一種雜交鵝掌楸LhPIN3基因及其應(yīng)用的制作方法

一種雜交鵝掌楸LhPIN3基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雜交鵝掌楸LhPIN3基因及其應(yīng)用，該雜交鵝掌楸LhPIN3基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明在建立成熟的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生體系的基礎(chǔ)上，克隆生長素運輸?shù)鞍谆騆hPIN3，通過表達(dá)分析，證明了雜交鵝掌楸的LhPIN3基因在雜交鵝掌楸體胚發(fā)生過程中對胚性細(xì)胞發(fā)育和體胚苗生長有較大的影響，其過表達(dá)試驗發(fā)現(xiàn)LhPIN3的過表達(dá)會影響植株的生長發(fā)育，另外LhPIN3的表達(dá)還可以部分拯救擬南芥LhPIN3基因功能完全喪失的pin1突變體，使其恢復(fù)表型，開花并結(jié)出莢果，因此可應(yīng)用于植物體胚發(fā)生、不定根誘導(dǎo)、不定芽的誘導(dǎo)和分化等，具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】—種雜交鵝掌楸A/^/似基因及其應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種雜交鵝掌楸基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]20世紀(jì)生物技術(shù)在林木優(yōu)良材料和新品種的發(fā)現(xiàn)與培育中的重要進(jìn)步是體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)及再生植株培育技術(shù)的應(yīng)用。體胚發(fā)生技術(shù)由于其兩極性、繁殖速度快、效率高等特點，已經(jīng)成為優(yōu)良林木資源快速無性繁殖的重要手段，并且它能和生物反應(yīng)器結(jié)合實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。體細(xì)胞胚發(fā)生的本質(zhì)是細(xì)胞分化的問題，細(xì)胞分化使體細(xì)胞發(fā)育成體細(xì)胞胚進(jìn)而發(fā)育成一個完整植株。而細(xì)胞分化的分子基礎(chǔ)則是基因差異表達(dá)與調(diào)控的結(jié)果。所以研究這些相關(guān)基因可以使我們更好的了解體細(xì)胞發(fā)生技術(shù)的原理。
[0003]雜交鵝掌楸是我國著名林木遺傳育種家葉培忠教授利用分布在我國的中國鵝掌歌 iLiriodendron chinensis (HemsI.)Sarg.)和分布在北美的北美鶴掌揪(Zirioofeflt/ro/?tulip if era Linn.)通過人工雜交育成的種間雜種。雜交鵝掌楸不僅具有生長快，抗性強，材質(zhì)好，而且其樹形美觀，花色艷麗，是一種適用于庭院栽培，道路綠化，荒山荒地造林等多種用途的優(yōu)良樹種。雜交鵝掌楸雖然有許多優(yōu)越性，但雜交制種受到季節(jié)和效率的限制，影響了雜交鵝掌楸的推廣應(yīng)用，由于植物體細(xì)胞胚具有數(shù)量多，一旦形成體細(xì)胞胚就能夠快速發(fā)育成再生植株的特點，以體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)快速繁殖種子來源困難的雜交鵝掌楸，具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。到目前為止，已經(jīng)成功利用雜交種體細(xì)胞建立了雜交鵝掌楸體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)和快速成苗體系，開辟了雜交鵝掌楸產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的新途徑。在雜交鵝掌楸體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系的研究中發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞胚經(jīng)過了球形胚、心形胚、魚雷胚與子葉胚全過程，說明其發(fā)育過程與合子胚的發(fā)育完全相同，而且各個發(fā)育時期體細(xì)胞胚的形狀與合子胚也非常接近。因此，在研究當(dāng)中，利用體胚發(fā)生系統(tǒng)深入研究體細(xì)胞胚發(fā)生與發(fā)育的機制對于揭示細(xì)胞分化、發(fā)育、形態(tài)發(fā)生與胚胎發(fā)生發(fā)育過程等重大理論問題的機制，以及真核細(xì)胞中基因表達(dá)和調(diào)節(jié)控制等具有十分重要的意義。
[0004]植物生長調(diào)節(jié)劑的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)是離體培養(yǎng)條件下體細(xì)胞轉(zhuǎn)化成胚性細(xì)胞的重要誘導(dǎo)因子。其中，生長素是誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生的關(guān)鍵因素。在體細(xì)胞胚的發(fā)生和發(fā)育過程中，生長素的極性運輸和組織中心細(xì)胞與干細(xì)胞的形成起關(guān)鍵作用，它們通過啟動胚性特征基因表達(dá)，最終決定體細(xì)胞原胚的產(chǎn)生，進(jìn)而繼續(xù)發(fā)育形成成熟體細(xì)胞胚。造成這種極性運輸?shù)脑蚴怯捎谠?運輸生長素的細(xì)胞中生長素輸出蛋白在質(zhì)膜上的極性分布所致。很多研究已表明，生長素的運輸?shù)鞍自谥参锏呐吆蟀l(fā)育過程及植物的光形態(tài)建成和組織分化方面也起著非常重要的作用。生長素在植物組織中的極性分布很大程度上歸功于高度調(diào)控、極性定位的輸出載體PINs蛋白。PINs蛋白是生長素的輸出載體，能使生長素從細(xì)胞內(nèi)流出。PINs蛋白家族各成員間存在功能冗余，并受多水平調(diào)節(jié)。在特異組織細(xì)胞中表達(dá)的各種PIN蛋白形成一個具有相同生化功能的PIN蛋白系統(tǒng)，此系統(tǒng)組成一個靈活的生長素分布網(wǎng)，對植物體生長發(fā)育相關(guān)事件作出應(yīng)答。PIN蛋白是決定生長素流方向的基礎(chǔ)，為植物體的各部分和細(xì)胞提供了特異的位置信息和方向信息。所以，PIN蛋白和生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)植物體的生長發(fā)育。
[0005]生長素的極性運輸與植物的許多生長發(fā)育過程密切相關(guān)，但是生長素的調(diào)控機制有很多地方認(rèn)識的都不夠全面。最近幾年，編碼生長素運輸?shù)鞍椎幕虻目寺∈谷藗儗ιL素極性運輸?shù)难芯咳〉昧撕艽蟮倪M(jìn)展。截止目前為止，已經(jīng)從擬南芥中至少克隆出來8個基因，在水稻、玉米等植物中也得到了數(shù)個同源基因。根據(jù)這些基因在序列上的高度保守性說明在不同植物中也許在其生長發(fā)育過程中具有相同的功能。擬南芥中的/ΥΛ7、PIN2、PIN3、PIN4、PIN7已經(jīng)被證實了在植物早期胚胎發(fā)育以及根的向地性、植物的伸長生長以及植物的向性反應(yīng)中都具有一定的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]發(fā)明目的:針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種雜交鵝掌楸LhPim基因。本發(fā)明的另一目的是提供雜交鵝掌楸基因在雜種鵝掌楸育種中的應(yīng)用。
[0007]技術(shù)方案:為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種雜交鵝掌楸基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]所述的雜交鵝掌楸LhPim基因的表達(dá)蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]所述的雜交鵝掌楸LhPim基因在雜交鵝掌楸育種中的應(yīng)用。
[0010]含有雜交鵝掌楸基因的載體或宿主細(xì)胞。
[0011]PINs蛋白是生長素的輸出載體，能使生長素從細(xì)胞內(nèi)流出。在特異組織細(xì)胞中表達(dá)的各種PIN蛋白形成一個具有相同生化功能的PIN蛋白系統(tǒng)，此系統(tǒng)組成一個靈活的生長素分布網(wǎng)，對植物體生長發(fā)育相關(guān)事件作出應(yīng)答。擬南芥與雜交鵝掌楸的基因的過量表達(dá)都導(dǎo)致了植株生長緩慢、發(fā)育推遲。生長素對組織中心細(xì)胞與干細(xì)胞的形成起關(guān)鍵作用，通過啟動胚性特征基因表達(dá)，最終決定體細(xì)胞原胚的產(chǎn)生，進(jìn)而繼續(xù)發(fā)育形成成熟體細(xì)胞胚。繼而在植物的胚后發(fā)育過程及植物的光形態(tài)建成和組織分化方面也有重要的影響。
[0012]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明在建立成熟的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生體系的基礎(chǔ)上，克隆了生長素運輸?shù)鞍谆騆hPIN’3，通過表達(dá)分析，證明了雜交鵝掌楸的LhPIN3基因在雜交鵝掌楸體胚發(fā)生過程中對胚性細(xì)胞發(fā)育和體胚苗生長有較大的影響，其過表達(dá)試mhPIN3的過表達(dá)會影響植株的生長發(fā)育，別\ LhPim的表達(dá)還可以拯救擬南芥中功能完全喪失的突變體，使其恢復(fù)表型，開花并結(jié)出莢果，因此可應(yīng)用于植物體胚發(fā)生、不定根誘導(dǎo)、不定芽的誘導(dǎo)和分化等，具有很好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是雜交鵝掌楸總RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖2 ILhPim基因全長PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖3是雙酶切反應(yīng)結(jié)果的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖4是表達(dá)載體酶切驗證結(jié)果的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖5 ILhPim表達(dá)載體圖；圖6是不同時期的雜交鵝掌楸材料圖；
圖7是基因在不同時期的實時定量結(jié)果圖；
圖8是Tl代種子的篩選結(jié)果圖；
圖9是Tl、T2代陽性植株檢測結(jié)果圖；
圖10是LhPim過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥表型圖；
圖11良LhPIN3mmjvpinl突變體表型圖；
圖12是轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片組織培養(yǎng)表型圖。
【具體實施方式】
[0014]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0015]實施例1
以雜交鵝掌楸為材料，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)成cDNA，設(shè)計相應(yīng)引物進(jìn)行PCR，瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的條帶，與PMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，測序并分析。挑取陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提，加入酶切位點后與載體PBI121同時雙酶切，在T4連接酶的作用下連接后，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，待擬南芥適齡后，通過花器官浸泡轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，觀察Tl，T2代和T3代轉(zhuǎn)基因純合體再生植株表型。
[0016](I)總RNA的提取
以雜交鵝掌楸的側(cè)芽為材料，按照NORGEN試劑盒(Norgen Sioid)的操作步驟進(jìn)行RNA的提取，所使用的試劑和耗材均處理使其無RNA酶。雜交鵝掌楸總RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，條帶清晰；測定總RNA的吸光度，OD26tZOD28tl值為1.96，OD260/OD230為
2.08，可見RNA質(zhì)量較好。
[0017]RNA提取的具體過程為:加入600 μ L Lysis Solution磨樣。將裂解液轉(zhuǎn)移至新管中?；靹?min,使其徹底裂解,12000rpm離心2min,上清移至新管中。加入等體積的70%乙醇，渦旋混勻。將混合液移至柱子中(下接2mL收集管)，離心lmin，倒掉濾液，放回收集管。加入400 μ L Wash Solution，離心lmin，棄濾液，放回收集管。加入DNAI工作液，14000rpm離心lmin,將濾液吸回柱子上,25 °C-30 °C靜置15min。加入400 μ L Wash Solution,14000rpm 離心 lmin,棄濾液。第三次加入 400 μ L Wash Solution, 14000rpm 離心 lmin,棄濾液。將柱子放回收集管，HOOOrpm離心2min，棄收集管。將柱子放入1.7mL管子中加入50 μ L Elution Solution。200~2000rpm 離心 2min, 14000rpm 離心 lmin,體積不足 50 μ L，再用 14000rpm 離心 lmin。
[0018](2)cDNA 的獲得
以所提RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,所使用的是Invitrogen公司的SuperScript?III First-Strand Synthesis Kit。實驗中的RNA使用量為I μ g，具體過程為:1)配置反應(yīng)液(I μ L RNA 5μ g), I μ L Primer (Oligo dT)，I μ L IOmM dNTP mix , DEPC-TreatedWater up to 10 μ L )，短暫低速離心后，65°C 5min,立即置于冰上I~2min。2)向上一步的管中加入相應(yīng)試劑(2μ L 10XRT Buffer,4μ L 25mM MgCl2,2y L 0.1M DTT, I μ L RNaseOUT(40U/y L), I μ L SuperScript III RT)，置于 PCR 儀上，反應(yīng)程序為 50°C 50min,85°C 5min。3)將上一步的反應(yīng)液離心,每管中加入I μ L的RNase H ,37°C 20min。
[0019](3)基因全長的獲得設(shè)計引物，進(jìn)行的克隆。引物如下:
PIN3-F:5’-ATTTACCACCCTTACCCCTCCCCT-3’ ；
PIN3-R:5’-CGTCGATCTACCTCTTTTGGAACT-3’。
[0020]20μ L PCR 擴增體系:2μ L 10XPCR Buffer，。.4μ L IOmM dNTPs，1.2μ L MgSO4(25mM), IuL Forward Primer, IuL Reverse Primer, 2 μ L cDNA, 0.1 μ L Platinum Taq,12.3 μ L ddH20。
[0021]PCR 反應(yīng)條件:94°C,4min ；94 °C, 30s, 58 °C, 30s, 72 °C, 2min ,36 Cycles ；72 °C,IOmin ；4°C, Forever。
[0022]LhPIN3基因全長PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖2所示。
[0023]將上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，使用AXYGEN公司的DNA凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，具體過程為:在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體并切碎。計算凝膠重量(提前記錄1.5mL離心管重量)，該重量作為一個凝膠體積(如IOOmg=IOOmLX加入3個凝膠體積的Buffer DE-A,混合均勻后于75°C加熱，間斷混合(每2~3min)，直至凝膠塊完全熔化(約6~8min)。加1.5個凝膠體積的Buffer DE-B,混合均勻；當(dāng)分離的DNA片段小于400bp時,加入I個凝膠體積的異丙醇。吸取上步中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管(置于2mL離心管)中，12000Xg離心lmin，棄濾液。將制備管重新置回2mL離心管,加500 μ L Buffer Wl, 12000 Xg離心30s，棄濾液。將制備管重新置回2mL離心管，加700 μ L Buffer W2，12000 X g離心30s，棄濾液。以同樣的方法再用700 μ L Buffer W2洗滌一次，12000 Xg離心lmin。將制備管重新置回2mL離心管，12000Xg離心lmin。將制備管置于潔凈的1.5mL離心管中，在DNA制備膜正中央加25^30 μ L ddH20，室溫靜置 lmin。12000 X g 離心 lmin 洗脫 DNA。
[0024]采用TaKaRa pMD19_T Vector (D102A)載體系統(tǒng)進(jìn)行連接反應(yīng)。反應(yīng)體系如下:5 μ L Ligation Buffer, I μ L PMD19-T Vector, 4 μ L PCR純化產(chǎn)物(50ng), dH20 up tolO μ L。用移液器吹打混勻，16°C孵育過夜。
[0025]將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中。具體過程如下:準(zhǔn)備LB/Amp/X-gal/IPTG固體培養(yǎng)基(每板涂濃度為50mg/mL的IPTG溶液和20mg/mL的Χ-gal各40μ1，室溫下放置2-3小時)。從_70°C中取出感受態(tài)細(xì)胞，冰浴中融化。在無菌的1.5mL離心管中加入1~5μL連接產(chǎn)物。取100μL感受態(tài)細(xì)胞與連接產(chǎn)物輕輕混勻，冰浴中放置30min。42°C熱激90秒，然后立即冰浴2min。加入8(Κ)μL LB液體培養(yǎng)基(不含氨芐青霉素)，37°C，IOOrpm振蕩培養(yǎng)
1.5小時。4000rpm離心3分鐘，吸走800μL上清，沉淀在剩余的上清中重懸。取適量涂布于培養(yǎng)基上，37°C倒置培養(yǎng)12~16小時。
[0026]將得到的陽性克隆進(jìn)行測序分析。測序發(fā)現(xiàn)，LhPim基因編碼區(qū)長度為1917bp，序列如SEQ ID N0.1所示，所表達(dá)的蛋白序列如SEQ ID N0.2所示，包括628個氨基酸的開放閱讀框(0RF)。將測序所得到的序列在NCBI上進(jìn)行比對。經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，序列與擬南芥、楊樹等的基因同源性達(dá)到80%以上。
[0027]實施例2基因功能驗證
首先構(gòu)建鵝掌楸表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入擬南芥突變體中，觀察鵝掌楸能否使突變體恢復(fù)表型，比較兩者表型差異，推測鵝掌楸功能；構(gòu)建35S: PIN3表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入擬南芥野生型中，觀察表型，推測鵝掌楸LhPIN3功能。[0028]I)載體的構(gòu)建
本發(fā)明所用大腸桿菌菌株為E.coli JM109 (寶生物工程(大連)有限公司購入)；表達(dá)載體為 pBI 121 (Biovector C0., LTD 公司購入)。
[0029]具體過程如下:
1、通過VHLhPim基因上下游分別添加XbaI和SmaI酶切位點。PCR體系及反應(yīng)條件同全長擴增，引物分別是:
PIN3-F+Xba1:5’-CCCCCGGGGGATTTACCACCCTTACCCCTCCCCT-3’ ；
PIN3-R+Sma1:5’-GCTCTAGAGCCGTCGATCTACCTCTTTTGGAACT-3’ ；
2、使用相應(yīng)的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，得到含有粘性末端的并覆蓋整個ORF的基因片段。用同樣的酶切反應(yīng)處理空的PBI121表達(dá)載體。
[0030]雙酶切反應(yīng)體系如下:
LhPIN3 基因雙酶切體系:2μ L IOXT buffer，0.5μ L Xbal，0.5μ L Smal，2y L
0.1%BSA, I μ g 回收產(chǎn)物，ddH20 up to20 μ L。
[0031]37°C水浴，酶切4h。加入IOX終止液停止酶切反應(yīng)，1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。
[0032]酶切結(jié)果如圖3所 示，根據(jù)條帶大小判斷出PBI121表達(dá)載體和基因已經(jīng)被正確切開。
[0033]用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (AXYGEN)進(jìn)行回收并純化酶切產(chǎn)物，溶于20μ L的TE緩沖液中。
[0034]3、檢測所回收的酶切產(chǎn)物濃度，按連接體系加入各試劑(目的片段分子數(shù):載體分子數(shù)=3:1~5:1)，16°C過夜連接。連接反應(yīng)體系如下:2.5 μ L Τ4 DNA ligase buffer(lOX),
5μ L 酶切的表達(dá)載體，15.5 μ L 酶切的 PCR 產(chǎn)物，2 μ L Τ4 DNA ligase, ddH20 up to25 μ L。
[0035]4、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109超感細(xì)胞，挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜；使用全長引物進(jìn)行菌液PCR，以篩選陽性克隆，之后用AxyPrep PlasmidMiniprepKit(AXYGEN)提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證。同時測序檢測載體構(gòu)建過程中是否發(fā)生突變或者缺失現(xiàn)象。
[0036]酶切驗證結(jié)果如圖4，圖中條帶大小與之前完全相符，說明基因片段已成功插入PBI121 中。
[0037]構(gòu)建完成的表達(dá)載體如圖5所示，從圖中可清楚直觀看出目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因的位置。
[0038]2)實時熒光定量PCR
選取固體培養(yǎng)的愈傷，懸浮培養(yǎng)的單細(xì)胞以及平板誘導(dǎo)的球形胚，子葉胚的材料和體胚苗的根、莖、葉、芽這8個時期進(jìn)行的qRT-PCR，分喻LhPIN3在不同培養(yǎng)條件以及不同生長時期的表達(dá)情況。具體過程如下:
實時定量 PCR 采用 ABI 公司的 Power SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒，在 ABI 7500Real time PCR Systems (Applied Biosystems)上完成，每個樣品反應(yīng)三次重復(fù),數(shù)據(jù)提取分析米用 7500System SDS software (Applied Biosystems)。
[0039]I )RT-PCR引物的設(shè)計:根據(jù)RT-PCR的要求，設(shè)計了 LhPIN3基因的引物，經(jīng)過溶解曲線的分析，最終選擇雜交鵝掌楸中的18SrRNA作為內(nèi)參，引物如下:
PIN3 F-RT:5’-CGTCCCCCTTCTGTCATTCCACTTCATCTC-3’ ；PIN3 R-RT:5’-GATCATCCATTCCAGGCTCCCGTTCCTCGT-3’ ；
2)RT_PCR反應(yīng)體系:10KL 2 X Power SYBR Green PCR Master Mix, IM-L Forward Primer,IM-L Reverse Primer, IM-L cDNA, 7M-L ddH20。
[0040]3) qRT-PCR 反應(yīng)條件:95°C, IOmin ；95°C, 15sec，60。。，lmin ,40 Cycles。
[0041]4)試驗材料:所使用的材料為不同時期的雜交鵝掌楸材料，如圖6所示，1-8依次為胚性愈傷組織，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，體胚誘導(dǎo)一周后的細(xì)胞，30天后的早期子葉胚，體胚苗的根尖(取根系茁壯的根系，從下往上取1-2厘米)，莖(除去最幼嫩的葉子，由葉原基向下取1-2厘米)，葉及側(cè)芽。
[0042]5)試驗結(jié)果:結(jié)果如圖7所示，圖中，廣8所對應(yīng)的時期依次為I胚性愈傷，2懸浮培養(yǎng)的單細(xì)胞，3平板誘導(dǎo)一周的細(xì)胞，4子葉胚，5體 胚苗的根，6體胚苗的莖，7體胚苗的葉子，8體胚苗的側(cè)芽，根據(jù)實時定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因在體胚苗的根中表達(dá)量明顯高于其他部位。在體胚發(fā)生中以及早期子葉胚中的表達(dá)也出現(xiàn)了區(qū)別，這證明基因在雜交鵝掌楸胚性細(xì)胞發(fā)育和體胚苗生長過程中發(fā)揮了重要作用。
[0043](4)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
1、本發(fā)明使用的農(nóng)桿菌菌株為GV3101 ( Biovector C0.，LTD公司購入)。采用的是液氮凍融法將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。具體過程為:冰浴融化GV3101感受態(tài)細(xì)胞，加入至少IOOng回收純化的表達(dá)載體質(zhì)粒,輕輕混勻，冰浴2(T30min。液氮速凍lmin,37°C熱擊3min，迅速置于冰上I~2min。加入800 μ L無抗生素的LB培養(yǎng)基，28°C，200rpm復(fù)蘇3.5h ；4000rpm離心3min,吸掉培養(yǎng)基?；靹蚴Ｓ嗑?，涂抹于添加50mg.L—1卡納霉素的固體LB培基上。28°C倒置培養(yǎng)30~48h。PCR檢測陽性克隆，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0044]2、待種植的健康狀態(tài)的擬南芥生長至開花。將PCR檢測的陽性克隆，搖菌至0D0.8時，進(jìn)行擬南芥花器官浸泡轉(zhuǎn)化。具體過程為:將菌液5000rpm，5min離心，收集菌體，用5%蔗糖溶液懸浮；在浸泡前，加入SilwetL-77，濃度為0.05% (500yL/L);將擬南芥的地上部分在農(nóng)桿菌懸浮溶液中浸泡15~30sec，期間輕輕晃動，將浸過的擬南芥平躺在托盤里，用保鮮膜覆蓋保濕，錫箔紙密封避光24h ;揭開錫箔紙，正常條件下培養(yǎng)，當(dāng)種子成熟時停止?jié)菜?br> (5)轉(zhuǎn)基因植株表型觀察
1、收獲干燥的種子，將Tl代種子用50mg.L-1卡納霉素的1/2MS培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。篩選結(jié)果如圖8所示，圖中可發(fā)現(xiàn)除了陽性植株仍然正常生長，其他的陰性植株無卡納霉素抗性已經(jīng)死亡。
[0045]2、將篩選出的可能的轉(zhuǎn)基因陽性植株移栽到土里繼續(xù)培養(yǎng)。提取轉(zhuǎn)基因擬南芥的總DNA作模板進(jìn)行PCR檢測，確定其為陽性植株。T2代陽性植株檢測方法也相同。檢測結(jié)果如圖9所示，圖中發(fā)現(xiàn)陰性對照無條帶，轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR結(jié)果條帶與陽性對照一致，確定為陽性植株。
[0046]3、分別移栽20棵C0L、20、％LhPIN3過表達(dá)T2植株，生長30天，COL已經(jīng)有17棵抽苔，都有12片蓮座葉，抽苔比率為85%，而LhPim過表達(dá)T2植株僅有2棵抽苔，20棵植株都只有8片蓮座葉，抽苔比率僅為10%。結(jié)果如下表:
【權(quán)利要求】
1.一種雜交鵝掌楸基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的雜交鵝掌楸基因的表達(dá)蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.權(quán)利要求1所述的雜交鵝掌楸基因在雜交鵝掌楸育種中的應(yīng)用。
4.含有雜交 鵝掌楸LhPim基因的載體或宿主細(xì)胞。
【文檔編號】A01H5/00GK104004772SQ201410259910
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】施季森, 袁夢箋, 王鵬凱, 李霞, 陳金慧, 李美平, 陸葉 申請人:南京林業(yè)大學(xué)