+7g/L瓊脂+26 g/L蔗糖+ 0.4mg/L 6?芐基嘌呤+0.9mg/L萘乙酸，調(diào)節(jié)培 養(yǎng)基的pH值為6. 6,于26°C條件下，進(jìn)行光培養(yǎng)21h，暗培養(yǎng)3h的光暗培養(yǎng)33天后愈傷組 織分化出芽，其中，光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為1550勒克斯； (4) 芽生根：待步驟（3)中芽長(zhǎng)至5. 5cm時(shí)，將芽移置根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其中，根誘導(dǎo)培 養(yǎng)基的配方為MS+7g/L瓊脂+26g/L蔗糖+0· 9mg/L吲哚乙酸+0· 8mg/L萘乙酸+0· 9mg/L活 性炭+1. Omg/L的硫酸亞鐵，于26°C條件下，進(jìn)行光培養(yǎng)21h，暗培養(yǎng)3h的光暗培養(yǎng)25天， 其中，光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為2300勒克斯，至培養(yǎng)出幼苗，組培結(jié)束。
[0025] 實(shí)施例4: 一種金花茶的組培快繁方法，包括如下步驟： (1) 外植體的消毒：于7月份晚上1點(diǎn)30分時(shí)采摘顏色嫩綠、完整、無(wú)病蟲(chóng)害的金花茶 葉，然后使用35%樂(lè)果乳劑稀釋500倍液浸泡7min，取出后放入超凈工作臺(tái)使用4%維生素 C水溶液浸泡30min后再3%的次氯酸進(jìn)行消毒7min，然后用無(wú)菌水沖洗3次，最后使用滅 菌濾紙吸干金花茶葉表面的無(wú)菌水； (2) 愈傷組織培養(yǎng)：使用解剖刀沿著金花茶葉的莖干位置橫切出長(zhǎng)17cm，寬12cm的葉 條片，將3片的葉條片放入已經(jīng)裝入愈傷組織培養(yǎng)基的規(guī)格為90X 15mm的培養(yǎng)皿中，輕壓 葉條片，在29°C下暗培養(yǎng)14天，而后轉(zhuǎn)入27°C下進(jìn)行13天的暗培養(yǎng)，獲得金花茶愈傷組 織，其中，愈傷組織培養(yǎng)基的配方為MS+7g/L瓊脂+28 g/L蔗糖+ 0. 7mg/L 6?芐基嘌呤 +1.0mg/L萘乙酸，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為6. 1 ;將培養(yǎng)基放入高溫滅菌鍋，在128°C、1.4 kg/ cm2條件下進(jìn)行滅菌40min，然后取出冷卻至45°C后迅速在超凈工作臺(tái)中傾倒分裝到已經(jīng)經(jīng) 過(guò)高溫滅菌鍋滅菌的培養(yǎng)皿中，裝入培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基為培養(yǎng)皿體積的1/2 ; (3) 愈傷組織分化芽：將上述得到的愈傷組織移置芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其中，芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 基的配方為MS+7g/L瓊脂+26 g/L蔗糖+ 0. 7mg/L 6?芐基嘌呤+1.3mg/L萘乙酸，調(diào)節(jié)培 養(yǎng)基的pH值為7. 0,于27°C條件下，進(jìn)行光培養(yǎng)20h，暗培養(yǎng)4h的光暗培養(yǎng)32天后愈傷組 織分化出芽，其中，光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為1600勒克斯； (4) 芽生根：待步驟（3)中芽長(zhǎng)至5. 3cm時(shí)，將芽移置根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其中，根誘導(dǎo)培 養(yǎng)基的配方為MS+7g/L瓊脂+28g/L蔗糖+2. Omg/L吲哚乙酸+1. Omg/L萘乙酸+1. Omg/L活 性炭+1. lmg/L的硫酸亞鐵，于26°C條件下，進(jìn)行光培養(yǎng)20h，暗培養(yǎng)4h的光暗培養(yǎng)27天， 其中，光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為2100勒克斯，至培養(yǎng)出幼苗，組培結(jié)束。
[0026] 實(shí)施例5: 一種金花茶的組培快繁方法，包括如下步驟： (1)外植體的消毒：于5月份晚上1點(diǎn)50分時(shí)采摘顏色嫩綠、完整、無(wú)病蟲(chóng)害的金花茶 葉，然后使用22%樂(lè)果乳劑稀釋550倍液浸泡9min，取出后放入超凈工作臺(tái)使用4%維生素 C水溶液浸泡30min后再3%的次氯酸進(jìn)行消毒9min，然后用無(wú)菌水沖洗4次，最后使用滅 菌濾紙吸干金花茶葉表面的無(wú)菌水； (2) 愈傷組織培養(yǎng)：使用解剖刀沿著金花茶葉的莖干位置橫切出長(zhǎng)17cm，寬14cm的葉 條片，將3片的葉條片放入已經(jīng)裝入愈傷組織培養(yǎng)基的規(guī)格為90X 15mm的培養(yǎng)皿中，輕壓 葉條片，在29°C下暗培養(yǎng)11天，而后轉(zhuǎn)入26°C下進(jìn)行11天的暗培養(yǎng)，獲得金花茶愈傷組 織，其中，愈傷組織培養(yǎng)基的配方為MS+6g/L瓊脂+25 g/L蔗糖+ 0. 7mg/L 6?芐基嘌呤 +1.211^/1萘乙酸，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的？!1值為6.4;將培養(yǎng)基放入高溫滅菌鍋，在1291：、1.2 1^/ cm2條件下進(jìn)行滅菌45min，然后取出冷卻至45°C后迅速在超凈工作臺(tái)中傾倒分裝到已經(jīng)經(jīng) 過(guò)高溫滅菌鍋滅菌的培養(yǎng)皿中，裝入培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基為培養(yǎng)皿體積的1/2 ; (3) 愈傷組織分化芽：將上述得到的愈傷組織移置芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其中，芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 基的配方為MS+6g/L瓊脂+26 g/L蔗糖+ 0. 7mg/L 6?芐基嘌呤+1.3mg/L萘乙酸，調(diào)節(jié)培 養(yǎng)基的pH值為7. 3,于25°C條件下，進(jìn)行光培養(yǎng)21h，暗培養(yǎng)3h的光暗培養(yǎng)42天后愈傷組 織分化出芽，其中，光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為1650勒克斯； (4) 芽生根：待步驟（3)中芽長(zhǎng)至5cm時(shí)，將芽移置根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其中，根誘導(dǎo)培養(yǎng) 基的配方為MS+6g/L瓊脂+25g/L蔗糖+2. 3mg/L吲哚乙酸+0· 9mg/L萘乙酸+1. 3mg/L活性 炭+1. 3mg/L的硫酸亞鐵，于25°C條件下，進(jìn)行光培養(yǎng)22h，暗培養(yǎng)2h的光暗培養(yǎng)29天，其 中，光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為2500勒克斯，至培養(yǎng)出幼苗，組培結(jié)束。
[0027] 如實(shí)施例1?5各條件下進(jìn)行組培的條件下，對(duì)各實(shí)施例的組織培養(yǎng)的總數(shù)、愈傷 組織培養(yǎng)階段的情況變化和出苗率統(tǒng)計(jì)表如表1，愈傷組織培養(yǎng)期間每隔3天進(jìn)行一次葉 片顏色變化的記錄，總結(jié)變化趨勢(shì)。
[0028] 表1出苗率統(tǒng)計(jì)表
【權(quán)利要求】
1. 一種金花茶的組培快繁方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 外植體的消毒：采摘5?7月份的金花茶葉，使用20?40%樂(lè)果乳劑稀釋400? 600倍液浸泡5?lOmin，取出后放入超凈工作臺(tái)使用4%維生素 C水溶液浸泡30min后再 3%的次氯酸進(jìn)行消毒5?lOmin，然后用無(wú)菌水沖洗3?5次，最后使用滅菌濾紙吸干金花 茶葉表面的無(wú)菌水； (2) 愈傷組織培養(yǎng)：使用解剖刀沿著金花茶葉的莖干位置橫切出長(zhǎng)15?18cm，寬10? 15cm的葉條片，將葉條片放入已經(jīng)裝入愈傷組織培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，輕壓葉條片，在29? 31°C下暗培養(yǎng)8?15天，而后轉(zhuǎn)入26?28°C下進(jìn)行8?15天的暗培養(yǎng)，獲得金花茶愈傷 組織； (3) 愈傷組織分化芽：將上述得到的愈傷組織移置芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其中，芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 基的配方為MS+6?8g/L瓊脂+25?29 g/L鹿糖+ 0. 3?0. 8mg/L 6?節(jié)基噪呤+0. 8? 1. 5mg/L萘乙酸，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為6. 0?6. 5,于25?28°C條件下，光暗培養(yǎng)30?45 天后愈傷組織分化出芽； (4) 芽生根：待步驟（3)中芽長(zhǎng)至5?6cm時(shí)，將芽移置根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其中，根誘導(dǎo) 培養(yǎng)基的配方為MS+6?8g/L瓊脂+25?29g/L蔗糖+0. 8?2. 5mg/L吲哚乙酸+0. 5? 1. 5mg/L萘乙酸+0. 8?1. 5mg/L活性炭+0. 8?1. 5mg/L的硫酸亞鐵，于25?28°C條件下， 光暗培養(yǎng)20?30天，培養(yǎng)出幼苗，組培結(jié)束。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的金花茶的組培快繁方法，其特征在于，所述每個(gè)培養(yǎng)皿放入 3?5片的葉條片。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的金花茶的組培快繁方法，其特征在于，所述愈傷組織培養(yǎng)基 的配方為MS+6?8g/L瓊脂+25?29 g/L蔗糖+ 0. 3?0. 8mg/L 6?芐基嘌呤+0. 8? 1. 5mg/L萘乙酸，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為6. 5?7. 0 ;將培養(yǎng)基放入高溫滅菌鍋，在121? 130°C、1. 1?1. 5 kg/cm2條件下進(jìn)行滅菌30?50min，然后取出冷卻至45°C后迅速在超凈 工作臺(tái)中傾倒分裝到已經(jīng)經(jīng)過(guò)高溫滅菌鍋滅菌的培養(yǎng)皿中。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的金花茶的組培快繁方法，其特征在于，所述培養(yǎng)皿的規(guī)格為 90X 15mm ;所述裝入培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基為培養(yǎng)皿體積的1/3?1/2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的金花茶的組培快繁方法，其特征在于，所述步驟（3)和步驟 (4)中的光暗培養(yǎng)周期為光培養(yǎng)20?22h，暗培養(yǎng)2?4h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的金花茶的組培快繁方法，其特征在于，所述步驟（3)中光培養(yǎng) 的光照強(qiáng)度為1500?1700勒克斯，步驟（4)中光培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為2000?3000勒克斯。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的金花茶的組培快繁方法，其特征在于，所述金花茶葉為顏色 嫩綠、完整、無(wú)病蟲(chóng)害；金花茶葉的采摘時(shí)間為晚上1?2點(diǎn)。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104488713SQ201410755440
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月11日
【發(fā)明者】張莘蔓, 韋玲菊, 陳程, 羅生芳 申請(qǐng)人:柳州博澤科技有限公司