一種含中性蛋白酶的禽用酶及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種含中性蛋白酶的禽用酶及其制備方法，屬于酶制劑制備【技術領域】。所述禽用酶以枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物、酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶、中草藥提取物、保護劑、激活劑科學復配而成，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物可提高動物機體免疫力、促進免疫器官的發(fā)育、促進動物腸道結構和機能的成熟、提高動物日增重和改善飼料轉化率。本發(fā)明的禽用酶為禽類提供了安全消化酶，有效減輕了消化負擔，提高了原料利用率和生長率，保護了環(huán)境，同時適量的激活劑可在同等條件下充分發(fā)揮酶制劑的效力，節(jié)約酶制劑添加量，中草藥提取物科學復配既延長復合酶制劑的保質期，又可提高飼養(yǎng)畜禽的免疫力。
【專利說明】一種含中性蛋白酶的禽用酶及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于酶制劑制備【技術領域】，具體是一種含中性蛋白酶的禽用酶及其制備方法。
【背景技術】
[0002]在飼料中添加酶制劑主要有以下4個理由:1.降解在動物飼料中存在的抗營養(yǎng)因子。這些物質不能被動物內源酶降解，從而干擾動物的正常代謝，導致動物消化不良，生產性能下降。2.提高淀粉、蛋白質和礦物質的利用率。這些物質或者被富含纖維的細胞壁包圍，或者以某些不能被動物消化的結構形式存在(例如在植物飼料原料中，大量的磷以植酸磷的形式存在。)。3.在原料中降解某些特定的化學鍵。這些化學鍵不能被動物自身的酶所降解，加入外源酶以后可以釋放更多的營養(yǎng)物。4.由于幼齡動物自身消化系統(tǒng)還不成熟，內源酶不足添加外源酶可以提高飼料消化率，防止出現(xiàn)消化不良癥狀。除了可以提高日糧的利用率以外，加酶還可以減少飼料原料之間的差異，提高飼料配方的精確性，同時還可以提高動物生長的整齊性，減少管理成本，提高經濟效益。使用酶制劑還可以保護環(huán)境。由于飼料的利用率提高了，相應的糞便排放量下降了。在效果比較明顯的情況下，糞便的排放量可以減少20%左右，豬糞中氮的排放下降15%左右，雞糞中氮的排放下降20%。對于植酸磷，可以大幅度減少磷對環(huán)境的污染。
[0003]目前在飼料工業(yè)中應用的酶制劑主要有4大類:分別用來降解纖維素、蛋白質、淀粉和植酸。
[0004]纖維降解酶:對于單胃動物來說，消化的最大阻力是不能產生降解纖維的酶，在含有小麥、大麥、燕麥等組分的日糧中，很大一部分纖維是阿拉伯木聚糖和β—葡聚糖。水溶性的纖維能提高小腸內容物的粘度，阻礙養(yǎng)分的吸收，從而降低動物的生長性能。同時這種狀況還和一些由于消化不良引起的疾病有關。如豬的性欲減退、禽的黑趾癥和小豬拉稀。由于品種、生長地點和氣候條件等因素的影響，大麥和小麥中纖維含量的變化很大，導致含有這些組分的日糧的營養(yǎng)價值差異很大。纖維降解酶、木聚糖酶和β—葡聚糖可以減少這些差異，提高動物的生長性能和整齊度。同時還可以減少某些消化不良的疾病。
[0005]蛋白降解酶:在動物日糧中蛋白質來自各種詞料原料，它們最終通過降解的氣基酸存積在瘦肉中。在單胃動物日糧中，添加蛋白酶(不同飼料原料蛋白質和品質和可利用性)除了能充分降解大部分儲蛋白質或儲藏蛋白質或為動物可利用的小分子肽外，還能夠通過降解抗營養(yǎng)因素而改善飼料營養(yǎng)價值。存積的效率差異很大。在植物蛋白源，如豆餅粉中存在著一些抗營養(yǎng)因子，如幾鞣質和胰蛋白酶抑制因子，可能會對小腸吸收表面造成損害，影響營養(yǎng)物的吸收。另外，幼齡動物不完善的消化體系使得植物蛋白(如豆餅粉)中的蛋白質不能得到很好的利用。
[0006]淀粉降解酶:許多營養(yǎng)學家認為玉米是飼料原料的"黃金標準"。絕大數(shù)營養(yǎng)學家認為玉米不存在消化不良性，消化率超過95%，但是最近Noy和Sklan研究表明(1994年)在理想狀態(tài)下，4一 12日齡的肉雞日糧中，淀粉的消化率很少超過85%，添加淀粉酶可以使淀粉在小腸得到更多更快的降解。在仔豬斷奶期，由于營養(yǎng)、環(huán)境和免疫系統(tǒng)的變化，體重會下降。在日糧中添加淀粉酶和其他一些酶，可以增加動物內源消化酶分泌，進而改進營養(yǎng)的消化吸收，提高飼料轉化率和動物生長率。
[0007]植酸降解酶:對于所有的動物來說，磷對于骨骼的礦化、免疫、繁殖、生長都是至關重要的。豬和家禽單胃動物只能里利用植物飼料中30— 40%的磷，其余60— 70%的植酸磷事故無法利用的。在許多情況下，飼料日糧中必須補充無機磷來滿足動物生長的需要。飼料中一半以上的磷隨著糞便排放到環(huán)境中，污染環(huán)境。添加植酸酶可以降解植酸，釋放植酸分子中的磷。這樣可以產生2個益處:1.減少了飼料中磷的添加量。2.減少了禽類糞便對環(huán)境的磷污染。
[0008]顯而易見:作為飼料酶種的四大主角，他們的作用機理和模式在很大程度決定或推動了動物飼料產業(yè)對于酶制劑技術的吸收運用。目前在肉雞料中添加酶的產出投入比例超過2:1。相對而言，在養(yǎng)豬業(yè)領域，酶制劑的使用情況就比較復雜，顯得不明朗。集約化程度低，涉及環(huán)節(jié)比較多，酶制劑的使用效果很難進行商業(yè)計算。盡管在20世紀50年代已經有了使用酶制劑的設想，但是直到20世紀80年代才開始懂得如何在飼料工業(yè)中發(fā)揮酶的力量。飼料谷物，如小麥和大麥都含有比較高的單胃動物不能利用的纖維。如果纖維能夠被降解，動物就能更好地利用營養(yǎng)物。在歐洲，大麥比較便宜，禽類營養(yǎng)學家和酶學家投入了大量精力研究了在含有大麥的肉雞日糧中添加β—葡聚糖酶以減少其負面影響的可能性。其結果被證明是成功的，并得到了一個黃金定律:大麥+β—葡聚糖酶=小麥。受到上述成功的鼓舞，小麥是第二個的研究對象。理論假設是:小麥+木聚糖酶=玉米。這一步的研究也獲得了成功。在20世紀90年代中期，酶在飼料工業(yè)得到了普遍認可。可以毫不夸張地說:1996年，在歐洲80%的肉雞料(粘性谷物為能量來源)中含有纖維降解酶。由此強化和加快飼料產業(yè)對新技術的應用。從全球范圍來看，大約65%的含有能產生粘性谷物的家禽飼料添加了纖維降解酶。而在豬飼料中的應用比例要低得多，接近10%。其主要原因是市場的結構比較復雜，市場呈多元化，甚至無法測算。從地理分布來看，使用纖維素降解酶的地區(qū)主要集中在粘性谷物作為主要能量飼料的產區(qū)，例如:歐洲、加拿大、澳大利亞和新西蘭。另外，在美國、南美和亞太地區(qū)，使用情況取決于玉米和小麥之間的比價。從這個意義上講，歐洲是使用降解纖維素酶的核心細分市場。為了獲得全球的認可，飼用酶廠家必須大舉進軍以玉米一豆柏型日糧為主的北美和亞太地區(qū)。玉米一豆柏型日糧歷來被看作是"黃金標準"，盡管許多營養(yǎng)學家認為這些原料的變動性要比原來設想的變動性要大得多?，F(xiàn)在，越來越多的證據(jù)表明這種黃金日糧也可以通過酶而改善其生產性能，盡管這類日糧與粗纖維或粘度相關的問題不嚴重。過去10年在研發(fā)玉米-豆柏第一代飼料酶上耗費很多，并于1996年開始成功應用，初期應用結果五花八門，但業(yè)界正開始變得越來越明白如何才能得心應手，加酶技術獲得最大經濟回報。據(jù)估算，該部分飼料酶市場份額為2千萬美元，實際在使用玉米-豆柏日糧的肉雞飼料只有5%為加酶飼料。1999/2000年一降低粘度和粗纖維為日糧的飼料酶市場價值超過I億美元。目前，植酸酶已經得到了全球的承認和應用。植酸酶的市場份額大約是每年5000萬美元，在全球約有8.0%左右的豬禽飼料添加植酸酶。除了經濟利益的原因外，還有一個因素是減少了糞中植酸磷的含量有利于保護環(huán)境。
[0009]綜上所述，禽用酶的應用有著其廣闊的市場空間和巨大的經濟價值，但禽用酶的熱穩(wěn)定性、安全性、復配全面性及作用效果的充分發(fā)揮仍是酶制劑生產廠家和廣大養(yǎng)殖戶共同關注的一個重要問題，制備更安全，更全面，酶作用效果更好的禽用酶是本行業(yè)技術人員的共同責任和追求。
【發(fā)明內容】
[0010]本發(fā)明所解決的技術問題是以含高酶活力、作用條件寬泛、穩(wěn)定性強的中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物為基礎，并科學復配中草藥提取物、保護劑、激活劑和其它食品級飼料酶，制得的含中性蛋白酶的禽用酶，不但為飼養(yǎng)禽類提供了安全、全面的消化酶，減輕消化負擔，提高原料利用率和生長率，有效保護環(huán)境，同時適量的激活劑可在同等條件下充分發(fā)揮酶制劑的效力，物盡其用，節(jié)約酶制劑添加量，中草藥提取物的科學復配既可延長復合酶制劑的保質期，又可提高飼養(yǎng)禽類的免疫力，從而達到一酶多用的效果。
[0011]為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案:
[0012]一種含中性蛋白酶的禽用酶，由以下重量份數(shù)的酶制劑組成:
[0013]枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物30-40份，酸性木聚糖酶40-60份，酸性蛋白酶20_30份，植酸酶20-30份，β -葡聚糖酶15-20份，纖維素酶10-15份，淀粉酶10-15份，果膠酶5_10份，中草藥提取物10-15份，保護劑10-15份，激活劑10-15份。
[0014]所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β -葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶均為食品級酶制劑；
[0015]所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物由產強熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的菌株枯草芽孢桿菌1398-2-12經液體深層發(fā)酵制備，其成分主要包括中性蛋白酶和枯草芽孢桿菌菌體；
[0016]所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法如下:
[0017]枯草芽孢桿菌1398-2-12經斜面菌種活化和逐級擴大培養(yǎng)(包括一、二、三級種子培養(yǎng)以及一級種子罐培養(yǎng))獲得液體種子；將液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度30-36°C，攪拌速度200-700rpm，通風量(V/V) 1:1-3,培養(yǎng)時間10_15h ;然后以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至
2-5°C，此時，將液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10_15°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;繼續(xù)以1-2°C /h升溫速率緩慢升溫至30-36°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;發(fā)酵液經孔徑10-1000 μ m過濾紙板粗濾，然后于10_20°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量20-40%濃縮液；濃縮液經真空冷凍干燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物。
[0018]所述斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3-10g，氯化鈉5_12g，蛋白胨10_20g，葡萄糖 2-5g, (NH)2S043-5g，K2HP046_8g，CaCl2l_3g，瓊脂 15_20g，中草藥粉劑 5-10g,蒸餾水IOOOmL, pH 值 7.0-7.2，121°C滅菌 20min ；
[0019]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0020]以重量份數(shù)計，稱取黃芪20-30份；黨參10-18份；柴胡10-15份；黃芩10-15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C?90°C保持2?4h，然后降溫至45-60°C，加入混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)PH值為5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C?78°C保持3?4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0021]所述混合酶添加量為混合物料總重量的5_10%。[0022]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5_10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
[0023]所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1-1.5。
[0024]所述一、二、三級種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0025]酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，中草藥粉劑1.5-2%，海藻糖1-3%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉
0.1-0.3%，不足部分純凈水補足，pH 值 7.0-7.2，121_123°C滅菌 30_40min。
[0026]所述一級種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0027]麥芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草藥粉劑1.5-2%,海藻糖1-3%,蛋白胨
0.1-0.5%，玉米漿 0.1-0.5%，磷酸氫二鉀 0.8-1.5%，硫酸鎂 0.05-0.1%，檸檬酸鈉 0.1-0.5%，不足部分純凈水補足，pH值7.0-7.2，121-123°C滅菌30_40min。
[0028]所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0x108-8.0xlO8個/ml ；
[0029]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆餅粉15_25g，中草藥粉劑30-50g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，檸檬酸鈉l_5g，消泡劑0.Ι-lg,純凈水lOOOmL，pH值7.0-7.2，121°C滅菌 20min ；
[0030]所述補料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15_25%，中草藥粉劑5-10%，不足部分純凈水補足，pH值7.0-7.2，121_123°C滅菌30_40min。
[0031]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調配方法為:
[0032]按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節(jié)PH值7.0-7.2，加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫15-30min，然后緩慢升溫至90°C保溫15_30min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調初始PH7.0-7.2，121-123°C滅菌30_40min備用。
[0033]所述中草藥提取物的制備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C?90°C保持2?4h，然后降溫至45-600C，加入混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)pH值為5.5-6.8，酶解2_4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C?78°C保持3?4h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥獲得中草藥提取物。
[0034]所述中草藥的重量份數(shù)組成為:沙棘20-30份，決明子20-30份，枸杞10_15份，山藥10-15份，北沙參5-10份，黃荊子5-10份，玉竹3-5份，薏米3_5份，大麥芽3_5份，桂花
3-5份，黃芪3-5份；
[0035]所述混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ；
[0036]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5_10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份；
[0037]所述保護劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖20-30份，NaC120_30份，(NH4)2S0410-15 份，半胱氨酸 10-15 份。
[0038]所述激活劑是由如下質量組份的無機鹽均勻混合而成:氯化鋅30-40份，氯化鈣10-20份，硫酸鈉10-20份，氯化鎂5-10份。
[0039]本發(fā)明含中性蛋白酶的禽用酶的制備方法:
[0040]將所述保護劑、中草藥提取物分別超微粉碎，確保粒度小于其它酶制劑，然后與枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物、酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶均勻混合，最后加入激活劑，混合均勻后密封包裝即得成品含中性蛋白酶的禽用酶。
[0041]所述禽用酶適用于飼料加工廠和養(yǎng)殖場自配飼料，使用時應與飼料中的其它原料混合均勻，可事先將本發(fā)明與少量飼料混合均勻，再混合到大批飼料中，直接飼喂。建議每噸全價料添加量為:100-120g ；
[0042]本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌1398-2-12是由實驗室保藏的一株產中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)1398_2經紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變篩選獲得。
[0043]本發(fā)明提供的產強熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的菌株具體為枯草芽孢桿菌1398-2-12。該菌株已于2013年11月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山武漢大學生命科學學院郵編:430072)，保藏號為CCTCC NO: M2013539，分類命名為:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 1398-2-12。
[0044]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 1398-2-12菌株特點如下:
[0045]所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，邊緣整齊，為具有運動性的好氧菌。鏡檢為長桿狀，革蘭氏染色呈陽性。該菌可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、V-P實驗呈陽性。
[0046]本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌1398-2-12具有所產中性蛋白酶耐受溫度高、適用pH值范圍寬泛的特點，發(fā)酵液粗酶液75°C酶活完全穩(wěn)定，最適反應溫度70°C，pH值4.5-8.5酶活穩(wěn)定，最適反應pH值7.2。該菌株最適生長PH值7.0-7.2，最適生長溫度30-36°C，最適產酶溫度32-35 °C。
[0047]按誘變篩選方案，對突變株逐級篩選淘汰，最后對優(yōu)良菌株經發(fā)酵性能測試篩選，得到一株產強熱穩(wěn)定性中性蛋白酶的菌株枯草芽孢桿菌菌1398-2-12，發(fā)酵液中性蛋白酶酶活可達5500-7000U/mL，對酶的熱穩(wěn)定性進行了分析，將粗酶液分別置于40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C下，每隔 10 分鐘取樣測定酶活。40°C、45°C、50°C、55°C下，60分鐘酶活沒有下降。60°C與65°C下，30分鐘降到原有酶活的95%，60分鐘降到85%。70°C下，30分鐘降到原有酶活的85%，60分鐘降到80%。75°C下，30分鐘降到原有酶活的80%,60分鐘降到70%。
[0048]有益效果:
[0049]1.本發(fā)明枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物發(fā)酵液中含有的中性蛋白酶酶活可達5500-7000U/mL，在40-70°C之間具有較高的酶活，最適反應溫度為70°C;在pH值為4.5-8.5時酶活完全穩(wěn)定，最適反應pH值為7.2 ;該酶在70°C條件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活，75°C條件下保存Ih后保持70%以上酶活。比現(xiàn)有的中性蛋白酶熱穩(wěn)定性強，酶活力較高，酶作用最適PH值范圍寬泛，儲存穩(wěn)定性高，更加適合飼養(yǎng)禽類飼料的添加。
[0050]2.本發(fā)明枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物中的枯草芽孢桿菌菌體可提高動物機體免疫力、促進免疫器官的發(fā)育、促進動物腸道結構和機能的成熟、提高動物日增重和改善飼料轉化率，更加適合飼養(yǎng)禽類飼料的添加。
[0051]3.本發(fā)明含中性蛋白酶的禽用酶中的保護劑采用多糖、無機鹽和氨基酸科學復配，有效減緩了復合酶制劑的回潮；同時可增強復合酶的耐凍、耐熱性能，保持相同的酶活力，其耐熱溫度可提高20-30°C，耐冷凍溫度可降低10-15°C，有效防止了復合酶在運輸、保存和使用過程中酶活力的損失，延長了復合酶的保質期，達到同樣的酶活力，比同類產品保質期可延長2-3年。
[0052]4.本發(fā)明含中性蛋白酶的禽用酶添加無機鹽作為激活劑，創(chuàng)造了酶催化作用的最佳條件，充分發(fā)揮了復合酶各酶組份的活力，徹底有效的分解了飼料中淀粉、蛋白質、纖維素、植酸等大分子物質，大大減輕了禽類動物的消化負擔，提高了原料利用率和禽類的生長率，同時有效防止了禽類糞便造成的環(huán)境污染，保護了飼養(yǎng)環(huán)境。
[0053]5.本發(fā)明含中性蛋白酶的禽用酶添加的中草藥提取物既可延長復合酶制劑的保質期，又可提高飼養(yǎng)禽類的免疫力，有效防止禽類流行性疾病的發(fā)生。
[0054]6.本發(fā)明含中性蛋白酶的禽用酶中枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物、保護劑、激活劑、中草藥提取物與酶制劑的協(xié)同作用，使得復合酶的酶活力和效力最大限度的發(fā)揮，并相應的提高了飼料的利用率和動物的生長率，增強了動物的食欲和抗病能力，延長了復合酶的保質期和保護了環(huán)境。
【具體實施方式】
[0055]下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發(fā)明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0056]實施例1
[0057]一種含中性蛋白酶的禽用酶，由以下重量份數(shù)的酶制劑組成:
[0058]枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物35份，酸性木聚糖酶50份，酸性蛋白酶25份，植酸酶25份，β -葡聚糖酶17份，纖維素酶12份，淀粉酶12份，果膠酶8份，中草藥提取物12份，保護劑12份，激活劑12份。
[0059]所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β -葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶均為食品級酶制劑；
[0060]所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法包括如下步驟:
[0061](I)將保存完好的枯草芽孢桿菌1398-2-12的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)24h進行菌種活化，如此活化2次；
[0062]所述斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3g，氯化鈉5g，蛋白胨10g，葡萄糖2g，(NH)2S043g,K2HP046g, CaCl2Ig,瓊脂 15g，中草藥粉劑 5g，蒸餾水 IOOOmL, pH 值 7.0,121°C滅菌 20min ；
[0063]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0064]以重量份數(shù)計，稱取黃芪20份；黨參10份；柴胡10份；黃芩10份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3倍重量的水，控制溫度70°C保持2h，然后降溫至45°C，加入混合物料總重量5%的混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)pH值為5.5，酶解2h，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1，控制溫度至60°C保持3h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0065]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內葡聚糖酶10份，外葡聚糖酶10份，β -葡萄糖苷酶10份，木聚糖酶15份，戊聚糖酶15份，普魯蘭酶20份，β -淀粉酶10份，中性蛋白酶10份,酸性蛋白酶10份,超氧化物歧化酶5份,葡萄糖氧化酶5份,酸性磷酸酶5份。
[0066](2)液體種子擴大培養(yǎng)
[0067]①一級種子培養(yǎng):將步驟(I)活化后的斜面菌種I環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間IOh ；
[0068]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0069]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000暈升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間IOh ；
[0070]④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度200rpm，通風量(V/V) 1:1,罐壓0.05Mpa,培養(yǎng)時間IOh ；
[0071]所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0072]酵母粉0.3%，葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，牛肉膏0.5%，磷酸氫二鉀0.8%，中草藥粉劑
1.5%，海藻糖1%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.1%，不足部分純凈水補足，pH值7.0,121°C滅菌 30min。
[0073]所述一級種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0074]麥芽糊精5%，酵母粉0.4%，中草藥粉劑1.5%，海藻糖1%，蛋白胨0.1%，玉米漿
0.1%，磷酸氫二鉀0.8%，硫酸鎂0.05%,檸檬酸鈉0.1%，不足部分純凈水補足，pH值7.0，121°C 滅菌 30min。
[0075]所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0xlO8個/ml ；
[0076](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0077]將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度200r/m，通風量(V/V)l:l，培養(yǎng)時間IOh ;然后以1°C /h降溫速率緩慢降溫至10°C，恒溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)以1°C /h降溫速率緩慢降溫至2°C，此時，將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20h ;最后以1°C /h升溫速率緩慢升溫至10°C，恒溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)以1°C /h升溫速率緩慢升溫至30°C，恒溫培養(yǎng)15h ；
[0078]溶解氧控制:通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧15% ；
[0079]pH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過程中pH值保持在7.0 ；
[0080]補料控制:添加補料培養(yǎng)基，以維持發(fā)酵液還原糖含量為2_5mg/ml ；
[0081 ] 放罐標準:60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。
[0082]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50g，玉米粉50g，豆餅粉15g，中草藥粉劑30g，海藻糖30g，酵母粉4g，玉米漿lg，硫酸銨lg，磷酸氫二鉀lg，磷酸二氫鉀lg，檸檬酸鈉lg，消泡劑 0.1g,純凈水 IOOOmL, pH 值 7.0,121°C滅菌 20min ；
[0083]所述補料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，中草藥粉劑5%，不足部分純凈水補足，pH值7.0，121°C滅菌30min。
[0084]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調配方法為:
[0085]按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節(jié)PH值7.0，加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫15min，然后緩慢升溫至90°C保溫15min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調初始ρΗ7.0,121°C滅菌30min備用。
[0086](4)發(fā)酵液經孔徑10 μ m過濾紙板粗濾，然后于10°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量為20%濃縮液；濃縮液經真空冷凍干燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物。
[0087]所述中草藥提取物的制備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，然后降溫至53°C，加入混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)PH值為6.2，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至69°C保持4h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥獲得中草藥提取物。
[0088]所述中草藥的重量份數(shù)組成為:沙棘25份，決明子25份，枸杞17份，山藥13份，北沙參8份，黃荊子7份，玉竹4份，薏米4份，大麥芽4份，桂花4份，黃芪4份；
[0089]混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ；
[0090]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內β -葡聚糖酶15份，外β -葡聚糖酶15份，β -葡萄糖苷酶13份，木聚糖酶13份，戊聚糖酶13份，普魯蘭酶25份，β -淀粉酶12份，中性蛋白酶13份，酸性蛋白酶13份，超氧化物歧化酶7份，葡萄糖氧化酶7份，酸性磷酸酶7份;
[0091]所述保護劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖25份，NaC125份，(NH4) 2S0413份，半胱氨酸12份。
[0092]所述激活劑是由如下質量組份的無機鹽均勻混合而成:氯化鋅35份，氯化鈣15份，硫酸鈉15份，氯化鎂7份。
[0093]含中性蛋白酶的禽用酶的制備方法:
[0094]將所述保護劑、中草藥提取物分別超微粉碎，確保粒度小于其它酶制劑，然后與枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物、酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶均勻混合，最后加入激活劑，混合均勻后密封包裝即得成品含中性蛋白酶的禽用酶。
[0095]實施例2:
[0096]一種含中性蛋白酶的禽用酶，由以下重量份數(shù)的酶制劑組成:
[0097]枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物30份，酸性木聚糖酶40份，酸性蛋白酶20份，植酸酶20份，β -葡聚糖酶15份，纖維素酶10份，淀粉酶10份，果膠酶5份，中草藥提取物10份，保護劑10份，激活劑10份。
[0098]所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β -葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶均為食品級酶制劑；
[0099]所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法包括如下步驟:
[0100](I)菌種活化[0101]將保存完好的枯草芽孢桿菌1398-2-12的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，33°C培養(yǎng)30h進行菌種活化，如此活化2次；
[0102]所述斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏6g，氯化鈉8g，蛋白胨15g，葡萄糖4g，(NH)2S044g,K2HP047g, CaCl22g，瓊脂 18g，中草藥粉劑 8g，蒸餾水 IOOOmL, pH 值 7.2，121°C滅菌 20min ；
[0103]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0104]以重量份數(shù)計，稱取黃芪25份；黨參16份；柴胡12份；黃芩12份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，然后降溫至50°C，加入混合物料總重量8%的混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)pH值為6.0，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1.2，控制溫度至70°C保持4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0105]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內葡聚糖酶15份，外葡聚糖酶15份，β -葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普魯蘭酶25份，β -淀粉酶12份，中性蛋白酶12份，酸性蛋白酶12份，超氧化物歧化酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份。
[0106](2)液體種子擴大培養(yǎng)
[0107]①一級種子培養(yǎng):將步驟(I)活化后的斜面菌種2環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養(yǎng)溫度33°C，培養(yǎng)時間12h ；
[0108]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0109]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000暈升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養(yǎng)溫度33°C，培養(yǎng)時間12h ；
[0110]④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度33 °C，攪拌速度300rpm，通風量(V/V) 1: 1.5，罐壓
0.05Mpa,培養(yǎng)時間15h ；
[0111]所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0112]酵母粉0.4%，葡萄糖1.2%，蛋白胨0.4%，牛肉膏0.6%，磷酸氫二鉀1.0%，中草藥粉劑1.8%，海藻糖2%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.2%，不足部分純凈水補足，pH值7.2，121°C 滅菌 30min。
[0113]所述一級種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0114]麥芽糊精10%，酵母粉0.5%，中草藥粉劑1.8%，海藻糖2%，蛋白胨0.2%，玉米漿
0.3%，磷酸氫二鉀1.0%，硫酸鎂0.08%,檸檬酸鈉0.3%，不足部分純凈水補足，pH值7.2，121°C 滅菌 30min。
[0115]所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.5xl08個/ml ；
[0116](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0117]將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度35°C，攪拌速度400r/m，通風量(V/V)l:2，培養(yǎng)時間12h ;然后以2V /h降溫速率緩慢降溫至12°C，恒溫培養(yǎng)18h ;繼續(xù)以2V /h降溫速率緩慢降溫至4°C，此時，將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)25h ;最后以2°C /h升溫速率緩慢升溫至12°C，恒溫培養(yǎng)18h ;繼續(xù)以2°C /h升溫速率緩慢升溫至33 °C，恒溫培養(yǎng)18h ；
[0118]溶解氧控制:通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧20% ；
[0119]pH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過程中pH值保持在7.2 ；
[0120]補料控制:添加補料培養(yǎng)基，以維持發(fā)酵液還原糖含量為2_5mg/ml ；
[0121]放罐標準:60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。
[0122]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精100g，玉米粉55g，豆餅粉20g，中草藥粉劑40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉3g，消泡劑 0.5g,純凈水 1000mL, pH 值 7.2，121°C 滅菌 20min ；
[0123]所述補料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精25%，玉米粉15%，豆粉20%，中草藥粉劑8%，不足部分純凈水補足，pH值7.2，121°C滅菌30min。
[0124]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調配方法為:
[0125]按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節(jié)PH值7.2，加入中溫淀粉酶(311/^玉米粉)與高溫淀粉酶(3011/^玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫20min，然后緩慢升溫至90°C保溫20min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調初始ρΗ7.2，121°C滅菌30min備用。[0126](4)發(fā)酵液經孔徑500 μ m過濾紙板粗濾，然后于15°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量為30%濃縮液；濃縮液經真空冷凍干燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物。
[0127]所述中草藥提取物的制備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3倍重量的水，控制溫度70°C保持2h，然后降溫至45°C，加入混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)pH值為5.5，酶解2h，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C保持3h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥獲得中草藥提取物。
[0128]所述中草藥的重量份數(shù)組成為:沙棘20份，決明子20份，枸杞10份，山藥10份，北沙參5份，黃荊子5份，玉竹3份，薏米3份，大麥芽3份，桂花3份，黃芪3份；
[0129]混合酶添加量為混合物料總重量的5% ；
[0130]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內葡聚糖酶10份，外β-葡聚糖酶10份，β -葡萄糖苷酶10份，木聚糖酶15份，戊聚糖酶15份，普魯蘭酶20份，β -淀粉酶10份，中性蛋白酶10份,酸性蛋白酶10份,超氧化物歧化酶5份,葡萄糖氧化酶5份,酸性磷酸酶5份；
[0131]所述保護劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖20份，NaC120份，(NH4) 2S0410份，半胱氨酸10份。
[0132]所述激活劑是由如下質量組份的無機鹽均勻混合而成:氯化鋅30份，氯化鈣10份，硫酸鈉10份，氯化鎂5份。
[0133]含中性蛋白酶的禽用酶的制備方法如實施例1。
[0134]實施例3:
[0135]一種含中性蛋白酶的禽用酶，由以下重量份數(shù)的酶制劑組成:
[0136]枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物40份，酸性木聚糖酶60份，酸性蛋白酶30份，植酸酶30份，β -葡聚糖酶20份，纖維素酶15份，淀粉酶15份，果膠酶10份，中草藥提取物15份，保護劑15份，激活劑15份。[0137]所述酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β -葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶均為食品級酶制劑；
[0138]所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法包括如下步驟:
[0139](I)菌種活化
[0140]將保存完好的枯草芽孢桿菌1398-2-12的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，36°C培養(yǎng)36h進行菌種活化，如此活化3次；
[0141]所述斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏10g，氯化鈉12g，蛋白胨20g，葡萄糖5g, (NH)2S045g, K2HP048g, CaCl23g，瓊脂 20g,中草藥粉劑 IOg,蒸餾水 IOOOmL, pH 值 7.2，121°C 滅菌 20min ；
[0142]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0143]以重量份數(shù)計，稱取黃芪30份；黨參18份；柴胡15份；黃芩15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加6倍重量的水，控制溫度90°C保持4h，然后降溫至60°C，加入混合物料總重量10%的混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)pH值為6.8，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1.5，控制溫度至78°C保持4h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0144]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶20份，β -葡萄糖苷酶15份，木聚糖酶20份，戊聚糖酶20份，普魯蘭酶30份，β -淀粉酶15份，中性蛋白酶15份，酸性蛋白酶15份，超氧化物歧化酶10份，葡萄糖氧化酶10份，酸性磷酸酶10份。
[0145](2)液體種子擴大培養(yǎng)
[0146]①一級種子培養(yǎng):將步驟(I)活化后的斜面菌種2環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養(yǎng)溫度36°C，培養(yǎng)時間15h ；
[0147]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0148]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000暈升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養(yǎng)溫度36°C，培養(yǎng)時間15h ；
[0149]④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度36°C，攪拌速度400rpm，通風量(V/V) 1:2,罐壓0.05Mpa,培養(yǎng)時間20h ；
[0150]所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0151]酵母粉0.5%，葡萄糖1.5%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.8%，磷酸氫二鉀1.5%，中草藥粉劑2%，海藻糖3%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.3%，不足部分純凈水補足，pH值7.2，123°C滅菌 40min。
[0152]所述一級種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0153]麥芽糊精15%，酵母0.8%，中草藥粉劑2%，海藻糖3%，蛋白胨0.5%，玉米漿0.5%，磷酸氫二鉀1.5%，硫酸鎂0.1%，檸檬酸鈉0.5%，不足部分純凈水補足，pH值7.2，123°C滅菌40mino
[0154]所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為8.0xlO8個/ml ；[0155](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0156]將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度36°C，攪拌速度700r/m，通風量(V/V)l:3，培養(yǎng)時間15h ;然后以2V /h降溫速率緩慢降溫至15°C，恒溫培養(yǎng)20h ;繼續(xù)以2V /h降溫速率緩慢降溫至5°C，此時，將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)30h ;最后以2°C /h升溫速率緩慢升溫至15°C，恒溫培養(yǎng)20h ;繼續(xù)以2V /h升溫速率緩慢升溫至36°C，恒溫培養(yǎng)20h ；
[0157]溶解氧控制:通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧30% ；
[0158]pH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過程中pH值保持在7.2 ；
[0159]補料控制:添加補料培養(yǎng)基，以維持發(fā)酵液還原糖含量為2_5mg/ml ；
[0160]放罐標準:60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢。
[0161 ] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精150g，玉米粉60g，豆餅粉25g，中草藥粉劑50g，海藻糖40g，酵母粉Sg，玉米漿5g，硫酸銨3g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉5g，消泡劑Ig,純凈水1000mL, pH值7.2，121°C滅菌20min ；
[0162]所述補料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精30%，玉米粉20%，豆粉25%，中草藥粉劑10%,不足部分純凈水補足，pH值7.2，123°C滅菌40min。
[0163]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調配方法為:
[0164]按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節(jié)PH值7.2，加入中溫淀粉酶(311/^ 玉米粉)與高溫淀粉酶(3011/^玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至70°C保溫30min，然后緩慢升溫至90°C保溫30min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調初始ρΗ7.2，123°C滅菌40min備用。
[0165](4)發(fā)酵液經孔徑1000 μ m過濾紙板粗濾，然后于20°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量為40%濃縮液；濃縮液經真空冷凍干燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物。
[0166]所述中草藥提取物的制備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加6倍重量的水，控制溫度90°C保持4h，然后降溫至60°C，加入混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)pH值為6.8，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至78°C保持4h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥獲得中草藥提取物。
[0167]所述中草藥的重量份數(shù)組成為:沙棘30份，決明子30份，枸杞15份，山藥15份，北沙參10份，黃荊子10份，玉竹5份，薏米5份，大麥芽5份，桂花5份，黃芪5份；
[0168]混合酶添加量為混合物料總重量的10%;
[0169]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶20份，β -葡萄糖苷酶15份，木聚糖酶20份，戊聚糖酶20份，普魯蘭酶30份，β -淀粉酶15份，中性蛋白酶15份，酸性蛋白酶15份，超氧化物歧化酶10份，葡萄糖氧化酶10份，酸性磷酸酶10份；
[0170]所述保護劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖30份，NaC130份，(NH4) 2S0415份，半胱氨酸15份。
[0171]所述激活劑是由如下質量組份的無機鹽均勻混合而成:氯化鋅40份，氯化鈣20份，硫酸鈉20份，氯化鎂10份。
[0172]含中性蛋白酶的禽用酶的制備方法如實施例1。[0173]實施例4本發(fā)明實施例1禽用酶的使用效果試驗
[0174]1.飼料種類:全價國標蛋雞料；
[0175]2.禽用酶添加量:每噸飼料添加120g ；
[0176]3.禽用酶試驗組設計:禽用酶重量份數(shù)組成分為試驗組、對照組1、對照組2 ;其中試驗組為本發(fā)明實施例1制備的禽用酶；對照組I為試驗組組份中除了枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的其余組份；對照組2是市售的小麥日糧酶并且其包含的各酶種類、酶活力和酶重量份數(shù)與試驗組和對照組I相同；各試驗組的具體重量份數(shù)組成如表1
[0177]表1
[0178]
【權利要求】
1.一種含中性蛋白酶的禽用酶，由以下重量份數(shù)的酶制劑組成:枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物30-40份，酸性木聚糖酶40-60份，酸性蛋白酶20-30份，植酸酶20-30份，β -葡聚糖酶15-20份，纖維素酶10-15份，淀粉酶10-15份，果膠酶5_10份，中草藥提取物10-15份，保護劑10-15份，激活劑10-15份； 所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法如下:枯草芽孢桿菌CCTCC NO: M 2013539經斜面菌種活化和一、二、三級種子培養(yǎng)及一級種子罐培養(yǎng)逐級擴大培養(yǎng)得到種子液；將液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度30-36°C，攪拌速度200-700rpm，通風量(V/V)l:l-3，培養(yǎng)時間10_15h ;然后以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15_20h ;繼續(xù)以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C，此時，將液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15_20h ;繼續(xù)以1-2°C /h升溫速率緩慢升溫至30-36°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;發(fā)酵液經孔徑10-1000 μ m過濾紙板粗濾，然后于10-20°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量為20-40%濃縮液；濃縮液經真空冷凍干燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物； 所述保護劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖20-30份，NaC120-30份，(NH4) 2S0410-15 份，半胱氨酸 10-15 份； 所述激活劑是由如下質量組份的無機鹽均勻混合而成:氯化鋅30-40份，氯化鈣10-20份，硫酸鈉10-20份，氯化鎂5-10份。
2.如權利要求1所述的一種含中性蛋白酶的禽用酶，其特征在于，制備枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3-10g，氯化鈉5-12g，蛋白胨10-20g，葡萄糖 2-5g, (NH)2S043-5g，K2HP046_8g，CaCl2l_3g，瓊脂 15_20g，中草藥粉劑 5-10g,蒸餾水1000mL, pH 值 7.0-7.2，121°C滅菌 20min。
3.如權利要求1所述的一種含中性蛋白酶的禽用酶，其特征在于，制備枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的種子培養(yǎng)基組成為:酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，中草藥粉劑1.5-2%，海藻糖1-3%,硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.1-0.3%，不足部分純凈水補足，pH值7.0-7.2，121_123°C滅菌30_40min。
4.如權利要求1所述的一種含中性蛋白酶的禽用酶，其特征在于，制備枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的種子罐培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草藥粉劑1.5-2%，海藻糖1_3%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米漿0.1-0.5%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，硫酸鎂0.05-0.1%，檸檬酸鈉0.1-0.5%，不足部分純凈水補足，pH值7.0-7.2，121_123°C滅菌30_40min。
5.如權利要求1所述的一種含中性蛋白酶的禽用酶，其特征在于，制備枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物時種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0x108-8.0xlO8個/ml。
6.如權利要求1所述的一種含中性蛋白酶的禽用酶，其特征在于，制備枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆餅粉15-25g，中草藥粉劑30-50g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，檸檬酸鈉l_5g，消泡劑0.Ι-lg,純凈水lOOOmL，pH值7.0-7.2，121°C滅菌20mino
7.一種含中性蛋白酶的禽用酶的制備方法，其特征在于，將保護劑、中草藥提取物分別超微粉碎，確保粒度小于其它酶制劑，然后與枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物、酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、β_葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶均勻混合，最后加入激活劑，混合均勻后密封包裝即得成品含中性蛋白酶的禽用酶。
8.如權利要求7所述的一種含中性蛋白酶的禽用酶的制備方法，其特征在于，所述含中性蛋白酶的禽用酶由以下重量份數(shù)的酶制劑組成:枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物30-40份，酸性木聚糖酶40-60份，酸性蛋白酶20-30份，植酸酶20-30份，β -葡聚糖酶15-20份，纖維素酶10-15份，淀粉酶10-15份，果膠酶5-10份，中草藥提取物10-15份，保護劑10-15份，激活劑10-15份； 所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法如下:枯草芽孢桿菌1398-2-12經斜面菌種活化和一、二、三級種子培養(yǎng)及一級種子罐培養(yǎng)逐級擴大培養(yǎng)得到種子液；將液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度30-36°C，攪拌速度200-700rpm，通風量(V/V) 1:1-3，培養(yǎng)時間10-15h ;然后以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15_20h ;繼續(xù)以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C，此時，將液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20-30h ;最后以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)15_20h ;繼續(xù)以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至30-36°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;發(fā)酵液經孔徑10-1000 μ m過濾紙板粗濾，然后于10-20°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量為20-40%濃縮液；濃縮液經真空冷凍干燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物； 所述保護劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖20-30份，NaC120-30份，(NH4) 2S0410-15 份，半胱氨酸 10-15 份； 所述激活劑是由如下質量組份的無機鹽均勻混合而成:氯化鋅30-40份，氯化鈣10-20份，硫酸鈉10-20份，氯化鎂5-10份。
9.如權利要求8所述的一種含中性蛋白酶的禽用酶的制備方法，其特征在于，所述中草藥提取物的制備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，然后降溫至45_60°C，加入混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)·PH值為5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至60°C~78°C保持3~4h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥獲得中草藥提取物； 所述中草藥的重量份數(shù)組成為:沙棘20-30份，決明子20-30份，枸杞10-15份，山藥10-15份，北沙參5-10份，黃荊子5-10份，玉竹3-5份，薏米3_5份，大麥芽3_5份，桂花3_5份，黃芪3-5份； 所述混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ； 所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5_10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
10.如權利要求8所述的一種含中性蛋白酶的禽用酶的制備方法，其特征在于，所述含中性蛋白酶的禽用酶，由以下重量份數(shù)的酶制劑組成:枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物35份，酸性木聚糖酶50份，酸性蛋白酶25份，植酸酶25份，β -葡聚糖酶17份，纖維素酶12份，淀粉酶12份，果膠酶8份，中草藥提取物12份，保護劑12份，激活劑12份； 所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法包括如下步驟: (I)將保存完好的枯草芽孢桿菌1398-2-12的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)24h進行菌種活化，如此活化2次； 所述斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3g，氯化鈉5g，蛋白胨10g，葡萄糖2g，(NH)2S043g,K2HP046g, CaCl2Ig,瓊脂 15g，中草藥粉劑 5g，蒸餾水 1000mL, pH 值 7.0,121°C滅菌 20min ；所述中草藥粉劑的制備方法如下: 以重量份數(shù)計，稱取黃芪20份；黨參10份；柴胡10份；黃芩10份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3倍重量的水，控制溫度70°C保持2h，然后降溫至45°C，加入混合物料總重量5%的混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)pH值為5.5，酶解2h，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的質量比例為1:1，控制溫度至60°C保持3h，過濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑；所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內β -葡聚糖酶10份，外β -葡聚糖酶10份，β -葡萄糖苷酶10份，木聚糖酶15份，戊聚糖酶15份，普魯蘭酶20份，β -淀粉酶10份，中性蛋白酶10份，酸性蛋白酶10份，超氧化物歧化酶5份，葡萄糖氧化酶5份，酸性磷酸酶5份； (2)液體種子擴大培養(yǎng) ①一級種子培養(yǎng):將步驟(1)活化后的斜面菌種I環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間IOh ； ②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同； ③三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間IOh ； ④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度200rpm，通風量(V/V)l:l，罐壓0.05Mpa，培養(yǎng)時間IOh ； 所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量組成為: 酵母粉0.3%，葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，牛肉膏0.5%，磷酸氫二鉀0.8%，中草藥粉劑.1.5%，海藻糖1%，硫酸鈣0.1%,氯化鎂0.2%,檸檬酸鈉0.1%，不足部分純凈水補足，pH值.7.0,121°C滅菌 30min ； 所述一級種子罐培養(yǎng)基重量組成為: 麥芽糊精5%，酵母粉0.4%，中草藥粉劑1.5%，海藻糖1%，蛋白胨0.1%，玉米漿0.1%，磷酸氫二鉀0.8%，硫酸鎂0.05%，檸檬酸鈉0.1%，不足部分純凈水補足，pH值7.0,121°C滅菌30min ； 所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0xlO8個/ml ； (3)發(fā)酵罐發(fā)酵 將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度200r/m，通風量(V/V)l:l，培養(yǎng)時間IOh ;然后以1°C /h降溫速率緩慢降溫至10°C，恒溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)以1°C /h降溫速率緩慢降溫至2°C，此時，將步驟(2)中一級種子罐發(fā)酵液以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)20h ;最后以1°C /h升溫速率緩慢升溫至10°C，恒溫培養(yǎng)15h ;繼續(xù)以1°C /h升溫速率緩慢升溫至30°C，恒溫培養(yǎng)15h ； 溶解氧控制:通過調整攪拌轉速及通風量，控制溶解氧15% ； pH控制:通過補氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過程中pH值保持在7.0 ；補料控制:添加補料培養(yǎng)基，以維持發(fā)酵液還原糖含量為2-5mg/ml ； 放罐標準:60-80%菌體衰老自溶，酶活力增長緩慢； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50g，玉米粉50g，豆餅粉15g，中草藥粉劑30g，海藻糖30g，酵母粉4g，玉米漿lg，硫酸銨lg，磷酸氫二鉀lg，磷酸二氫鉀lg，檸檬酸鈉lg，消泡劑 0.1g,純凈水 1000mL, pH 值 7.0,121°C滅菌 20min ； 所述補料培養(yǎng)基重量組成為:麥芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，中草藥粉劑5%，不足部分純凈水補足，pH值7.0，121。。滅菌30min ； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的調配方法為: 按比例準確稱取原料，將原料中的純凈水、玉米粉、豆餅粉投入配料罐中，調節(jié)PH值.7.0，加入中溫淀粉酶(3u/g玉米粉)與高溫淀粉酶(30u/g玉米粉)，同時邊攪拌邊升溫至.70°C保溫15min，然后緩慢升溫至90°C保溫15min進行液化，最后加入其它原料，攪拌均勻，調初始ρΗ7.0,121°C滅菌30min備用； (4)發(fā)酵液經孔徑IOym過濾紙板粗濾，然后于10°C循環(huán)超濾濃縮去除水分得固形物含量為20%濃縮液；濃縮液經真空冷凍干燥、超微粉碎得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物； 所述中草藥提取物的制備方法為:分別將中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，然后降溫至53°C，加入混合酶制劑進行酶解，用乳酸調節(jié)PH值為6.2，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至69°C保持4h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥獲得中草藥提取物； 所述中草藥的重量份數(shù)組成為:沙棘25份，決明子25份，枸杞17份，山藥13份，北沙參8份，黃荊子7份，玉竹4份，薏米4份，大麥芽4份，桂花4份，黃芪4份； 混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ；所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內葡聚糖酶15份，外β-葡聚糖酶15份，β-葡萄糖苷酶13份，木聚糖酶13份，戊聚糖酶13份，普魯蘭酶25份，β -淀粉酶12份，中性蛋白酶13份，酸性蛋白酶13份，超氧化物歧化酶7份，葡萄糖氧化酶7份，酸性磷酸酶7份；所述保護劑由以下重量份數(shù)的原料組成:海藻糖25份，NaC125份，(NH4) 2S0413份，半胱氨酸12份； 所述激活劑是由如下質量組份的無機鹽均勻混合而成:氯化鋅35份，氯化鈣15份，硫酸鈉15份，氯化鎂7份； 含中性蛋白酶的禽用酶的制備方法: 將所述保護劑、中草藥提取物分別超微粉碎，確保粒度小于其它酶制劑，然后與枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物、酸性木聚糖酶、酸性蛋白酶、植酸酶、葡聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶均勻混合，最后加入激活劑，混合均勻后密封包裝即得成品含中性蛋白酶的禽用酶。
【文檔編號】A23K1/16GK103704486SQ201310733063
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月27日 優(yōu)先權日:2013年12月27日
【發(fā)明者】李洪兵, 朱永明, 易繼云, 劉波, 樊淳紅 申請人:湖南鴻鷹生物科技有限公司