一種利用薄片培養(yǎng)技術(shù)獲得白姜花四倍體植株的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種利用薄片培養(yǎng)技術(shù)獲得白姜花四倍體植株的方法。該方法從試管苗莖段切取薄片，對(duì)薄片用秋水仙素進(jìn)行處理，然后采用薄片培養(yǎng)技術(shù)對(duì)處理后的薄片進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，獲得再生植株；通過(guò)對(duì)再生植株進(jìn)行檢測(cè)，篩選獲得四倍體植株。本發(fā)明中進(jìn)行誘導(dǎo)突變時(shí)，所用的外植體為薄片，厚度只有0.3～0.5mm，細(xì)胞數(shù)目少，在用秋水仙素進(jìn)行處理時(shí)，可使外植體的細(xì)胞充分暴露于藥液中，所獲得的植株絕大多數(shù)為純合體，簡(jiǎn)化了多倍體植株的篩選過(guò)程；所用的染色體數(shù)目分析技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、所需時(shí)間短，獲得的染色體圖像清晰等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的方法具有操作簡(jiǎn)單、植株再生頻率高、再生周期短、取材容易的優(yōu)點(diǎn)，操作性強(qiáng)，易于普及和推廣。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種利用薄片培養(yǎng)技術(shù)獲得白姜花四倍體植株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于姜科(Zingiberaceae)姜花屬(Hedychium)白姜花(Hedychiumcoronarium)育種【技術(shù)領(lǐng)域】,特別涉及一種利用薄片培養(yǎng)技術(shù)獲得白姜花四倍體植株的方法。通過(guò)薄片培養(yǎng)技術(shù)建立白姜花的快繁培養(yǎng)體系，并利用所建立的快繁培養(yǎng)體系，結(jié)合秋水仙素處理，能夠快速獲得白姜花多倍體植株，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)白姜花品種進(jìn)行改良、獲得新品種的目的。
【背景技術(shù)】
[0002]白姜花為姜科姜花屬、多年生根莖狀草本花卉植物，因其色彩艷麗且氣味芬芳，主要用作香型鮮切花、庭院綠化和園林景觀植物，為廣受親睞的庭園芳香花卉，市場(chǎng)需求量巨大。此外，白姜花還是一種很好的芳香調(diào)味植株，其植株中含有沉香醇，金合歡烯等多種芳香化合物，可以提取芳香油，用作高檔香精。
[0003]但目前白姜花的大規(guī)模應(yīng)用上還存在許多問(wèn)題，例如鮮切花瓶插期短(2?3天)、提取有效藥用成分效率低下，植株分蘗系數(shù)低下，繁殖速度緩慢等。白姜花在廣州少育或不育限制了通過(guò)人工有性雜交的方法獲得新品種，通過(guò)生物技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)問(wèn)題的解決。
[0004]多倍體育種(polyploid breeding)技術(shù)是利用人工誘變或自然變異篩選等途徑獲得多倍體材料，用以選育多倍體新品種的技術(shù)。多倍體植株通常具有花冠大而厚實(shí)，香味更濃厚，花期變長(zhǎng)、莖變粗壯，耐倒伏，葉片變寬厚，光合作用增強(qiáng)等特點(diǎn)，已通過(guò)人工誘導(dǎo)多倍體手段育成一批具有較高觀賞價(jià)值的花卉品種。
[0005]在進(jìn)行植物多倍體育種過(guò)程中，常用秋水仙素進(jìn)行化學(xué)誘變處理。其誘導(dǎo)染色體加倍主要有活體處理加倍法和離體處理加倍法?；铙w處理所獲得的植株多為嵌合體，受環(huán)境干擾大，往往不能穩(wěn)定遺傳，極易回復(fù)為原來(lái)的染色體倍數(shù)。離體加倍時(shí)常采用莖尖、頂芽、腋芽、叢生芽、離體葉片等作為外植體誘導(dǎo)材料，所獲得的變異植株很多也是嵌合體，還存在著變異率低下、倍性不穩(wěn)定等現(xiàn)象，從而必須進(jìn)行大量的篩選工作。這些成為限制通過(guò)誘導(dǎo)突變進(jìn)行多倍體育種的主要因素。因此，建立合適的植株再生體系是降低嵌合體發(fā)生的前提條件，是采用多倍體誘變育種時(shí)需要解決的一個(gè)重要的瓶頸問(wèn)題。
[0006]目前報(bào)道的白姜花離體植株再生體系主要是采用成熟種子的無(wú)菌苗的下胚軸作為外植體，或者采用不定芽誘導(dǎo)叢芽繁殖并再生完整植株，還沒(méi)有白姜花薄片培養(yǎng)技術(shù)和多倍體植株誘導(dǎo)成功的報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種利用薄片培養(yǎng)技術(shù)獲得白姜花四倍體植株的方法。該方法從試管苗莖段切取薄片，對(duì)薄片用秋水仙素進(jìn)行處理，然后采用薄片培養(yǎng)技術(shù)對(duì)處理后的薄片進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，獲得再生植株。通過(guò)對(duì)再生植株進(jìn)行檢測(cè)，篩選獲得四倍體植株。
[0008]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種利用薄片培養(yǎng)技術(shù)獲得白姜花四倍體植株的方法，包括如下步驟:
[0009](I)外植體的消毒和不定芽的誘導(dǎo):以白姜花的根狀莖萌發(fā)的芽為外植體，接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基A中進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)出不定芽；
[0010](2)不定芽成苗:將步驟(I)誘導(dǎo)的不定芽轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到健壯的試管苗；
[0011](3)試管苗的擴(kuò)繁:取步驟(2)得到的試管苗，從其基部切取薄片，接種在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基B中進(jìn)行培養(yǎng)，得到健壯的不定芽；將不定芽轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到試管苗；
[0012](4)根據(jù)需要重復(fù)步驟(3)，直到獲得足夠的試管苗；
[0013](5)四倍體植株的誘導(dǎo):取步驟(3)或(4)得到的試管苗，從其基部切取薄片，用秋水仙素溶液進(jìn)行浸泡處理；將處理后的薄片接種在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基B中進(jìn)行培養(yǎng)，得到不定芽；將不定芽轉(zhuǎn)移到成苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到誘變處理后的試管苗；
[0014](6)將步驟(5)中得到的試管苗進(jìn)行馴化，移栽到裝有營(yíng)養(yǎng)土的花盆，得到誘變的白姜花再生植株；
[0015](7)將步驟(6)所獲得的誘變的白姜花再生植株與原種二倍體植株苗期進(jìn)行對(duì)t匕，將葉片變寬大，顏色濃綠，葉脈凸顯，葉片微下垂生長(zhǎng)，氣孔變大，氣孔密度變小的植株選為候選植株；
[0016](8)取步驟(7)中獲得的候選植株的根尖，進(jìn)行染色體數(shù)目分析，選取染色體數(shù)目為2n = 4x = 68的幼苗，即獲得白姜花四倍體植株；
[0017](9)對(duì)步驟⑶所獲得的四倍體植株進(jìn)行田間觀察，選取花器官明顯變大、植株生長(zhǎng)具有明顯優(yōu)勢(shì)的植株，確定為具有優(yōu)良農(nóng)業(yè)性狀的白姜花四倍體植株。
[0018]步驟(I)中:
[0019]所述的白姜花的根狀莖萌發(fā)的芽?jī)?yōu)選采用以下方法進(jìn)行前處理:取白姜花的根狀莖萌發(fā)的芽，用水沖洗干凈后用洗潔精泡25?30分鐘，再用水沖洗25?30分鐘，用70?75wt%酒精進(jìn)行表面消毒60?90秒，最后用0.1wt %升汞消毒15?20分鐘，切取長(zhǎng)0.5?
2.0cm的芽作為外植體；
[0020]所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基A優(yōu)選為MS培養(yǎng)基+ (3?6) mg.L^6-BA+ (0.1?0.2)mg.L^NAA+SOg.L—1 蔗糖 +7g.L—1 瓊脂；
[0021]所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基A更優(yōu)選為MS培養(yǎng)基+5mg -Γ^-ΒΑ+Ο.2mg -L^NAA+SOg -Γ1蔗糖+7g.Γ1瓊脂；
[0022]所述的培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為20?40天；
[0023]步驟⑵中:
[0024]所述的成苗培養(yǎng)基優(yōu)選為1/2MS培養(yǎng)基+ (0.5?I) g.I/1活性炭+15g.Γ1蔗糖+7g.Γ1 瓊脂；
[0025]所述的成苗培養(yǎng)基更優(yōu)選為1/2MS培養(yǎng)基+Ig -T1活性炭+15g -T1蔗糖+7g -T1瓊脂；
[0026]所述的培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為15?45天；
[0027]步驟(3)中:
[0028]所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基B優(yōu)選為MS培養(yǎng)基+(I?5)mg.L^6-BA或(0.05?0.2)mg.L 1TDZ+ (0.1 ?0.2)mg.L ^AA+SOg.L 1 鹿糖 +7g.L 1 瓊脂；
[0029]所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基B更優(yōu)選為MS培養(yǎng)基+3mg ?U^-M+0.2mg ?L^NAA+SOg ?Γ1蔗糖+7g.Γ1瓊脂；
[0030]步驟(3)中，所述的不定芽長(zhǎng)為I?2cm ;所述的成苗培養(yǎng)基同步驟(2)中的成苗培養(yǎng)基；
[0031]所述的試管苗為不定芽轉(zhuǎn)移到成苗培養(yǎng)基上獲得的高6cm以上的植株；所述的薄片的厚度優(yōu)選為0.3?0.5mm ；
[0032]步驟(5)中，所述的秋水仙素溶液優(yōu)選為MS培養(yǎng)基+(0.2?0.8)wt%秋水仙素+1% (v/v)DMSO(二甲基亞砜)；所述的浸泡處理的時(shí)間優(yōu)選為12?36h ；
[0033]更優(yōu)選，所述的秋水仙素溶液為MS培養(yǎng)基+0.6￥七％秋水仙素+1% (v/v)DMS0(二甲基亞砜)；所述的浸泡處理的時(shí)間為24h ;
[0034]所述的在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基B中進(jìn)行培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為20?40天；
[0035]所述的轉(zhuǎn)移到成苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為15?45天；
[0036]步驟(I)、⑵、(3)、(5)的所述的培養(yǎng)基的pH為5.6?5.9，除TDZ采用過(guò)濾滅菌后加入到高溫高壓滅菌的培養(yǎng)基外，其余的培養(yǎng)基均采用高溫高壓滅菌(121°C、1.06kg/cm2 下滅菌 15min)；
[0037]步驟(I)、(2)、(3)、(5)的所述的培養(yǎng)的條件均在26?28°C、30 μ mo I.mY1光強(qiáng)(白色熒光燈)、16L/8D光照條件下進(jìn)行；
[0038]步驟(6)中，所述的馴化的時(shí)間優(yōu)選為3?7天；
[0039]所述的營(yíng)養(yǎng)土優(yōu)選為富含有機(jī)質(zhì)的土壤，如從花卉市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的用于花卉栽培的有機(jī)土、靚土 ；
[0040]所述的土壤優(yōu)選采用濃度為1/20MS培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽溶液一次澆透，整個(gè)過(guò)程不再施肥，視土壤的干濕情況適當(dāng)補(bǔ)充水分；
[0041]步驟￠)中，將步驟(5)中得到的試管苗移栽到花盆后，應(yīng)適當(dāng)遮陰，并保持土壤濕潤(rùn)，培養(yǎng)一個(gè)月待植株成活后即可轉(zhuǎn)入正常的栽培管理；
[0042]步驟(7)中:
[0043]所述的氣孔大小和密度測(cè)定方法為:選取發(fā)育程度一致的二倍體植株和秋水仙素處理后獲得的植株，取節(jié)位一致的葉片，從葉片相同部位，撕取下表皮，置于載玻片上，制作臨時(shí)裝片，于顯微鏡下測(cè)量氣孔的長(zhǎng)度和密度；
[0044]所述的葉片大小的測(cè)定方法:選取發(fā)育程度一致的二倍體植株和秋水仙素處理后獲得的植株，取葉片節(jié)位相同的葉片，測(cè)定葉長(zhǎng)(葉基部至葉尖長(zhǎng))和葉寬(葉片最寬的部位)；
[0045]步驟(8)中所述的染色體數(shù)目分析方法:選取二倍體植株和經(jīng)過(guò)秋水仙素處理獲得的候選植株，實(shí)驗(yàn)前一天17:00點(diǎn)澆足水，次日早上9:00點(diǎn)到10:00點(diǎn)，取根部白嫩粗壯的根尖，采用“解離-低滲-染色-壓片-觀察”方法進(jìn)行染色體數(shù)目分析；具體步驟如下:用解剖刀刮去根尖表皮，浸泡于解離液(37% HCl:951^C2H5OH= 1:3?1:5，體積比)中，常溫下解離5?8min ;取出根尖,用蒸懼水沖洗3?4遍,再放到蒸懼水中低滲25?30min ；取少量分生區(qū)材料用解剖針撥散，滴加苯酚品紅染液染色3?5min ;蓋上蓋玻片，吸掉多余的染液，再用濾紙蓋在蓋玻片上，用鉛筆橡皮頭隔著濾紙沿對(duì)角線輕輕敲擊蓋片，使材料成分分散均勻；將壓好的片子置于顯微鏡下觀察，鑒定染色體數(shù)目；觀察的細(xì)胞數(shù)不少于30個(gè)，分裂細(xì)胞中85%以上為恒定一致的染色體數(shù)即為該植物的染色體數(shù)；
[0046]所述的解離液優(yōu)選為體積比37% HCl:95% C2H5OH = 1:3 ;所述的解離的時(shí)間優(yōu)選為6min ;其中，37% HCl是指質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%的HCl ；95% C2H5OH是指體積百分?jǐn)?shù)為95%的 C2H5OH ；
[0047]步驟(9)中所述的花器官的大小的測(cè)定，采用唇瓣、翼瓣的長(zhǎng)度和寬度(最寬)、雄蕊的花絲、花藥的長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量；
[0048]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0049](I)本發(fā)明利用薄片培養(yǎng)技術(shù)建立的白姜花植株再生體系，具有操作簡(jiǎn)單、植株再生頻率高、再生周期短、取材容易的優(yōu)點(diǎn)，采用此技術(shù)，進(jìn)行白姜花多倍體的誘導(dǎo)，操作性強(qiáng)，易于普及和推廣。
[0050](2)進(jìn)行誘導(dǎo)突變時(shí)，所用的外植體為薄片，厚度只有0.3?0.5_，細(xì)胞數(shù)目少，在用秋水仙素進(jìn)行處理時(shí)，可以使外植體的細(xì)胞充分暴露于藥液中，所獲得的植株絕大多數(shù)為純合體，簡(jiǎn)化了多倍體植株的篩選過(guò)程。
[0051](3)本發(fā)明中所采用的染色體數(shù)目分析技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、所需時(shí)間短，獲得的染色體圖像清晰等優(yōu)點(diǎn)，解決了利用染色體數(shù)目進(jìn)行植株倍性檢測(cè)的耗時(shí)耗力的難題。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0052]圖1為實(shí)施例1利用薄片培養(yǎng)技術(shù)建立白姜花植株再生體系的過(guò)程。
[0053]圖2為實(shí)施例1獲得的四倍體植株與二倍體植株的植株外形、氣孔和染色體的比較結(jié)果圖；
[0054]圖3為實(shí)施例1獲得的四倍體植株與二倍體植株的花器官大小的比較結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0055]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0056]實(shí)施例中所需的各種培養(yǎng)基如下:
[0057]芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基A 為 MS 培養(yǎng)基 + (3 ?6) mg.Ll-BA+ (0.1 ?0.2) mg ?L^NAA+SOg.L—1蔗糖+7g.Γ1瓊脂；
[0058]成苗培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+ (0.5?I) g.L-1活性炭+15g.L-1蔗糖+7g.L-1瓊脂；
[0059]芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基B為MS培養(yǎng)基+(I?5)mg.L_16-BA或(0.05?0.2)mg.L 1TDZ+ (0.1 ?0.2) mg.L ^AA+SOg.L 1 鹿糖 +7g.L 1 瓊脂；
[0060]上述的培養(yǎng)基pH為5.6?5.9，除TDZ采用過(guò)濾滅菌后加入到高溫高壓滅菌的培養(yǎng)基外，其余的培養(yǎng)基均采用高溫高壓滅菌(12rC、1.06kg/cm2下滅菌15min);所有培養(yǎng)過(guò)程都在26?28°C、30 μ mo I.m—Y1光強(qiáng)(白色熒光燈)、16L/8D光照條件下進(jìn)行；
[0061]以上所述培養(yǎng)基的成分中，6-BA指6-芐基腺嘌呤；NAA指a_萘乙酸；TDZ指噻重氮苯基服，商品名噻苯隆(Thidiazuron, N-Phenyl-N’ -1, 2, 3-thiadiazol_5-ylurea, N-苯基-N-1，2，3-噻二唑-5-脲，TDZ) ；1/2MS培養(yǎng)基是指MS培養(yǎng)基的大量元素、微量元素、氨基酸和維生素含量均減半。
[0062]實(shí)施例1
[0063](I)外植體的消毒和不定芽的誘導(dǎo):取白姜花(Hedychium coronarium)(市售常規(guī)。下同)的根狀莖萌發(fā)出的新芽，用自來(lái)水沖洗干凈后用洗潔精泡30分鐘，再用自來(lái)水流動(dòng)沖洗30分鐘后用70wt%酒精進(jìn)行表面消毒60秒，最后用0.lwt%升汞消毒18分鐘，在超凈工作臺(tái)上切取0.5cm的芽作為外植體，接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基A中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)20天的培養(yǎng)誘導(dǎo)出不定芽；所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基A為MS培養(yǎng)基+3mg -Γ^-ΒΑ+Ο.2mg -L^1NAA+30g.Γ1 蔗糖 +7g.Γ1 瓊脂；
[0064](2)不定芽成苗:將步驟(I)誘導(dǎo)的不定芽轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基中，促進(jìn)苗生根成熟，培養(yǎng)15天后可獲得高6cm以上的健壯試管苗；所述的成苗培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+Ig -1/1活性炭+15g.Γ1蔗糖+7g.Γ1瓊脂；
[0065](3)不定芽的誘導(dǎo)和試管苗的獲得:將步驟(2)獲得的試管苗切取薄片(薄片厚0.3?0.5mm)，接種在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基B上中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)20天后可獲得健壯的不定芽；所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基B為MS培養(yǎng)基+2mg.Γ'Θ-ΒΑ+Ο.1mg.L^NAA+SOg.Γ1蔗糖+7g.Γ1瓊月旨;
[0066]將長(zhǎng)到Icm的不定芽轉(zhuǎn)移到成苗培養(yǎng)基上進(jìn)行成苗培養(yǎng)，培養(yǎng)15天可獲得健壯的試管苗；所述的成苗培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+Ig.Γ1活性炭+15g.Γ1蔗糖+7g.Γ1瓊脂；
[0067](4)根據(jù)需要重復(fù)步驟(3)，直到獲得足夠的試管苗；
[0068](5)薄片的誘導(dǎo)處理:取步驟(3)或⑷得到的試管苗，從其基部切取薄片(薄片厚0.3?0.5mm)，用MS培養(yǎng)基+0.2wt %秋水仙素+1 % (v/v)的DMSO液體培養(yǎng)基進(jìn)行浸泡處理36小時(shí)；處理后的薄片用蒸餾水沖洗I?2遍，接種在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基B (MS培養(yǎng)基+5mg.U^-M+0.2mg.L^NAA+SOg.Γ1蔗糖+7g.Γ1瓊脂)中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)20天后獲得健壯的不定芽；將不定芽轉(zhuǎn)移到成苗培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基+0.5g.Γ1活性炭+15g.Γ1蔗糖+7g.L-1瓊脂)上培養(yǎng)15天，得到誘變處理的試管苗；
[0069](6)將步驟(5)中得到的試管苗進(jìn)行開(kāi)瓶馴化，在室內(nèi)散射光照下放置7天，保持瓶?jī)?nèi)濕潤(rùn)。然后將苗清洗干凈，移栽到裝有營(yíng)養(yǎng)土的花盆，營(yíng)養(yǎng)土為從花卉市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的用于花卉栽培的有機(jī)土，植株移栽前用濃度為1/20MS培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽溶液一次澆透，整個(gè)過(guò)程再不施肥，視土壤的干濕情況適當(dāng)補(bǔ)充水分，保持土壤濕潤(rùn)并適當(dāng)遮陰，經(jīng)過(guò)I個(gè)月后得到誘變的白姜花再生植株，可以轉(zhuǎn)入正常的栽培管理。
[0070](7)將步驟(6)所獲得的誘變的白姜花再生植株與原種二倍體植株進(jìn)行對(duì)比，將葉片變寬大，顏色濃綠，葉脈凸顯，葉片微下垂生長(zhǎng)，氣孔變大，氣孔密度變小的植株選為候選植株；選取發(fā)育程度一致的二倍體植株和秋水仙素處理后獲得的植株，取節(jié)位一致的葉片，從葉片相同部位撕取下表皮，置于載玻片上，制作臨時(shí)裝片，于顯微鏡下測(cè)量氣孔的長(zhǎng)度和密度；選取發(fā)育程度一致的二倍體植株和秋水仙素處理后獲得的植株，取葉片節(jié)位相同的葉片，測(cè)定葉長(zhǎng)(葉基部至葉尖長(zhǎng))和葉寬(葉片最寬的部位)；結(jié)果分別如表I和圖2中A、B、E、F所示。
[0071](8)選取步驟(7)中獲得的候選植株，用二倍體植株做對(duì)照。實(shí)驗(yàn)前一天17:00點(diǎn)澆足水，次日早上9:00點(diǎn)到10:00點(diǎn)，取根部白嫩粗壯的根尖，采用“解離-低滲-染色-壓片-觀察”方法進(jìn)行染色體數(shù)目分析；具體步驟如下:用解剖刀刮去根尖表皮，浸泡于解離液(37% HCl:95% C2H5OH = 1:3，體積比)中，常溫下解離6min ;取出根尖，用蒸餾水沖洗3遍，再放到蒸餾水中低滲30min ;取少量分生區(qū)材料用解剖針撥散，滴加苯酚品紅染液染色3min;蓋上蓋玻片，吸掉多余的染液，再用濾紙蓋在蓋玻片上，用鉛筆橡皮頭隔著濾紙沿對(duì)角線輕輕敲擊蓋片，使材料成分分散均勻；將壓好的片子置于顯微鏡下觀察，鑒定染色體數(shù)目；觀察的細(xì)胞數(shù)不少于30個(gè),分裂細(xì)胞中85%以上為2n = 4x = 68條染色體數(shù)的植株，確定為白姜花四倍體植株(如圖2(:、0所示)。
[0072](9)對(duì)步驟(8)所獲得的四倍體植株進(jìn)行田間觀察，測(cè)定花器官的唇瓣、翼瓣的長(zhǎng)度和寬度(最寬)，并測(cè)定雄蕊的花絲、花藥的長(zhǎng)度；將花器官明顯變大的植株確定為具有優(yōu)良農(nóng)業(yè)性狀的白姜花四倍體植株。表2和圖3所示為二倍體植株和四倍體植株花器官的比較。
[0073]表1 二倍體植株和四倍體植株的葉片和氣孔特征比較
[0074]
【權(quán)利要求】
1.一種利用薄片培養(yǎng)技術(shù)獲得白姜花四倍體植株的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)外植體的消毒和不定芽的誘導(dǎo):以白姜花的根狀莖萌發(fā)的芽為外植體，接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基A中進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)出不定芽； (2)不定芽成苗:將步驟(I)誘導(dǎo)的不定芽轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到健壯的試管苗；(3)試管苗的擴(kuò)繁:取步驟(2)得到的試管苗，從其基部切取薄片，接種在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基B中進(jìn)行培養(yǎng)，得到健壯的不定芽；將不定芽轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到試管苗； (4)根據(jù)需要重復(fù)步驟(3)，直到獲得足夠的試管苗； (5)四倍體植株的誘導(dǎo):取步驟(3)或⑷得到的試管苗，從其基部切取薄片，用秋水仙素溶液進(jìn)行浸泡處理；將處理后的薄片接種在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基B中進(jìn)行培養(yǎng)，得到不定芽；將不定芽轉(zhuǎn)移到成苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到誘變處理后的試管苗； (6)將步驟(5)中得到的試管苗進(jìn)行馴化，移栽到裝有營(yíng)養(yǎng)土的花盆，得到誘變的白姜花再生植株； (7)將步驟(6)所獲得的誘變的白姜花再生植株與原種二倍體植株苗期進(jìn)行對(duì)比，將葉片變寬大，顏色濃綠，葉脈凸顯，葉片微下垂生長(zhǎng)，氣孔變大，氣孔密度變小的植株選為候選植株； (8)取步驟(7)中獲得的候選植株的根尖，進(jìn)行染色體數(shù)目分析，選取染色體數(shù)目為2η=4χ = 68的幼苗，即獲得白姜花四倍體植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 步驟(I)中所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基A為MS培養(yǎng)基+(3?6)mg.^6^+(0.1?0.2)mg.L^NAA+SOg.L—1 蔗糖 +7g.L—1 瓊脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述的成苗培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+(0.5?I) g.I/1活性炭+15g.Γ1蔗糖+7g.Γ1瓊脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基B為MS培養(yǎng)基+(I?5)mg.Ll-BA或(0.05?0.2)mg.L 1TDZ+ (0.1 ?0.2) mg.L ^AA+SOg.L 1 鹿糖 +7g.L 1 瓊脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 步驟(5)中，所述的秋水仙素溶液為MS培養(yǎng)基+ (0.2?0.8)被％秋水仙素+體積百分比 I % DMSO ； 所述的浸泡處理的時(shí)間為12?36h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 步驟(I)中: 所述的白姜花的根狀莖萌發(fā)的芽采用以下方法進(jìn)行前處理:取白姜花的根狀莖萌發(fā)的芽，用水沖洗干凈后用洗潔精泡25?30分鐘，再用水沖洗25?30分鐘，用70?75被％酒精進(jìn)行表面消毒60?90秒，最后用0.lwt%升萊消毒15?20分鐘，切取長(zhǎng)0.5?2.0cm的芽作為外植體； 所述的培養(yǎng)的時(shí)間為20?40天； 步驟(2)中所述的培養(yǎng)的時(shí)間為15?45天。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 步驟⑶中: 所述的不定芽長(zhǎng)為I?2cm ； 所述的試管苗為不定芽轉(zhuǎn)移到成苗培養(yǎng)基上獲得的高6cm以上的植株； 所述的在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基B中進(jìn)行培養(yǎng)的時(shí)間為20?40天； 所述的轉(zhuǎn)移到成苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)的時(shí)間為15?45天。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述的薄片的厚度為0.3?0.5mm ； 步驟(6)中，所述的馴化的時(shí)間為3?7天。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 步驟(I)、(2)、(3)、(5)的所述的培養(yǎng)基的pH為5.6?5.9，除TDZ采用過(guò)濾滅菌后加入到高溫高壓滅菌的培養(yǎng)基外，其余的培養(yǎng)基均采用高溫高壓滅菌； 步驟(I)、(2)、(3)、(5)的所述的培養(yǎng)的條件均在26?28°C、30ymol.πΓΥ1光強(qiáng)、16L/8D光照條件下進(jìn)行。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(8)中所述的染色體數(shù)目分析方法:選取二倍體植株和經(jīng)過(guò)秋水仙素處理獲得的候選植株，實(shí)驗(yàn)前一天17:00點(diǎn)澆足水，次日早上9:00點(diǎn)到10:00點(diǎn)，取根部白嫩粗壯的根尖，采用“解離-低滲-染色-壓片-觀察”方法進(jìn)行染色體數(shù)目分析；具體步驟如下:用解剖刀刮去根尖表皮，浸泡于解離液中，常溫下解離5?8min ;取出根尖,用蒸懼水沖洗3?4遍,再放到蒸懼水中低滲25?30min ；取少量分生區(qū)材料用解剖針撥散，滴加苯酚品紅染液染色3?5min ;蓋上蓋玻片，吸掉多余的染液，再用濾紙蓋在蓋玻片上，用鉛筆橡皮頭隔著濾紙沿對(duì)角線輕輕敲擊蓋片，使材料成分分散均勻；將壓好的片子置于顯微鏡下觀察，鑒定染色體數(shù)目；觀察的細(xì)胞數(shù)不少于30個(gè)，分裂細(xì)胞中85%以上為恒定一致的染色體數(shù)即為該植物的染色體數(shù)； 所述的解離液為37% HCl與95% C2H5OH按體積比1: (3?5)配制得到。
【文檔編號(hào)】A01H1/08GK104170729SQ201410460845
【公開(kāi)日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月11日
【發(fā)明者】肖望, 涂紅艷, 袁學(xué)文, 鄧崇會(huì), 黃少麗, 張琳偉, 張棣升 申請(qǐng)人:廣東第二師范學(xué)院