適用于多基因型的苦瓜高效再生體系的建立方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了適用于多基因型的苦瓜高效再生體系的建立方法，所述方法包括前處理、不定芽的誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)、不定芽的伸長、生根培養(yǎng)、煉苗和移栽步驟。在前處理過程中，所用植物生長調(diào)節(jié)劑為濃度為1-5mg/L的6-BA；在不定芽的誘導(dǎo)過程中，所用植物生長調(diào)節(jié)劑為6-BA和KT，6-BA的濃度為1-4mg/L，KT的濃度為0.1-1.0mg/L；在不定芽的伸長過程中，所用植物生長調(diào)節(jié)劑為6-BA和IBA，6-BA的濃度為1.0mg/L，IBA的濃度為0.1-0.3mg/L。本發(fā)明不僅適應(yīng)于多基因型苦瓜的再生培養(yǎng)，而且具有誘導(dǎo)率高、不定芽誘導(dǎo)數(shù)目多、不定芽長以及實施條件不苛刻的優(yōu)點，具有良好的推廣前景。
【專利說明】適用于多基因型的苦瓜高效再生體系的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及適用于多基因型的苦瓜高效再生體系的建立 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 苦瓜是我國南方地區(qū)一種重要的藥食兼用蔬菜，有"君子菜"的別稱。隨著其降血 糖、抗腫瘤、抗病毒、抗艾滋等功效的發(fā)現(xiàn)，苦瓜現(xiàn)已受到消費者的廣泛青睞，種植面積也在 逐年增加。由于對苦瓜需求的不斷增加，苦瓜的育種目標也趨向于多元化的發(fā)展。但是傳 統(tǒng)的遺傳育種存在種質(zhì)資源匱乏，育種周期太長，后代表現(xiàn)出的遺傳性狀不穩(wěn)定等不足，這 些都嚴重的制約了苦瓜優(yōu)良品種的選育；而植物基因工程技術(shù)則為優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、高抗的苦瓜 新品種的選育開辟了一條新的途徑。
[0003] 植物遺傳轉(zhuǎn)化即轉(zhuǎn)基因技術(shù)是近四十年來發(fā)展起來的一項生物技術(shù)，利用該技術(shù) 可以在保持植物原有較好遺傳背景的前提下定向改變某些性狀，且能大大縮短育種時間， 目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為植物遺傳育種的主要研究領(lǐng)域。然而轉(zhuǎn)基因技術(shù)極大的依賴于外植 體能夠高效穩(wěn)定再生成完整植株的技術(shù)，建立高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)是轉(zhuǎn)基因育種 的基礎(chǔ)。而目前對苦瓜離體培養(yǎng)的研究較少，多是通過莖尖或帶芽莖段進行快速繁殖獲得 再生植株，也有學(xué)者利用苦瓜的子葉和胚軸等外植體進行離體培養(yǎng)并獲得再生植株，但是 總的看來苦瓜外植體在離體培養(yǎng)過程易于形成愈傷組織而不定芽再生困難，不定芽誘導(dǎo)率 和不定芽長度都不理想；另外就是苦瓜再生能力存在基因型依賴性，不同基因型之間再生 能力存在顯著差異，至今還沒有建立一個適合多個基因型的苦瓜再生體系。因此，系統(tǒng)深 入研究離體培養(yǎng)誘導(dǎo)苦瓜植株再生的方法，建立針對多個基因型苦瓜的高效穩(wěn)定的再生體 系，具有重要意義，可為苦瓜轉(zhuǎn)基因育種工作提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)，同時將有效推進苦 瓜生物技術(shù)育種進程。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適用于多基因型的苦瓜高效再 生體系的建立方法。構(gòu)建方法包括以下步驟： 1) 前處理：將苦瓜種子剝?nèi)シN皮后進行滅菌，然后放入含6-BA的MS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)， 培養(yǎng)時間為7天，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天，6-BA的 濃度為l_5mg/L ; 2) 不定芽的誘導(dǎo)：切取帶一個子葉的子葉節(jié)，然后放入含6-BA和KT的MS培養(yǎng)基進 行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為7天，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天， 6-BA 的濃度為 2-4mg/L，KT 的濃度為 0? 1-L Omg/L ; 3) 繼代培養(yǎng)：將步驟2)所得物的不定芽的腋芽切下，棄掉，然后將剩余物接種于含 6-BA和KT的MS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為7天，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天，6-BA的濃度為2-4mg/L，KT的濃度為0. 1-1. Omg/L ; 4) 不定芽的伸長：將步驟3)所得物放入含6-BA和IBA的MS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時 間為14天，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天，6-BA的濃度為 1. Omg/L，IBA 的濃度為 0? 1-0. 3mg/L ; 5) 生根培養(yǎng)：將步驟4)所得物的不定芽切下，接種在含生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)， 培養(yǎng)時間為14天，培養(yǎng)溫度為保持在23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天， 所述生根培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基添加30g/L蔗糖和7g/L瓊脂，pH=5. 8 ; 6) 煉苗：選取經(jīng)步驟5)培養(yǎng)后的根長為4-5 cm的健壯小苗，將培養(yǎng)瓶的蓋子先擰松 放置2天，再半開2天，然后再全開2 d，半開和全開蓋子期間需要不斷補充水分； 7)移栽：將煉苗完成后的植株拔起，用水洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到裝有泥炭土、珍珠 巖、草木灰和腐葉土基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，在23-27°C下，套上保鮮袋置于人工氣候箱中保濕培 養(yǎng)2 d，1-2周后再移到室外進行培養(yǎng)。
[0005] 所述的滅菌過程為：剝?nèi)タ喙戏N子的種皮，先用75%的酒精浸泡消毒lmin，再用 0. 1%升萊浸泡消毒5min,最后用無菌水沖洗5次。
[0006] 在切取帶一個子葉的子葉節(jié)時，節(jié)點距上胚軸1 mm,距下胚軸5 mm。
[0007] 所述營養(yǎng)缽中泥炭土、珍珠巖、草木灰和腐葉土基質(zhì)的質(zhì)量比為1:1:1:1。
[0008] 優(yōu)選的，步驟1)中的MS培養(yǎng)基中6-BA的濃度為4mg/L。當(dāng)步驟1)中的6-BA的濃 度為4mg/L時，不定芽的誘導(dǎo)率為98. 37%，不定芽數(shù)量、不定芽長度、主芽數(shù)量、主芽長度、 叢芽數(shù)量和叢芽長度的情況均為最優(yōu)。
[0009] 優(yōu)選的，步驟2)中的6-BA的濃度為3. Omg/L，KT的濃度為0. 5mg/L，當(dāng)6-BA濃度 為3. Omg/L，KT濃度為0. 5 mg/L時，不定芽數(shù)量和不定芽芽長的綜合情況最優(yōu)。
[0010] 優(yōu)選的，步驟4)中的MS培養(yǎng)基中，6-BA的濃度為1. Omg/L，IBA的濃度為0. 2mg/ L。當(dāng)6-BA的濃度為1. Omg/L，IBA的濃度為0. 2mg/L時，對不定芽長度和主芽長度誘導(dǎo)效 果最好。
[0011] 本發(fā)明具有如下有益效果： 1、 適用于多個基因型，有較大推廣前景； 2、 不定芽誘導(dǎo)率高，不定芽誘導(dǎo)數(shù)多，生長良好的不定芽有利于之后遺傳轉(zhuǎn)化體系的 建立； 3、 實施步驟簡單，實施條件不苛刻。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012] 圖1 :帶一個子葉的子葉節(jié)； 圖2 :不定芽誘導(dǎo)情況； 圖3 :不定芽生根情況； 圖4 :再生植株生長情況。
【具體實施方式】
[0013] 下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用 于對本發(fā)明進行進一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練 人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
所做出的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0014] 實施例1 選取大小均勻、飽滿的苦瓜種子，在超凈工作臺上剝?nèi)タ喙戏N皮，先用75%的酒精浸泡 消毒lmin，再用0. 1%升汞浸泡消毒5min，然后用無菌水沖洗5次，然后置于培養(yǎng)皿內(nèi)的無 菌濾紙上，用消毒后的鑷子將種子接種在培養(yǎng)基上，每瓶接種10粒種子。
[0015] 將苦瓜種子放入含6-BA的MS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，設(shè)不含6-BA的MS培養(yǎng)基為空白 組，培養(yǎng)時間為7天，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天，6-BA 的濃度為l_5mg/L。再于含6-BA和KT的MS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為7天，培養(yǎng)溫度為 23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天，設(shè)三組實驗組，第一組中6-BA的濃度 為2. Omg/，KT的濃度為0? lmg/L ;第二組中6-BA的濃度為4. Omg/L，KT的濃度為1. Omg/L ; 第三組中6-BA的濃度為3. 0mg/L，KT的濃度為0. 5mg/L ;實驗結(jié)果取三組實驗結(jié)果平均值。
[0016] 6-BA前處理對不定芽誘導(dǎo)的影響見表1。
[0017]表 1
【權(quán)利要求】
1. 適用于多基因型的苦瓜高效再生體系的建立方法，其特征在于：包括如下步驟： 1) 前處理：將苦瓜種子剝?nèi)シN皮后進行滅菌，然后放入含6-BA的MS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)， 培養(yǎng)時間為7天，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天，6-BA的 濃度為l_5mg/L ; 2) 不定芽的誘導(dǎo)：切取帶一個子葉的子葉節(jié)，然后放入含6-BA和KT的MS培養(yǎng)基進 行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為7天，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天， 6-BA 的濃度為 2-4mg/L，KT 的濃度為 0? 1-L Omg/L ; 3) 繼代培養(yǎng)：將步驟2)所得物的不定芽的腋芽切下，棄掉，然后將剩余物接種于含 6-BA和KT的MS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為7天，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天，6-BA的濃度為2-4mg/L，KT的濃度為0. 1-1. Omg/L ; 4) 不定芽的伸長：將步驟3)所得物放入含6-BA和IBA的MS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時 間為14天，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天，6-BA的濃度為 1. Omg/L，IBA 的濃度為 0? 1-0. 3mg/L ; 5) 生根培養(yǎng)：將步驟4)所得物的不定芽切下，接種在含生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)， 培養(yǎng)時間為14天，培養(yǎng)溫度為保持在23-27°C，光照強度為3000 lx，光照時間為16 h/天， 所述生根培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基添加30g/L蔗糖和7g/L瓊脂，pH=5. 8 ; 6) 煉苗：選取經(jīng)步驟5)培養(yǎng)后的根長為4-5 cm的健壯小苗，將培養(yǎng)瓶的蓋子先擰松 放置2天，再半開2天，然后再全開2 d，半開和全開蓋子期間需要不斷補充水分； 7) 移栽：將煉苗完成后的植株拔起，用水洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到裝有泥炭土、珍珠巖、 草木灰和腐葉土基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，在23-27°C下，套上保鮮袋置于人工氣候箱中保濕培養(yǎng)2 d，1-2周后再移到室外進行培養(yǎng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1)所述的滅菌過程為：剝?nèi)タ喙戏N 子的種皮，先用75%的酒精浸泡消毒lmin，再用0. 1%升汞浸泡消毒5min，最后用無菌水沖 洗5次。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟2)中，在切取帶一個子葉的子葉節(jié) 時，節(jié)點距上胚軸1 mm，距下胚軸5 mm。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟7)所述營養(yǎng)缽中泥炭土、珍珠巖、草 木灰和腐葉土基質(zhì)的質(zhì)量比為1:1:1:1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1)中的MS培養(yǎng)基中6-BA的濃度為 4mg/L ;步驟2)中的MS培養(yǎng)基中6-BA的濃度為3. 0mg/L，KT的濃度為0. 5mg/L ;步驟4)中 的MS培養(yǎng)基中，6-BA的濃度為1. Omg/L，IBA的濃度為0. 2mg/L。
【文檔編號】A01H4/00GK104429945SQ201410621708
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月7日
【發(fā)明者】唐懿, 李煥秀, 孫國超, 汪志輝, 姜建業(yè), 謝永東, 嚴澤生, 賴云松, 夏惠, 王迅, 余雪娜 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)