公丁香提取物及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種公丁香提取物，由下述步驟制備：(1)將公丁香葉片于40～65℃烘干，粉碎；(2)按質(zhì)量體積比1∶3～9加入95％的乙醇，微波處理同時(shí)500～600W電加熱70～120s，過(guò)濾得濾液；(3)按質(zhì)量體積比1∶3～9加入95％的乙醇，浸泡4～6d，過(guò)濾得濾液；(4)按質(zhì)量體積比1∶3～9加入95％的乙醇，功率為500～650W的超聲波提取1～1.5h，過(guò)濾得濾液；(5)合并步驟(2)、(3)和(4)的濾液，在40～55℃和400～600毫米汞柱下濃縮，得浸膏；及其在防治煙草青枯病方面的應(yīng)用。本發(fā)明能抑制青枯病菌的生長(zhǎng)，處理后，青枯菌鞭毛消失破、菌體消解，抑制菌體蛋白合成，降低POD、CAT、SDH酶活。此外，煙草青枯病的溫室和田間防效分別達(dá)到71.5％和59.7％，具有較大應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】公丁香提取物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物病害生物防治【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是一種公丁香提取物，及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum)引起的典型的土傳病 害，是煙草上的主要?dú)缧圆『χ?。近年?lái)，受氣候變暖、土壤酸化以及種植制度（連作） 等因素影響，發(fā)生范圍、危害程度逐年加重，成為制約福建、湖北、重慶、湖南、云南、四川等 煙區(qū)的烤煙種植的主要限制因素之一。由于生產(chǎn)上基本無(wú)優(yōu)質(zhì)抗病的煙草品種可利用，針 對(duì)煙草青枯病的防治主要以農(nóng)用硫酸鏈霉素防治為主，防治效果不理想，且由于使用年限 較長(zhǎng)，防治效果下降趨勢(shì)明顯。生物防治也是近年來(lái)人們努力的方向，篩選了大量的生防微 生物，由于微生物容易受環(huán)境條件影響，防治效果差且不穩(wěn)定。植物源農(nóng)藥，就是直接利用 或提取植物的根、莖、葉、花、果、種子等或利用其次生代謝物質(zhì)制成具有殺蟲(chóng)或殺菌作用的 活性物質(zhì)。植物被認(rèn)為是化學(xué)合成殺菌劑最好的替代品，尤其是藥用植物更具有開(kāi)發(fā)為植 物源殺菌劑的巨大潛力。
[0003]利用中藥材提取物進(jìn)行病害防治的相關(guān)研究報(bào)道也越來(lái)越多。Amadioha等發(fā)現(xiàn) 苦楝樹(shù)種子的提取物對(duì)稻瘟病菌表現(xiàn)出良好的防治效果，可與多菌靈相媲美。姜雯婷等測(cè) 定52種熱帶藥用植物對(duì)煙草青枯病菌的抑菌圈直徑和最小抑菌濃度，發(fā)現(xiàn) 13種熱帶藥用 植物對(duì)煙草青枯菌具有抑制作用。相較于生防微生物，植物源抗菌物質(zhì)除了具有天然無(wú)公 害的優(yōu)勢(shì)外，其制備條件和防治效果更為穩(wěn)定，因此具有重要應(yīng)用前景，但上述植物源抗菌 物質(zhì)的來(lái)源少，獲取成本較高。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種公丁香提取物，獲取方便，操作簡(jiǎn)單。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：一種公丁香提取物，由下述步 驟制備：
[0006] (1)、將公丁香葉片于40?65°C烘干，粉碎；
[0007] (2)、按質(zhì)量體積比1 : 3?9加入95%的乙醇，微波處理同時(shí)500?600W電加熱 70?120s，過(guò)濾得濾液；
[000S] (3)、按質(zhì)5體積比1 : 3?9加入的乙醇，浸泡4?6d，過(guò)濾得濾液；
[0009] (4)、按質(zhì)量體積比1 : 3?9加入95%的乙醇，功率為500?650W的超聲波提取 1?1.5h，過(guò)濾得濾液；
[0010] (5)、合并步驟⑵、⑶和⑷的濾液，在40?55?和400?600毫米汞柱下濃 縮，得浸膏。
[0011]優(yōu)選的，步驟（1)中粉碎后過(guò)孔徑〇.425麵的篩。
[0012]優(yōu)選的，步驟（1)烘干米用的是電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。
[0013]優(yōu)選的，步驟（5)中濃縮米用的是旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
[0014] 本發(fā)明還提供如上所述公丁香提取物在防治煙草青枯病方面的應(yīng)用。
[0015] 優(yōu)選的，在煙草青枯病發(fā)病初期施用公丁香提取物。
[0016] 優(yōu)選的，將公丁香提取物稀釋400倍，每間隔7?10天施用，連續(xù)2?3次。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：公丁香提取物能抑制青枯病菌的生長(zhǎng)，處 理后，青枯菌鞭毛消失破、菌體消解，抑制菌體蛋白合成，降低POD、CAT、SDH酶活。經(jīng)鑒定， 該提取物主要活性成分為丁香酚和乙酸丁香酚酯。此外，煙草青枯病的溫室和田間防效分 別達(dá)到71. 5%和59. 7%，具有較大應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為正常煙草青枯菌透射電鏡下的觀察結(jié)果；
[0019] 圖2為經(jīng)公丁香提取物處理過(guò)的煙草青枯病菌在透射電鏡下的觀察結(jié)果；
[0020] 圖3為電泳比較圖；
[0021] 圖4為公丁香提取液進(jìn)行GC-MS分析鑒定的總離子流圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，本部分的描述僅是示范性和解釋性，不 應(yīng)對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍有任何的限制作用。
[0023] 實(shí)施例1抗青枯病菌中藥材篩選 [0024] 1. 1 材料
[0025]自北京同仁堂青島分店購(gòu)買(mǎi)的40種中藥材，見(jiàn)表1，篩選出抗青枯病菌的藥材。 [0026] 供試菌株：致病性青枯病原菌由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所從煙田采集感染病株 分離純化獲得。
[0027] 培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨固體和液體培養(yǎng)基（NA培養(yǎng)基）、燕麥培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄 糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）
[0028] 1· 2藥材提取液的制備
[0029] 將所購(gòu)買(mǎi)的40種植物陰干，置于50°C電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘千，粉碎機(jī)粉碎后 過(guò)0· 425臟篩。稱(chēng)取50. 0g植物干粉于500mL三角瓶，加入95%乙醇300mL微波萃取法 (微波爐調(diào)至中火，9〇s)，過(guò)濾并收集提取液，再加入300mL95%乙醇冷浸5d,過(guò)濾并收集提 取液，再次加入300mL 95%乙醇，超聲波（功率為600W)提取lh，過(guò)濾并收集提取液，合并 提取液，在50°C下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，回收溶劑，所得浸膏用甲醇定容為質(zhì)量濃度 l〇〇g/L的溶液，獲藥材提取液，置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>
[0030] 1. 3煙草青枯病菌拮抗實(shí)驗(yàn)
[0031]菌懸液制備。將煙草青枯菌用接種環(huán)將菌株接種于裝有NA液體培養(yǎng)基的三角瓶 中，30°C恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24h，振動(dòng)頻率120r/min。加入無(wú)菌生理水，稀釋成濃度為108CFU/ mL的菌液。
[0032]抑菌試驗(yàn)采用牛津杯法進(jìn)行測(cè)定。將熔化的NA培養(yǎng)基冷卻至約5(TC，每100mL ΝΑ培養(yǎng)基中加入lmL病原菌菌懸液（lOSCFU/mL)，充分搖勻后制備帶有病原菌的平板。待 培養(yǎng)基凝固后用鑷子將無(wú)菌的牛津杯（8mm)輕輕放入培養(yǎng)皿中，在水平放置的平皿中均勻 地放置3只牛津杯。同時(shí)吸取150 μ L藥材提取液加入牛津杯中，每處理3次重復(fù)。對(duì)照加 ^寸里鴨。平板于超凈I：作臺(tái)內(nèi)放置4h以賄大部分麵擴(kuò)散纖脂中，之后將平板于 置30°c恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。
[0033] 1.4試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。
[0034] 表1四十種藥材提取液對(duì)煙草青枯病菌、黑脛病菌及赤星病菌的抑菌作用結(jié)果
[0035]
【權(quán)利要求】
1. 一種公丁香提取物，由下述步驟制備： (1) 、將公丁香葉片于40?65°C烘干，粉碎； (2) 、按質(zhì)量體積比1 : 3?9加入95%的乙醇，微波處理同時(shí)500?600W電加熱70? 120s，過(guò)濾得濾液； (3) 、按質(zhì)量體積比1 : 3?9加入95%的乙醇，浸泡4?6d，過(guò)濾得濾液； (4) 、按質(zhì)量體積比1 : 3?9加入95%的乙醇，功率為500?650W的超聲波提取1? 1.5h，過(guò)濾得濾液； (5) 、合并步驟（2)、⑶和⑷的濾液，在40?55°C和400?600毫米汞柱下濃縮，得 浸膏。
2. 如權(quán)利要求1所述公丁香提取物，其特征在于：步驟（1)中粉碎后過(guò)孔徑0.425mm的 篩。
3. 如權(quán)利要求1所述公丁香提取物，其特征在于：步驟（1)烘干采用的是電熱恒溫鼓 風(fēng)干燥箱。
4. 如權(quán)利要求1所述公丁香提取物，其特征在于：步驟（5)中濃縮采用的是旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 儀。
5. 如權(quán)利要求1所述公丁香提取物在防治煙草青枯病方面的應(yīng)用。
6. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于：在煙草青枯病發(fā)病初期施用公丁香提取物。
7. 如權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于：將公丁香提取物稀釋400倍，每間隔 7?10天施用，連續(xù)2?3次。
【文檔編號(hào)】A01N65/28GK104247719SQ201410348099
【公開(kāi)日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2014年7月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月22日
【發(fā)明者】林勇, 孔凡玉, 徐茜, 戴培剛, 陳志厚, 張成省, 徐辰生, 夏艷, 馮超, 王靜, 韓騰, 董瑜 申請(qǐng)人:福建省煙草公司南平市公司, 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所