一株高產(chǎn)腦苷脂類化合物的雞樅菌菌種及其菌絲體培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)腦苷脂類化合物的雞樅菌菌種Termitomyces?sp.CTM-1，其菌種保藏號是CCTCC?NO：M2014185。本發(fā)明還涉及培養(yǎng)上述的雞樅菌菌種的方法。本發(fā)明通過對雞樅菌菌種的液體培養(yǎng)，可獲得菌絲體干物產(chǎn)量15.90g/L，菌絲體中腦苷脂A和B的含量分別達(dá)到0.29％,d.b.、0.11％,d.b.，含量大大高于野生雞樅菌，可實(shí)現(xiàn)雞樅菌的人工培養(yǎng)以及工業(yè)化生產(chǎn)，克服了野生雞樅菌子實(shí)體資源稀少、采收季節(jié)性強(qiáng)、價格昂貴、腦苷脂A和B含量低等問題。本發(fā)明所涉及的菌種制備和菌絲體培養(yǎng)方式同樣適合于以其他食用菌為原料、通過液體培養(yǎng)生產(chǎn)富含腦苷脂的菌絲體。
【專利說明】一株高產(chǎn)腦苷脂類化合物的雞樅菌菌種及其菌絲體培養(yǎng)方
法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及一株高產(chǎn)腦苷脂類化合物的雞揪菌菌種及其菌絲體培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]疼痛是臨床上最常見的癥狀之一。疼痛困擾著人們的健康和生活質(zhì)量，長期的劇烈疼痛(如癌性疼痛、頑固性疼痛等)是一種難以忍受的折磨。世界上，慢性疼痛的患病率高達(dá)35.5%，美國至少有一億以上的疼痛患者，中國約有2億多的疼痛患者，但是約有85%患者的疼痛并沒有得到及時緩解。目前臨床鎮(zhèn)痛藥存在的問題包括:1麻醉性鎮(zhèn)痛藥和解熱鎮(zhèn)痛藥能減輕患者的痛苦，但仍有為數(shù)不少的疼痛不能得到有效的控制；2目前臨床的鎮(zhèn)痛藥存在不容忽視的副作用一毒性、成癮性、耐受性；3鎮(zhèn)痛藥不僅要減輕和消除疼痛，也需要能保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)，以阻止疼痛應(yīng)激-疼痛病理性反應(yīng)之間形成的惡性循環(huán)；4疼痛的病理機(jī)制復(fù)雜，因此需要研發(fā)多靶點(diǎn)、多效應(yīng)和疊加效應(yīng)的鎮(zhèn)痛藥物。腦苷脂類化合物是單糖或低聚糖與神經(jīng)酰胺末端羥基結(jié)合所形成的苷，是細(xì)胞膜/壁的結(jié)構(gòu)成分。陳玲等(專利申請?zhí)?01210242213.6提供的腦苷類化合物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用，專利申請?zhí)?01310272349.6提供的腦苷類化合物在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用)發(fā)現(xiàn)腦苷脂A和B具有顯著的鎮(zhèn)痛作用。腦苷脂A和B作為新型鎮(zhèn)痛藥物的特點(diǎn)是:對神經(jīng)性疼痛和炎性疼痛的鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)、持續(xù)時間長，無明顯副作用，也沒有藥物成癮和藥物耐受反應(yīng)。此外，腦苷脂A和B通過腹腔注射、口服、皮膚涂抹等途徑給藥，都顯示有明顯的鎮(zhèn)痛作用，生物利用度高達(dá) 46.7%0
[0003] 中國的腦卒中發(fā)病率排名世界第一，比美國高出一倍。我國第三次國民死亡調(diào)查結(jié)果表明，腦卒中已經(jīng)升為中國第一位死亡病因。據(jù)世界衛(wèi)生組織“多國心血管病趨勢和決定因素監(jiān)測”統(tǒng)計，1991~1999年間上海地區(qū)35~74歲年齡組腦卒中平均年發(fā)病率為168.2/10萬，腦卒中發(fā)病率呈上升趨勢。但是，目前沒有腦卒中的有效治療藥。腦苷脂A和B對腦卒中的神經(jīng)細(xì)胞死亡有保護(hù)作用(Chi S，Cai W，Liu P, Zhang Z, Chen X，Gao L, Chen L, QiZ.Baifuzi reduces transient ischemic brain damage through an interaction with theSTREX domain of BKCa channels.Cell Death and Disease, 2011，I (I): el3.PMID: 21364615 ；LiLj Yang R，Sun K，Bai Y，Zhang Z，Zhou L，Qi Z，Qi J，Chen L Cerebroside-A providespotent neuroprotection after cerebral ischemia throughreducing glutamate releaseand Ca2+inf lux of NMDA receptors.The International Journal of Neuropsychopharmacology, 2011，4:1-11.)。腦苷脂A和B能通過血腦屏障，減小缺血后的腦梗塞面積和神經(jīng)細(xì)胞死亡，減輕腦水腫。腦苷脂A和B促進(jìn)腦卒中后運(yùn)動和認(rèn)知功能的恢復(fù)，降低腦卒中的死亡率。由于腦苷脂A和B對神經(jīng)保護(hù)作用的多靶點(diǎn)特性，使得腦苷脂A和B治療腦卒中的有效時間窗> 26小時(專利號ZL200910024861.2提供的一種保護(hù)缺血性腦損傷的白附子脂溶性成分提取物；專利號ZL200910154675.0提供的一種腦苷脂類化合物的應(yīng)用；專利號ZL201110324561.3提供的一種腦苷脂B化合物的應(yīng)用)。因此，腦苷脂A和B治療腦卒中的療效高、特異性強(qiáng)、有效窗口期長、多分子靶點(diǎn)。
[0004]腦苷類化合物存在于動物、植物、真菌和海洋生物。由于全世界瘋牛病的不斷發(fā)生，腦苷類化合物來源需要從動物腦轉(zhuǎn)向植物、食用菌等。雞揪菌是一種肉質(zhì)細(xì)嫩，氣味濃香，味道鮮美，營養(yǎng)豐富的野生珍稀食藥用菌，主要分布于非洲熱帶、亞洲熱帶、南太平洋島嶼和亞洲的亞熱帶地區(qū)，中國只有貴州、云南、四川等省的山區(qū)能夠生長。中國發(fā)明專利(專利號ZL200910154675.0提供的一種腦苷脂類化合物的應(yīng)用)的新工藝能快速、簡便、得率高地從雞揪菌子實(shí)體中提取、分離和純化，獲得純度在99.0 %以上的腦苷脂A和B。但是另一方面，由于雞揪菌與白蟻共生，其子實(shí)體僅能在白蟻巢上生長，至今還沒有實(shí)現(xiàn)雞揪菌子實(shí)體人工培養(yǎng)的產(chǎn)業(yè)化。野生雞揪菌子實(shí)體資源稀少、采收季節(jié)性強(qiáng)、價格昂貴，并且雞揪菌子實(shí)體中腦苷脂A、B的含量僅有百萬分之幾(Qi J H, Ojika M, SakagamiY.Termitomycesphins A-D, novel neuritogenic cerebrosides from the edible Chinesemushroom Termitomyces albuminosus [J].Tetrahedron, 2000, 56:5835-5841)。這些問題是腦苷脂A、B成藥的瓶頸。
[0005]因此，如何實(shí)現(xiàn)人工培養(yǎng)雞揪菌子實(shí)體以提取腦苷脂A和B亟待解決。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)腦苷脂類化合物的雞揪菌菌種，克服野生雞揪菌子實(shí)體中腦苷脂A和B含量較低的問題。
[0007]本發(fā)明的第二目的是提供培養(yǎng)上述富含腦苷脂類化合物的雞揪菌菌種的方法。
[0008]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0009]—、一株高產(chǎn)腦苷脂類化合物的雞揪菌菌種Termitomyces sp.CTM-1,其菌種保藏號是 CCTCC NO:M2014185o
[0010]本發(fā)明的雞揪菌菌種是從野生雞揪菌子實(shí)體中篩選出來的，野生雞揪菌子實(shí)體于2013年8月從云南省紅河州建水縣山區(qū)采集，編號，置于4-10°C冰箱保存。
[0011]將采集到的野生雞揪菌子實(shí)體清洗、消毒，用手術(shù)刀取子實(shí)體的組織，切成約0.1cm3的小塊。將組織塊(共86塊)分別接入裝有斜面培養(yǎng)基的試管，置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-16d，誘發(fā)出各組織的菌絲。斜面培養(yǎng)基按以下方法制備。配方(g/L):馬鈴薯浸出粉15，葡萄糖20，瓊脂20，酵母浸粉2，pH5 ;121°C滅菌20min ;室溫條件下冷卻至約60 °C，倒制斜面。
[0012]選擇從子實(shí)體誘發(fā)出來的3株菌51-SM-2、51-St-1、51-P-3為對象，取100 μ L菌液至平板培養(yǎng)基，用滅菌涂布棒將菌液涂布均勻，于25°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5-6d后,選取邊緣整齊、菌絲濃白的單菌落。純化操作共重復(fù)3次，得到菌株51-Sm-2/P2、51-St-1/P1、51-P-3/P1。平板培養(yǎng)基按以下方法制備。配方(g/L):馬鈴薯浸出粉15，葡萄糖20，瓊脂20，酵母浸粉2，pH5 ;121°C滅菌20min ;室溫條件下冷卻至約60°C，倒平板。
[0013]1、菌體培養(yǎng)
[0014]以菌株51-Sm-2/P2、51-St-1/P1、51-P_3/P1 為對象進(jìn)行菌種篩選。
[0015]盡量選取長勢相同的菌落，用孔徑5mm的無菌打孔器在平板菌落邊緣部打孔，取出直徑為5mm的圓形菌落薄片，接種至新的平板培養(yǎng)基(配方(g/L):馬鈴薯浸出粉15，葡萄糖20，瓊脂20，酵母浸粉2，pH5)。每個菌株接6個平板培養(yǎng)基，每個平板培養(yǎng)基上接3個菌塊。28°C恒溫培養(yǎng)，定期測量菌落直徑，觀察菌落顏色形態(tài)和長勢。
[0016]圖1表示各菌株在平板培養(yǎng)過程中菌落直徑的變化。平板培養(yǎng)27d前，菌株51-Sm-2/P2、51-St-1/P1、51-P-3/P1的菌落直徑無顯著差異。生長后期，菌落生長速度降低，菌株51-Μ-2/Ρ2、51-Τ-1/Ρ1、51-Ρ-3/Ρ1的菌落直徑之間產(chǎn)生差異。表1表示平板培養(yǎng)34d時的菌落直徑比較。菌株51-Sm-2/P2與菌株51-ST-1/P1的菌落直徑無顯著差異，菌株51-P-3/P1的菌落直徑顯著小于菌株51-Sm-2/P2和51_ST_1/P1的菌落直徑(P〈0.05)。
[0017]表1平板培養(yǎng)34d時的菌落直徑比較
【權(quán)利要求】
1.一株高產(chǎn)腦苷脂類化合物的雞揪菌菌種Termitomyces sp.CTM-1,其菌種保藏號是CCTCC NO:M2014185o
2.培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的雞揪菌菌種的方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: (1)取雞揪菌菌絲接種于種子培養(yǎng)基中，28°C、150rpm培養(yǎng)3d，種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，硫酸鎂0.75g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，pH5 ； (2)將種子液按體積比為10%的接種量接入擴(kuò)大培養(yǎng)基中，28°C、150rpm培養(yǎng)6d，擴(kuò)大培養(yǎng)基配方組成為:小麥全粒粉濃度20-40g/L、米糠濃度20-40g/L、培養(yǎng)基pH4.0-6.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:擴(kuò)大培養(yǎng)基配方組成為:小麥全粒粉濃度.32.5g/L、米糠濃 度 31.4g/L、培養(yǎng)基 pH5.0。
【文檔編號】A01G1/04GK104012302SQ201410252645
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月9日
【發(fā)明者】繆冶煉, 花衛(wèi)俊, 陳玲, 袁麗紅 申請人:南京工業(yè)大學(xué), 陳玲