一種昆蟲病原線蟲復壯的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種昆蟲病原線蟲復壯的方法，步驟如下：（1）應用大蠟螟活體擴繁昆蟲病原線蟲，并收集其侵染期幼蟲，得到線蟲懸浮液；（2）確定一塊有昆蟲病原線蟲寄主昆蟲分布，但無昆蟲病原線蟲分布的地塊，將擴繁收集得到的線蟲懸浮液噴施到田間；（3）在上述地塊采集土樣，利用大蠟螟誘集線蟲，獲得復壯后的昆蟲病原線蟲。本發(fā)明可以有效的將昆蟲病原線蟲復壯，使其致病力恢復到自然系統(tǒng)中的真實狀態(tài)：復壯后的昆蟲病原線蟲對大蠟螟的致病力是侵染4d后，死亡率為100%，與當初剛剛誘集分離得到時對大蠟螟的致病力一致；而未復壯的線蟲對大蠟螟的致病力是侵染4d后，死亡率為80.0%。
【專利說明】一種昆蟲病原線蟲復壯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種昆蟲病原線蟲復壯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]昆蟲病原線蟲是指體內(nèi)攜帶有具有病原性的共生細菌，因而能引起昆蟲致病的一類線蟲。作為控制害蟲的手段，昆蟲病原線蟲較化學防治有明顯的優(yōu)勢，近年來的研究表明:昆蟲病原線蟲無污染，對環(huán)境和人類安全，可以大量使用，而且它們既可以主動發(fā)現(xiàn)寄主，也可以被動接觸寄主，已被證實，對靶標昆蟲進行控制時，昆蟲病原線蟲的防效要優(yōu)于化學農(nóng)藥。昆蟲病原線蟲的另一優(yōu)點是可以在寄主體內(nèi)大量繁殖，因此，新繁殖的侵染線蟲可以侵染更多的寄主昆蟲。因此，昆蟲病原線蟲將成為生物防治中的主要手段，可以預計昆蟲病原線蟲在未來的農(nóng)業(yè)害蟲生物生態(tài)控制系統(tǒng)中將會發(fā)揮重要的作用。
[0003]昆蟲病原線蟲推廣應用的前提是篩選出致病力較高的種類或品系，所以昆蟲病原線蟲對靶標昆蟲的致病力測定是開展昆蟲病原線蟲應用研究的基礎。昆蟲病原線蟲致病力的高低主要是通過其侵染期線蟲對靶標昆蟲的防治效果來反映，供試線蟲一般情況下都是經(jīng)過利用大蠟螟活體擴繁復壯的侵染期幼蟲，但是由于室內(nèi)擴繁代數(shù)和保存時間的遞增，侵染期線蟲的致病力會下降，不能很好的應用其開展昆蟲病原線蟲應用研究。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種昆蟲病原線蟲復壯的方法，應用本發(fā)明的方法可以 有效的將昆蟲病原線蟲復壯，使其致病力恢復到自然系統(tǒng)中的真實狀態(tài)，為致病力測定的準確性提供了保障。
[0005]本發(fā)明提供一種昆蟲病原線蟲復壯的方法，步驟如下:
1)應用大蠟螟活體擴繁昆蟲病原線蟲，并收集其侵染期幼蟲，得到線蟲懸浮液；
2)確定一塊有昆蟲病原線蟲寄主昆蟲分布，但無昆蟲病原線蟲分布的地塊，將擴繁收集得到的線蟲懸浮液噴施到田間；
3)在上述地塊采集土樣，利用大蠟螟誘集線蟲，獲得復壯后的昆蟲病原線蟲。
[0006]優(yōu)選地，步驟(2)中，所述線蟲懸浮液以10000-15000頭/m2的濃度噴施。
[0007]此濃度范圍便于線蟲寄生寄主昆蟲，并易于收集。
[0008]更優(yōu)選地，步驟(2)中，所述線蟲懸浮液以10000頭/m2的濃度噴施。
[0009]優(yōu)選地，步驟(3)中，經(jīng)過三個月后，在上述地塊采集土樣。
[0010]優(yōu)選地，所述采集土樣采取多點采樣法。
[0011]優(yōu)選地，步驟(3)中，所述利用大蠟螟誘集線蟲是將大蠟螟老熟幼蟲放入瓶中，加入采集的土樣,使大蠟螟充分接觸昆蟲病原線蟲,將表現(xiàn)為受線蟲侵染癥狀的死亡大蠟螟老熟幼蟲單頭放入線蟲收集盤上收集昆蟲病原線蟲。
[0012]優(yōu)選地，所述使大蠟螟充分接觸昆蟲病原線蟲的方法是每天翻動瓶，使大蠟螟在土中上下爬動。[0013]優(yōu)選地，所述線蟲收集盤里為質(zhì)量百分濃度為0.1%的甲醛溶液。
[0014]昆蟲病原線蟲復壯是其致病力研究的前提和關(guān)鍵步驟，有效的復壯是其致病力測定準確性的保障，本發(fā)明可以有效的將昆蟲病原線蟲復壯，使其致病力恢復到自然系統(tǒng)中的真實狀態(tài):復壯后的昆蟲病原線蟲對大蠟螟的致病力是侵染4d后，死亡率為100%，與當初剛剛誘集分離得到時對大蠟螟的致病力一致；而未復壯的線蟲對大蠟螟的致病力是侵染4d后，死亡率為80.0%。
【具體實施方式】
[0015]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0016]實施例1
本發(fā)明的昆蟲病原線蟲復壯的方法步驟如下:
1.1試驗材料
供試線蟲:甘肅省土著昆蟲病原線蟲的優(yōu)勢種:Steinernema feltiae。
[0017]試驗所需器材:人工氣候箱、顯微鏡、解剖鏡、冷光源解剖鏡、智能冰箱、恒溫箱、微量移液槍、直徑60_培養(yǎng)皿、直徑90_培養(yǎng)皿、黑光燈、濾紙、小噴壺等。[0018]1.2試驗方法
1.應用大臘螟活體擴繁Steinernema feltiae線蟲,并收集其侵染期幼蟲；具體方法如下:在24孔板中，每孔裝2克細沙,然后每孔將200ii I Steinernema feltiae線蟲液(含約200頭抗逆性幼蟲)滴入孔中，每孔放入一頭末齡大蠟螟幼蟲，用封口膜密封24孔板，在25°C條件下培養(yǎng)24小時，然后將因昆蟲病原線蟲侵染死亡的大蠟螟幼蟲取出，放到鋪有一層干燥濾紙的培養(yǎng)皿中，在25°C條件下再培養(yǎng)72小時，然后將尸體放到線蟲收集盤中，待線蟲游出，每隔24小時收集一次線蟲，將收集的線蟲用無菌水沖洗三遍后，得到線蟲懸浮液，置于5~8°C冰箱中儲存?zhèn)溆谩?br>
[0019]2.確定一塊有Steinernema feltiae線蟲寄主昆蟲(如常見地下害蟲類:擠贈)分布，但無Steinernema feltiae線蟲分布的地塊，并將擴繁收集得到的線蟲懸浮液以10000頭/m2的濃度噴施到田間；此濃度便于線蟲寄生寄主昆蟲，并易于收集。
[0020]3.經(jīng)過三個月(線蟲可在自然環(huán)境中擴繁多代)后再在此地塊采集土樣并誘集Steinernema feltiae線蟲；具體方法如下:
①采集土樣:采取5點采樣法。即在某一地點，除去表層土，在10~20cm的土深處取土，樣品量至少200cm3,以便采取到足夠量的Steinernema feltiae線蟲。在每個地面2~4m2的范圍內(nèi)取5個點，將5點采的樣混合，裝入雙層塑料袋中。
[0021]②大臘螟誘集法誘集Steinernema feltiae線蟲:將室內(nèi)人工飼料飼養(yǎng)的10頭大蠟螟老熟幼蟲放入塑料瓶內(nèi)，然后分別裝入500g采集的土樣，在25°C的恒溫箱內(nèi)保持5~7天，期間每天翻倒塑料瓶，使大蠟螟在土中上下爬動，以充分接觸線蟲。放置2天后每天檢查大蠟螟幼蟲的死亡情況。將表現(xiàn)受線蟲侵染癥狀的死亡幼蟲單頭放入線蟲收集盤(培養(yǎng)皿)上收集Steinernema feltiae線蟲(培養(yǎng)皿里加入少量質(zhì)量百分濃度為0.1%的甲醒溶液，溶劑為無菌水，起保濕和消毒的作用)。7~10天后線蟲開始從大蠟螟尸體內(nèi)爬出，爬到大培養(yǎng)皿的無菌水甲醛溶液中，就可獲得侵染期線蟲的水懸液。每天將線蟲水懸液換入新的容器中，貼上品系名稱和日期標簽，放在5~8°C冰箱中保存?zhèn)溆?，再在大培養(yǎng)皿中重新加入適量的無菌水甲醛溶液。
[0022]4.將收集得到的線蟲懸浮液進行形態(tài)學、分子生物學鑒定，分離鑒定得到的昆蟲病原線蟲為 Steinernema feltiae。
[0023]5.保存于4°C的冰箱中，備用。
[0024]應用本發(fā)明的方法得到的昆蟲病原線蟲具有很好的致病力，具體試驗過程如下: 試驗在溫度為25°C，相對濕度為80%條件下的恒溫箱內(nèi)進行。在直徑為60mm的培養(yǎng)
皿中墊一層濾紙，加入適量的水，使濾紙保持濕潤。每個培養(yǎng)皿中加入50條應用本發(fā)明的方法獲得的線蟲，同時每培養(yǎng)皿放入大蠟螟老熟幼蟲一頭。每處理10頭供試幼蟲，3次重復。并將未復壯的線蟲作為對照試驗。每隔8小時檢查大蠟螟幼蟲的死亡情況并作記錄，比較復壯前后Steinernema feltiae線蟲對大臘螟的致病力，結(jié)果為:復壯后的Steinernemafeltiae線蟲對大蠟螟的致病力是侵染4d后，死亡率為100%，與當初剛剛誘集分離得到時對大蠟螟的致病力一致；而未復壯的線蟲對大蠟螟的致病力是侵染4d后，死亡率為80.0%。
[0025]實施例2
本實施例與實施例1的不同之處在于:步驟2中，將擴繁收集得到的線蟲懸浮液以12000頭/m2的濃度噴施到田間；其余步驟均與實施例1中相同。
[0026]實施例3
本實施例與實施例1的不同之處在于:步驟2中，將擴繁收集得到的線蟲懸浮液以15000頭/m2的濃度噴施到田間`；其余步驟均與實施例1中相同。
[0027]最后應說明的是:以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種昆蟲病原線蟲復壯的方法，其特征在于:步驟如下: (1)應用大蠟螟活體擴繁昆蟲病原線蟲，并收集其侵染期幼蟲，得到線蟲懸浮液； (2)確定一塊有昆蟲病原線蟲寄主昆蟲分布，但無昆蟲病原線蟲分布的地塊，將擴繁收集得到的線蟲懸浮液噴施到田間； (3)在上述地塊采集土樣，利用大蠟螟誘集線蟲，獲得復壯后的昆蟲病原線蟲。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述線蟲懸浮液以10000-15000頭/m2的濃度噴施。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述線蟲懸浮液以10000頭/m2的濃度噴施。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，經(jīng)過三個月后，在上述地塊采集土樣。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述采集土樣采取多點采樣法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述利用大蠟螟誘集線蟲是將大蠟螟老熟幼蟲放入瓶中，加入采集的土樣，使大蠟螟充分接觸昆蟲病原線蟲，將表現(xiàn)為受線蟲侵染癥狀的死亡大蠟螟老熟幼蟲單頭放入線蟲收集盤上收集昆蟲病原線蟲。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述使大蠟螟充分接觸昆蟲病原線蟲的方法是每天翻動瓶，使大蠟螟在土中上下爬動。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述 的 方法，其特征在于:所述線蟲收集盤里為質(zhì)量百分濃度為0.1%的甲醛溶液。
【文檔編號】A01M1/10GK103688907SQ201310663719
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】錢秀娟, 劉長仲, 孫小玲 申請人:甘肅農(nóng)業(yè)大學