一種降低煙葉中鉻含量的方法
【專利摘要】一種降低煙葉鉻含量的方法，利用在煙草根部寄生印度梨形孢來降低煙草重金屬鉻殘留。所述方法的具體步驟如下:（1）用納米材料氧化鋅代替原Kafer培養(yǎng)基中的ZnSO4·7H2O，在1升培養(yǎng)基中加入納米材料氧化鋅10mg；（2）將活化后的印度梨形孢（Piriformospora?indica）接種于步驟（1）所述的液體Kafer培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后收集菌絲體，制備印度梨形孢菌絲液，接著澆灌于煙苗根部，灌根處理，使印度梨形孢定殖于煙苗根部；（3）經(jīng)印度梨形孢定殖后煙苗移栽到大田，之后進行常規(guī)的水肥管理，使煙草正常生長。本方法可以改善煙草生長狀況，減少重金屬鉻從根系向煙草地上部分的遷移，降低煙葉重金屬鉻殘留，而且易于掌握、成本較低、簡單實用，綠色環(huán)保，不會引起二次污染。
【專利說明】一種降低煙葉中鉻含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物資源的利用和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種降低煙葉鉻含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著化肥、農(nóng)藥的大量施用和工業(yè)的迅速發(fā)展，環(huán)境污染日益嚴重。鉻是一種有毒的重金屬，也是主要的環(huán)境污染物之一。煙草是我國重要的經(jīng)濟作物之一，我國煙草的種植面積、烤煙產(chǎn)量和生產(chǎn)量均居世界首位。近年來，常有煙草重金屬超標等質(zhì)量安全問題的報道，其中鎘、鉻、鉛對煙草生長和品質(zhì)的影響較為嚴重。土壤中的鉻污染造成煙草生長的遲緩和發(fā)育的滯后，降低了煙草中總氮、煙堿、可溶性總糖和還原糖的含量，嚴重影響了煙葉的品質(zhì)(史宏志，劉國順，常思敏，等.煙草重金屬研究現(xiàn)狀及農(nóng)業(yè)減害對策.中國煙草學報，2011，17(3):89-94)。重金屬成為影響我國烤煙品質(zhì)安全性的重要因素之一，2010年10月7日在澳大利亞悉尼召開的第九屆亞太煙草和健康會議上發(fā)布了一項中國與其他國家煙草對比的研究結(jié)果:中國13個牌子的卷煙檢測出鉻等重金屬含量與加拿大的香煙比較，最高超出3倍以上。煙葉中鉻含量超標嚴重影響了煙葉的品質(zhì)，勢必影響到我國煙草產(chǎn)業(yè)的競爭力和健康發(fā)展。因此，如何減少煙葉中鉻積累已經(jīng)成為煙草行業(yè)一個主要的任務(wù)。
[0003]煙草中重金屬主要來自植煙土壤，同時肥料和農(nóng)藥的不規(guī)范也會導致煙草的重金屬含量過高。治理植煙土壤重金屬污染的主要措施有工程措施、物理化學修復、植物修復和根際微生物修復等方法，但上述方法對土壤重金屬污染修復的可操作性、有效性、廣譜性與安全性都有待完善與提高。目前，最常用降低煙草重金屬殘留的措施是施用各種改良劑，如石灰、鈣鎂磷肥、粘土礦物等無機改良劑，以及畜禽糞便等各種有機肥等(胡鐘勝，章鋼婭，王廣志，等.修復劑對煙草吸收污染土壤中砷的改良.土壤，2006，38 (2):200-205 ;周澤慶，招啟柏，朱衛(wèi)星，等.重金屬污染植煙土壤改良劑原位修復研究進展.安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37(11):5100-5102.)。中國發(fā)明專利(CN1017M405A)發(fā)明了一種降低農(nóng)作物鎘、鉛污染的土壤改良劑，主要包含Ca (0H)2、Na2SiO7等無機組分以及稻草秸桿、山毛豆脫落物等有機組分。由于種種原因，這些改良劑的大面積施用往往受到限制，如石灰、粘土礦物對土壤性狀的影響較大，而鈣鎂磷肥、畜禽糞便中往往含有重金屬。因此，提出一種更經(jīng)濟實用的技術(shù)措施用于有效降低煙草重金屬殘留就顯得非常必要。
[0004]中國專利申請201310104049.7公開了里氏木霉聯(lián)合伴礦景天在鎘污染農(nóng)田土壤修復中的應(yīng)用，菌劑使用方法是在伴礦景天幼苗根際施加里氏木霉FSlO-C發(fā)酵液或微生物制劑；中國專利申請201210137704公開了一種利用叢枝菌根修復重金屬污染土壤的方法，菌種使用方法是將叢枝菌根接種于稗草根部。上述兩項專利是用生物菌種來提高寄主吸收土壤中重金屬的能力，隨后移除寄主植物，完成重金屬污染土壤的修復。這類方法能夠降低土壤中的重金屬含量，但同時也降低了耕地的復種指數(shù)，且如何處理寄主植物也是生產(chǎn)實際中的難題。中國專利申請20121007120和201010525189均公開了一種利用叢枝菌根真菌降低煙草重金屬殘留的方法，叢枝菌根真菌和煙草形成叢枝菌根共生體，促進煙草生長，降低煙草重金屬殘留。然而叢枝菌根真菌不能在人工合成的培養(yǎng)基上生長，不利于該菌的大規(guī)模推廣應(yīng)用。
[0005]印度梨形孢是一種根部內(nèi)生真菌，具有廣泛的寄主范圍，能促進植物生長，提高寄主對生物和非生物脅迫的抗性，并能在合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)，為該菌在農(nóng)業(yè)和園藝業(yè)的大面積應(yīng)用提供了可能(樓兵干，孫超，蔡大廣.印度梨形孢的多種功能及其應(yīng)用前景.植物保護學報.2007, 34(6):653-656).因此，通過開發(fā)利用印度梨形孢，在不影響煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的前提下降低煙葉中重金屬含量，尤其是鉻的含量，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種降低煙葉中鎘含量的方法，利用生物方法降低煙葉中重金屬鉻殘留。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0008]一種降低煙葉中鉻含量的方法，利用在煙草根部寄生印度梨形孢來降低煙草重金屬絡(luò)殘留。
[0009]進一步的，所述降低煙葉鉻含量的方法具體包括以下步驟:
[0010](I)印度梨形孢培養(yǎng)基的配制:
[0011]用粒徑為30nm的納米材料氧化鋅代替原Kafer培養(yǎng)基中的ZnSO4.7Η20，在I升培養(yǎng)基中加入納米材料氧化鋅IOmg,所述新配置的Kafer培養(yǎng)基中每升含有:2.0Og蛋白胨，1.0Og 酵母提取物，Ig 水解酪蛋白，0.6gNaN03，0.52gKCl，0.52gMgS04.7H20,1.52gKH2P04，IOmgZnO, IOmgH3BO3, 5mgMnS04.H2O, 1.6mgCoCl.5H20,1.6mgCuS04.5H20,1.1mg(NH4)6MO7O24,
1.3mgFeS04,1.8mgEDTA, 0.1mg 硫胺素,0.04mg 甘氨酸，0.01mg 煙酸和 0.01mg 吡卩多醇；
[0012](2)印度梨形孢菌絲液灌根處理煙苗根部
[0013]將活化后的印度梨形孢接種于步驟(1)所述的液體Kafer培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，然后收集菌絲體，制備印度梨形孢菌絲液，澆灌于煙苗根部，進行灌根處理，使印度梨形孢定殖于煙苗根部；
[0014](3)煙草苗的移栽和后期的管理
[0015]經(jīng)印度梨形孢定殖后的煙草苗進行移栽，之后進行常規(guī)的水肥管理，使煙苗正常生長。
[0016]進一步的，所述步驟(2)中印度梨形孢的培養(yǎng)條件為25V -28°CU00rpm-120rpm搖床避光培養(yǎng)，5-7d后過濾,收集菌絲體,用蒸懼水配成濃度為2g/L-4g/L的菌絲液。
[0017]進一步的，步驟(2)中印度梨形孢菌絲液處理煙草苗的方式為:將印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部；或?qū)⒂《壤嫘捂呔z液加入煙草育苗器對煙草進行育苗；或用印度梨形孢菌絲液對煙草種子進行種子包衣，還可以用印度梨形孢菌絲液對煙草苗進行沾根處理。
[0018]進一步的，步驟(2)中用印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部時每棵苗澆灌的印度梨形孢菌絲液量為50mL。
[0019]進一步的，步驟(2)中煙苗為4葉期時用印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部。
[0020]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為:
[0021]1、與現(xiàn)有技術(shù)中叢枝菌根真菌相比，本發(fā)明的印度梨形孢可在培養(yǎng)基上生長，應(yīng)用方便；且能夠改善煙草的營養(yǎng)狀況，具有生物肥料的功能，促進煙草的生長，減少化肥的使用。
[0022]2、本發(fā)明采用粒徑為30nm的納米材料氧化鋅代替原Kafer培養(yǎng)基中的ZnSO4.7H20，在I升培養(yǎng)基中加入納米材料氧化鋅10mg，在含納米材料ZnO (30nm) 0.01mg/L的Kafer培養(yǎng)基培養(yǎng)的印度梨形孢，其在煙草根部的定殖率顯著提高，由原來的80.0%提高到95.0%，能顯著地提高煙草生物量，促進煙草的生長，降低重金屬從根系向煙草地上部分的遷移，從而降低煙草重金屬鉻殘留。試驗證實使用本發(fā)明方法能顯著的降低成熟煙葉中鉻含量，使水培、盆栽和大田成熟煙葉中鉻的含量分別下降31.4-54.2%,27.9-41.3%、32.9-55.3%。
[0023]3、本發(fā)明降低煙草中重金屬殘留的方法易于掌握、成本較低、簡單實用，綠色環(huán)保，不會引起二次污染；它不僅適用于重金屬污染土壤中煙草的種植，對于非污染土壤也可使用。
[0024]4、本發(fā)明中印度梨形孢菌絲液的使用方法多樣，可以將印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部，還可以加入煙草育苗器對煙草進行育苗，還可以用印度梨形孢菌絲液對煙草種子進行種子包衣，還可以對煙草苗進行沾根處理。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明方案做進一步詳細說明:
[0026]一種降低煙葉中鉻含量的方法，利用在煙草根部寄生印度梨形孢來降低煙草重金屬鉻殘留，本發(fā)明印度梨形孢由印度愛德大學Ajit Varma教授惠贈。
[0027]進一步的，所述降低煙葉鉻含量的方法具體包括以下步驟:
[0028]( I)印度梨形孢培養(yǎng)基的配制: [0029]用粒徑為30nm的納米材料氧化鋅代替原Kafer培養(yǎng)基中的ZnSO4.7Η20，在I升培養(yǎng)基中加入納米材料氧化鋅IOmg,所述新配置的Kafer培養(yǎng)基中每升含有:2.0Og蛋白胨，1.0Og 酵母提取物，Ig 水解酪蛋白，0.6gNaN03，0.52gKCl，0.52gMgS04.7H20,1.52gKH2P04，IOmgZnO, IOmgH3BO3, 5mgMnS04.H2O, 1.6mgCoCl.5H20,1.6mgCuS04.5H20,1.1mg(NH4)6MO7O24,1.3mgFeS04,1.8mgEDTA, 0.1mg 硫胺素,0.04mg 甘氨酸，0.01mg 煙酸和 0.01mg 吡卩多醇；
[0030](2)印度梨形孢菌絲液灌根處理煙苗根部
[0031]將活化后的印度梨形孢接種于步驟(1)所述的液體Kafer培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，然后收集菌絲體，制備印度梨形孢菌絲液，澆灌于煙苗根部，進行灌根處理，使印度梨形孢定殖于煙苗根部；
[0032](3)煙草苗的移栽和后期的管理
[0033]經(jīng)印度梨形孢定殖后的煙草苗進行移栽，之后進行常規(guī)的水肥管理，使煙苗正常生長。
[0034]進一步的，所述步驟(2)中印度梨形孢的培養(yǎng)條件為25V -28°CU00rpm-120rpm搖床避光培養(yǎng)，5-7d后過濾,收集菌絲體,用蒸懼水配成濃度為2g/L-4g/L的菌絲液。
[0035]進一步的，步驟(2)中印度梨形孢菌絲液處理煙草苗的方式為:將印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部；或?qū)⒂《壤嫘捂呔z液加入煙草育苗器對煙草進行育苗；或用印度梨形孢菌絲液對煙草種子進行種子包衣，還可以用印度梨形孢菌絲液對煙草苗進行沾根處理。
[0036]進一步的，步驟(2)中用印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部時每棵苗澆灌的印度梨形孢菌絲液量為50mL。
[0037]進一步的，步驟(2)中煙苗為4葉期時用印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部。
[0038]實施例1
[0039]利用印度梨形孢降低水培煙草重金屬鉻殘留，包括如下步驟:
[0040]菌種的活化:將保存在冰箱里的印度梨形孢菌種接種于Kafer培養(yǎng)基(KM)平板上，置于28°C恒溫箱里避光培養(yǎng)7天。用直徑為5mm的打孔器在活化好的印度梨形孢菌落邊緣打孔。
[0041 ] 菌液的培養(yǎng):配制液體Kafer培養(yǎng)基和含納米材料ZnO (30nm) 0.0I g/L的液體Kafer培養(yǎng)基(即以粒徑為30nm的納米材料ZnO代替ZnS04)，用250mL三角錐形瓶分裝，每瓶裝150mL培養(yǎng)基，滅菌備用。在無菌條件下，將印度梨形孢菌絲塊加入裝有上述培養(yǎng)基的三角錐形瓶中，每瓶6塊菌絲塊；置于恒溫搖床120rpm、28°C避光振蕩培養(yǎng)5_7天。
[0042]菌絲體的收集:錐形瓶中菌絲置于250mL離心瓶中，8000rpm離心20min，去上清，收集菌絲體，置于4°C保存，備用；
[0043]煙苗的準備:將煙草種子消毒后播撒在孔穴育苗盤中，待種子出苗后間苗，每孔留苗I棵，進行正常水肥管理。
[0044]菌絲液澆灌到秧苗根部:用水將印度梨形孢菌絲配成含菌絲濃度為4g/L的菌絲液，將菌絲液澆灌于4葉期煙苗根部，設(shè)2個處理 與I個對照。處理I為含納米材料ZnO (30nm)的液體Kafer培養(yǎng)基培養(yǎng)的印度梨形孢菌絲液，處理2為普通液體Kafer培養(yǎng)基培養(yǎng)的印度梨形孢菌絲液，對照澆灌相同體積的水。
[0045]菌絲液澆灌后15天，通過臺盼藍染色顯微鏡下觀察檢測印度梨形孢在煙苗根部的定殖情況，結(jié)果顯示處理I的定殖率為93%，處理2的定殖率為81%，結(jié)果表明含納米材料Zn0(30nm)的液體Kafer培養(yǎng)基培養(yǎng)的印度梨形孢菌絲在煙苗根部的定殖率明顯提高。
[0046](I)將煙苗移至塑料桶中進行水培:挑選處理I和對照中長勢一致的煙苗移栽至塑料桶(容積為4L)中，桶內(nèi)裝有鉻濃度為含5.0mg/L的Hoagland營養(yǎng)液4L，每桶培養(yǎng)煙苗4株，對照和處理各3桶。
[0047]測定煙葉中的鉻含量:水培后2周取樣(最大葉)，測定鉻元素含量，結(jié)果是處理組煙葉鉻含量比對照降低了 43.1% (表1)。
[0048]表1鉻處理2周接種與未接種印度梨形孢的水培煙葉中鉻含量
[0049]絡(luò)濃度對照或處鉻今量比對照鉻今量比對照
【權(quán)利要求】
1.一種降低煙葉中鉻含量的方法，其特征在于，利用在煙草根部寄生印度梨形孢來降低煙草重金屬鉻殘留。
2.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述降低煙葉鉻含量的方法具體包括以下步驟: (O印度梨形孢培養(yǎng)基的配制: 用粒徑為30nm的納米材料氧化鋅代替原Kafer培養(yǎng)基中的ZnSO4.7H20，在I升培養(yǎng)基中加入納米材料氧化鋅IOmg,所述新配置的Kafer培養(yǎng)基中每升含有:2.0Og蛋白胨，1.0Og 酵母提取物，Ig 水解酪蛋白，0.6gNaN03，0.52gKCl，0.52gMgS04.7H20，1.52gKH2P04，IOmgZnO, IOmgH3BO3, 5mgMnS04.H2O, 1.6mgCoCl.5H20,1.6mgCuS04.5H20,1.1mg(NH4)6MO7O24,1.3mgFeS04,1.8mgEDTA, 0.1mg 硫胺素,0.04mg 甘氨酸，0.01mg 煙酸和 0.01mg 吡卩多醇； (2)印度梨形孢菌絲液灌根處理煙苗根部 將活化后的印度梨形孢接種于步驟(1)所述的液體Kafer培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，然后收集菌絲體，制備印度梨形孢菌絲液，澆灌于煙苗根部，進行灌根處理，使印度梨形孢定殖于煙苗根部； (3)煙草苗的移栽和后期的管理 經(jīng)印度梨形孢定殖后的煙草苗進行移栽，之后進行常規(guī)的水肥管理，使煙苗正常生長。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中印度梨形孢的培養(yǎng)條件為25°C -28°C、100rpm-120rpm搖床避光培養(yǎng),5_7d后過濾,收集菌絲體，用蒸懼水配成濃度為2g/L-4g/L的菌絲液。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征`在于，步驟(2)中印度梨形孢菌絲液處理煙草苗的方式為:將印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部；或?qū)⒂《壤嫘捂呔z液加入煙草育苗器對煙草進行育苗；或用印度梨形孢菌絲液對煙草種子進行種子包衣，或用印度梨形孢菌絲液對煙草苗進行沾根處理。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)中用印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部時每棵苗澆灌的印度梨形孢菌絲液量為50mL。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)中煙苗為4葉期時用印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部。
【文檔編號】A01G7/06GK103875398SQ201410092267
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】聶長春, 劉劍, 劉孜, 王玉平, 萬里興, 萬強, 樓兵干, 惠非瓊, 劉曉曦, 高其康, 林福呈 申請人:貴州中煙工業(yè)有限責任公司