一種通過胚搶救獲得柑橘雜交后代的方法
【專利摘要】一種通過胚搶救獲得柑橘雜交后代的方法，通過提取抗病性強(qiáng)的植株花粉，對(duì)母本植株進(jìn)行雜交授粉，獲得雜交果實(shí)后，將合子胚、珠心胚分離開，保留合子胚，并對(duì)合子胚采用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)，避免了合子胚的敗育，具有抗?jié)儾∮行院蟠仓?，具有操作性?qiáng)、簡(jiǎn)單實(shí)用、效果顯著等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種通過胚搶救獲得柑橘雜交后代的方法
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明涉及一種獲得柑橘雜交后代的方法，具體涉及一種通過胚搶救獲得柑橘雜交后代的方法。
【【背景技術(shù)】】
[0002]柑橘在目前已成為世界上第一大水果，每年總產(chǎn)已超過I億噸，占世界水果總產(chǎn)的25%左右，是世界第三大貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品。全球有100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)生產(chǎn)柑橘。我國(guó)是柑橘的原產(chǎn)中心之一，也是柑橘的生產(chǎn)大國(guó)，種植面積及產(chǎn)量均居世界第一。柑橘潰瘍病(citrus bacterial cankerdisease, CBO))是一種世界性病害，是國(guó)際、國(guó)內(nèi)植物檢疫對(duì)象，該病起源于亞洲，分布于世界多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，又稱為亞洲病害。近年來，各地區(qū)該病害發(fā)生有加重趨勢(shì)，給柑橘產(chǎn)業(yè)帶來了巨大損失。
[0003]由于不同柑橘種類和品種對(duì)潰瘍病的抗性差異大，枸櫞的果實(shí)果肉硬，酸澀苦，口感粗糙，商品性差但抗??；而冰糖橙少子，香甜多汁，商品性好但易感病。從柑橘潰瘍病抗性遺傳上講，用抗病品種作母本的雜交后代，多數(shù)表現(xiàn)為抗病或介于雙親之間，用感病品種作母本的雜交后代幾乎都表現(xiàn)為感病。因此，通過常規(guī)雜交育種的方式，以枸櫞為父本，冰糖橙為母本，期望得到對(duì)柑橘潰瘍病有抗性且商品性良好的雜交后代。
[0004]然而柑橘有多胚現(xiàn)象，即在種子發(fā)育過程中或成熟種子中出現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上的胚，這些胚中除一個(gè)是由受精卵發(fā)育的合子胚，其余都是由珠心細(xì)胞發(fā)育來的珠心胚。珠心胚的旺盛生長(zhǎng)，往往在合子胚的發(fā)育過程中侵入胚囊，阻礙合子胚的發(fā)育，使合子胚在發(fā)育的早期階段就敗育或退化，由于柑橘種子多胚性和育種周期長(zhǎng)，柑橘雜交育種一直較難取得成功。
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【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005]本發(fā)明針對(duì)上述問題，提供一種通過胚搶救獲得柑橘雜交后代的方法，通過將雜交授粉后果實(shí)種子中合子胚、珠心胚分離開，之后對(duì)合子胚進(jìn)行培養(yǎng)以獲得具有抗?jié)儾〉母涕匐s交后代。
[0006]本發(fā)明提供的一種通過胚搶救獲得柑橘雜交后代的方法，其包括以下步驟:
[0007]SOl:雜交授粉:提取父本花粉；對(duì)母本花朵進(jìn)行去雄處理后，授以父本花粉；將授粉后的母本花朵進(jìn)行套袋密封處理；8?12天之后去掉密封袋，噴?；ū９麆?；
[0008]S02:提取合子胚:母本花朵進(jìn)行雜交授粉90?110天后，采收幼果待用；將采收的幼果進(jìn)行消毒處理后，取出果實(shí)種子；之后將撥開果實(shí)種子果皮，將果實(shí)種子內(nèi)的合子胚、珠心胚分離開，去掉珠心胚，保留合子胚；
[0009]S03:合子胚培養(yǎng)、獲得胚培苗:將獲取的合子胚放入Murashge and Tucker (以下簡(jiǎn)稱MT)+GA3(赤霉素)lmg/L培養(yǎng)基后，放入密封的培養(yǎng)器中，在溫度為26°C?28°C、濕度為75%?85%的無光條件下培養(yǎng)5?7天，待合子胚生出根后在有光條件下繼續(xù)培養(yǎng)，25?35天之后將合子胚轉(zhuǎn)入MT+GA3(赤霉素)lmg/L+3%蔗糖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)獲得胚培苗；
[0010]S04:煉苗、移栽:待胚培苗長(zhǎng)出至少3片真葉后，將密封的培養(yǎng)器打開進(jìn)行煉苗，7?15天后，清洗掉胚培苗根部殘留的培養(yǎng)基，移栽至裝有基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中。
[0011]特別的，所述步驟SOl采用人工點(diǎn)授法，首先將獲取的I份父本花粉與5?8份滑石粉混合均勻獲得稀釋花粉，將獲得的稀釋花粉裝入瓶中，之后采用一端具有彈性部件的桿狀件沾取稀釋花粉，每沾取一次點(diǎn)授3?5多母本花朵。
[0012]特別的，所述步驟S02中對(duì)幼果消毒時(shí)首先將幼果果實(shí)表面用75%酒精進(jìn)行第一次消毒，之后將幼果放于酒精燈上灼燒進(jìn)行第二次消毒，直至果實(shí)表皮變黑。
[0013]特別的，所述步驟S03中對(duì)于在無光環(huán)境下未生根的合子胚，將其轉(zhuǎn)入MT+IBA0.5mg/L的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)生根，生根后轉(zhuǎn)入MT+GA3(赤霉素)lmg/L+3%蔗糖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)獲得胚培苗。
[0014]特別的，所述步驟S04中，所述基質(zhì)為MT+GA3lmg/L+3%蔗糖培養(yǎng)基。
[0015]相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明通過將合子胚、珠心胚分離開后，避免了合子胚的敗育，采用人工培養(yǎng)基對(duì)合子胚進(jìn)行培養(yǎng)，可在短期內(nèi)獲得大量具有抗?jié)儾∮行院蟠仓?，具有操作性?qiáng)、簡(jiǎn)單實(shí)用、效果顯著等優(yōu)點(diǎn)。
【【具體實(shí)施方式】】
[0016]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下通過實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0017]實(shí)驗(yàn)中采用母本:冰糖橙(CitrussinensisOsbeck),父本:枸櫞(Citrusmedica),定植于國(guó)家柑橘種質(zhì)資源圃。
[0018]本發(fā)明所提供的一種通過胚搶救獲得柑橘雜交后代的方法，具體包括以下步驟:
[0019]S01:雜交授粉:
[0020]1.采集枸櫞花瓣未開放的花朵，用鑷子摘取掉花瓣，將花藥摘下放置于墊有紙張的培養(yǎng)皿上，之后將培養(yǎng)皿放置于溫度為22?25°C的環(huán)境下，I?2天后花藥裂開散粉，將花粉用篩子篩去雜物后，將獲得的枸櫞花粉裝在暗色瓶?jī)?nèi)，密封后放于冰箱內(nèi)備用；
[0021]2.將獲取的I份父本花粉與5?8份滑石粉混合均勻獲得稀釋花粉，將獲得的稀釋花粉裝入瓶中，在冰糖橙花藥成熟但花朵未開放時(shí)，用鑷子將花瓣去除，再將花藥或?qū)⒒ńz去掉，之后采用一端具有彈性部件的桿狀件沾取稀釋花粉，在冰糖橙花朵柱頭上輕輕一抹，每沾取一次點(diǎn)授3?5多冰糖橙花朵，采用此方法可以使父本花粉送粉到柱頭，進(jìn)一步使坐果準(zhǔn)確可靠，果實(shí)發(fā)育整齊；此次對(duì)4500朵花進(jìn)行人工授粉，采收時(shí)，結(jié)果424個(gè)，采用本發(fā)明所提供的授粉方式坐果率為9.42%，一般柑橘坐果率為2.5%?5%，可見采次授粉坐果率較高；
[0022]3.用羊皮紙做成防雨小袋，將授粉后的冰糖橙柱頭套袋，之后用回形針封住袋口，授粉8?12天之后去掉防雨小袋，噴保花保果劑。
[0023]S02:提取合子胚:
[0024]1.冰糖橘花朵于授粉90?110天后，采摘100個(gè)果實(shí)，此時(shí)果實(shí)種子中的種子沒有發(fā)育成熟，合子胚尚未敗育；
[0025]2.將采收的幼果放在消過毒的工作臺(tái)上，之后將果實(shí)表面用75%酒精進(jìn)行第一次消毒，然后將幼果放于酒精燈火焰上直至果實(shí)表皮變黑，此時(shí)消毒完成，然后用消過毒的手術(shù)刀沿幼果果實(shí)赤道面將果實(shí)切開成兩半，注意不碰傷種子，此次共取得269粒果實(shí)種子;
[0026]3.將獲取的果實(shí)放于顯微鏡下，采用消過毒的手術(shù)刀將種子剝開部分種皮，之后采用消過毒的鑷子和手術(shù)刀將每粒種子的合子胚、珠心胚逐一分離開，共獲得1644個(gè)合子胚。
[0027]S03:合子胚培養(yǎng)、獲得胚培苗:整個(gè)合子胚培育過程溫度保持在26V?28°C、濕度保持在75%?85%。
[0028]將獲取的合子胚放入MT+GA3 (赤霉素)lmg/L的培養(yǎng)基后,放入密封的培養(yǎng)器中，在無光條件下培養(yǎng)5?7天，待合子胚生出根后在有光條件下繼續(xù)培養(yǎng)，25?35天之后將合子胚轉(zhuǎn)入MT+GA3(赤霉素)lmg/L+3%蔗糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)獲得胚培苗；對(duì)于在無光環(huán)境下未生根的合子胚，繼續(xù)培養(yǎng)觀察5?7天，生根后在有光條件下繼續(xù)培養(yǎng)，25?35天之后將合子胚轉(zhuǎn)入MT+GA3(赤霉素)lmg/L+3%蔗糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)獲得胚培苗；對(duì)于仍未生根的合子胚將其將其轉(zhuǎn)入MT+IBA0.5mg/L的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)生根，生根后轉(zhuǎn)入MT+GA3lmg/L+3%蔗糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)獲得胚培苗；將就不生根的合子胚轉(zhuǎn)入MT+IBA0.5mg/L培養(yǎng)基中，能較好的促進(jìn)生根。
[0029]S04:煉苗、移栽:
[0030]待胚培苗長(zhǎng)出至少3片真葉后，將密封的培養(yǎng)器打開進(jìn)行煉苗，使胚培苗生長(zhǎng)環(huán)境溫度、濕度與外界環(huán)境一致，7?15天后，清洗掉胚培苗根部殘留的培養(yǎng)基，移栽至裝有新鮮MT+GA3lmg/L+3%蔗糖培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)缽中。煉苗后移栽至營(yíng)養(yǎng)缽中的苗為432株，最終存活146棵植株苗。
[0031]在整個(gè)培養(yǎng)過程中，需適時(shí)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行觀察，并定期更換培養(yǎng)基，避免培養(yǎng)基因時(shí)間過久發(fā)霉，而引起合子胚或胚培苗因霉菌感染而導(dǎo)致死亡；且整個(gè)過程中所使用的器具必須進(jìn)行高度滅菌處理。
[0032]本發(fā)明采用便于觀察調(diào)控的懸浮培養(yǎng)方式，培養(yǎng)基MT各成分如表I。
[0033]表I培養(yǎng)基MT各成分及含量
[0034]
【權(quán)利要求】
1.一種通過胚搶救獲得柑橘雜交后代的方法，其特征在于，包括以下步驟: 501:雜交授粉:提取父本花粉；對(duì)母本花朵進(jìn)行去雄處理后，授以父本花粉；將授粉后的母本花朵進(jìn)行套袋密封處理，8?12天之后去掉密封袋，噴保花保果劑； 502:提取合子胚:母本花朵進(jìn)行雜交授粉90?110天后，采收幼果待用；將采收的幼果進(jìn)行消毒處理后，取出果實(shí)種子；之后將撥開果實(shí)種子果皮，將果實(shí)種子內(nèi)的合子胚、珠心胚分離開，去掉珠心胚，保留合子胚； 503:合子胚培養(yǎng)、獲得胚培苗:將獲取的合子胚放入MT+GA3lmg/L培養(yǎng)基后，放入密封的培養(yǎng)器中，在溫度為26°C?28°C、濕度為75%?85%的無光條件下培養(yǎng)5?7天，待合子胚生出根后在有光條件下繼續(xù)培養(yǎng)，25?35天之后將合子胚轉(zhuǎn)入MT+GA3lmg/L+3%蔗糖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)獲得胚培苗； 504:煉苗、移栽:待胚培苗長(zhǎng)出至少3片真葉后，將密封的培養(yǎng)器打開進(jìn)行煉苗，7?15天后，清洗掉胚培苗根部殘留的培養(yǎng)基，移栽至裝有基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過胚搶救獲得柑橘雜交后代的方法，其特征在于，所述步驟SOl采用人工點(diǎn)授法，首先將獲取的I份父本花粉與5?8份滑石粉混合均勻獲得稀釋花粉，將獲得的稀釋花粉裝入瓶中，之后采用一端具有彈性部件的桿狀件沾取稀釋花粉，每沾取一次點(diǎn)授3?5多母本花朵。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過胚搶救獲得柑橘雜交后代的方法，其特征在于，所述步驟S02中對(duì)幼果消毒時(shí)首先將幼果果實(shí)表面用75%酒精進(jìn)行第一次消毒，之后將幼果放于酒精燈上灼燒進(jìn)行第二次消毒，直至果實(shí)表皮變黑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過胚搶救獲得柑橘雜交后代的方法，其特征在于，所述步驟S03中對(duì)于在無光環(huán)境下未生根的合子胚，將其轉(zhuǎn)入MT+IBA0.5mg/L的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)生根，生根后轉(zhuǎn)入MT+GA3lmg/L+3%蔗糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)獲得胚培苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過胚搶救獲得柑橘雜交后代的方法，其特征在于，所述步驟S04中，所述基質(zhì)為MT+GA3lmg/L+3%蔗糖培養(yǎng)基。
【文檔編號(hào)】A01H1/02GK104126499SQ201410349079
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月22日
【發(fā)明者】陳仕貴, 陳揚(yáng), 朱麗娜, 張子燁, 崔勇 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)